Prevence alergie u dětí alergických matek perorálním osídlením probiotickým kmenem E. coli po narození

Transkript

1 Prevence alergie u dětí alergických matek perorálním osídlením probiotickým kmenem E. coli po narození Prevention of allergy in infants of allergic mothers by oral colonization with probiotic E. coli after birth 1 RAJA ŽÁDNÍKOVÁ, 2 LUDMILA PROKEŠOVÁ, 1 INGRID KOCOURKOVÁ, 2 JAN ŽIŽKA 1 Ústav pro péči o matku a dítě, Praha 2 Ústav Imunologie a mikrobiologie 1. LF UK Praha SOUHRN Perorální osídlení probiotickým kmenem E. coli (vakcina COLINFANT) dětí alergických matek po narození snížilo významně: 1) výskyt bakteriálních patogenů ve střevě, především druhů Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa a Staphyloccocus epidermidis. 2) výskyt klinických příznaků alergie u osídlené skupiny dětí alergických matek sledovaných do 3 let věku byla alergie prokázána pouze u jednoho dítěte, zatímco u kontrolních, neosídlených dětí byla alergie prokázána u l4 dětí (36 %, p < 0,001). První případy se u kontrolní skupiny vyskytly již ve věku 3 měsíců. 3) Hladiny IgE byly zvýšené u 83 % a 84 % skupin alergických matek, l6 % dětí osídlené skupiny a 8% dětí kontrolní skupiny alergických matek. 4) Ovlivnilo hladiny některých cytokinů (IL-4, IL-5, IL-6 a IL-l3). Hladiny těchto cytokinů u osídlených dětí alergických matek zůstaly podobné jako u zdravých matek, zatímco u kontrolních dětí alergických matek jejich hladiny mezi 2 3 rokem stoupaly. Ve studii bylo prokázáno, že osídlení probiotickým kmenem E. coli po narození je účinným preventivním opatřením u dětí alergických matek Klíčová slova: osídlení střeva, probiotický kmen, alergie, děti SUMMARY Oral colonization with a probiotic E.coli strain afer birth in infants of allergic mothers decreased significantly: 1) The number of bacterial pathogens in the intestine, particularly strains of Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella and Staphyloccocus epidermidis. 2) Incidence of clinical symptoms of allergy from the colonized group only 1 child suffered from alllergy, while in control infants of allergic mothers allergies appeared in l4 infants (36 %, p < 0.00l). 3) IgE levels were increased in 83 % and 84 % of allergic mothers, l6 % of infants of colonized and 8 % of control allergic mothers. 4) Levels of some cytokines ( IL-4, IL-5, IL-6 and IL-l3) equaled those of children from healthy mothers, but increased in infants of allergic control mothers between years 2-3. Targeted colonization of the intestine after birth with a probiotic E. coli strain may be a useful preventive measure in infants of allergic mothers. Key words: intestinal colonization, probiotics, prevention, allergy, infants Úvod V prvních hodinách po narození přichází dítě do styku s mikroorganimy vnějšího prostředí a povrchy jeho sliznic se osídlí bakteriální florou. Tento první kontakt s bakteriálními antigeny představuje mohutný podnět pro rozvoj imunitních mechanizmů, zároveň však znamená potenciální nebezpečí pro vznik infekce. Fyziologická střevní flora je důležitým modulátorem lokálních i celkových imunitních reakcí (5, 6). U dětí trpících alergií i u dětí které onemocněly teprve později, byly zjištěny alterace ve složení střevní mikroflory (9, 19). Výsledky studií u zvířat vedou k hypotéze, že specifické kmeny střevní mikroflory podporují ochranu hostitele proti senzibilizaci a vzniku alergie (11). Pokud je dítě kojené, je modulace lokální vrozené i adaptivní imunitní odpovědi v průběhu osídlování výrazně ovlivněna přítomností receptoru CDl4 v mateřském mléce. Hladiny CD l4 byly snížené u dětí s atopií (23). Městecký prokázal určitý typ lokální IgA odpovědi, 183

2 která umožňuje přetrvávání rezidentních bakteriálních kmenů a zvyšuje imunitní odpověď střevních lymfatik (18). U nekojených dětí je střevní flora pestřejší, objevují se různé druhy enterobakterií a bifidové flory ubývá. Podobně je tomu při déledobé hospitalizaci. Ontogeneze alergické slizniční odpovědi není dosud plně objasněna. Je ovlivněna: 1) kojením, 2) aktivací dendritických buněk, které představují primární antigen prezentující buňky a 3) determinující úlohou cytokinů. Fetální Th2 cytokiny u zdravých dětí v průběhu prvního roku života rychle klesají, avšak u alergických dětí jejich hladina stoupá (8, 17). Nahrazení přirozeného, avšak náhodného osídlení střevního traktu cíleným perorálním osídlením probiotickými bakteriálními kmeny kmeny bylo popsáno četnými autory. K osídlování byly používány především laktobacily a bifidobakterie které nevyvolávaly vedlejší nepříznivé účinky, avšak jejich působení bylo krátkodobé, neboť po skončeném podávání ze střeva rychle vymizely (10, 21, 22). Některé studie uvádějí výsledky cíleného osídlení střeva nepatogenními kmeny E. coli (4,13). Perorální osídlení po narození snižovalo výskyt nosokomiálních infekcí, výskyt rezistentních bakteriálních kmenů a osídlení patogenními kmeny (12). Isolauri aj. připisují mechanizmus působení probiotických bakterií: 1) posílení neimunologické střevní bariéry úpravou mikroekologie, normalizací, event. zvýšené permeability; 2) zvýšení imunologické střevní bariery (zvýšení siga odpovědi zvýšení aktivity makrofágů a T buněk), kontrole rovnováhy tvorby pro a proti zánětlivých cytokinů; 3) specifické kompetici o receptory střevní sliznice a jejich obsazení; 4) zmírnění zánětlivé odpovědi ve střevě (7). V našich předchozích studiích jsme prokázali že perorálně podaný probiotický kmen E. coli přetrvával ve stolici sledovaných dětí v naprosté převaze řadu měsíců a zústával kmenem dominantním. Přítomnost kmene ve stolici stimulovala lokální i celkovou imunitní odpověď (14), snižovala přítomnost bakteriálních patogenů ve střevě i na jiných sliznicích, snižovala výskyt nosokomiálních infekcí a výskyt alergií v pozdějším věku po 10 a 20 letech (15). Tyto mimořádné vlastnosti kmene E. coli byly využívány v klinické praxi, především pro prevenci nosokomiálních infekcí u rizikových dětí (16). V současné studii jsme sledovali vliv osídlení dětí alergických matek po narození probiotickým kmenem E. coli (vakcínou COLINFANT) na: a) počet patogenů ve střevě; b) výskyt alergií v průběhu prvních 3 let života; c) hladiny cytokinů IL-4, 5, 6, 10, l3, IFN- gama, TGF- beta, hladiny immunoglobulinů IgG,IgM a IgA v séru a siga v mléce a filtrátech stolice. Cílem studie bylo snížit výskyt alergií u dětí alergických matek. Sledované skupiny a metody V randomizované studii bylo sledováno l58 donošených dětí. 1) osídlené děti alergických matek, AO (n = 56), 2) kontrolní děti alergických matek, AK (n = 57), 3) kontrolní děti zdravých matek, NK (n = 45). Vakcina COLINFANT, patentovaná a registrovaná v ČR, obsahující 5 x 10 9 lyofilizovaných mikrobů kmene E. coli/1ml byla podávána dětem první skupiny, per os do 48 hodin po narození a dále 3 týdně po 4 týdny. Kritéria pro zařazení matek do studie a) klinické projevy alergie trvající déle než 24 měsíců; b) sledování v alergologické poradně (písemná zpráva); c) pozitivní kožní testy a zvýšené hodnoty IgE; d) příznivá reakce na protialergickou léčbu. Odběry vzorků: krev matky, pupečníková krev, žilní krev dítěte a l g stolice v intervalech 4. den, 3 měsíce, 6 měsíců, 1, 2 a 3 roky věku, kolostrum a mateřské mléko po dobu kojení. Vzorky séra, filtrátů stolice a mateřského mléka (po odstranění tuku) byly uchovávány při -20 C do doby zpracování. Příprava filtrátů stolice: l g stolice suspendován v l ml PBS, přidán l mm inhibitoru proteázy, cenrifugace při 8000 g, supernatant použit pro vyšetření. Sledované parametry: mikrobiologické vyšetření stolice (přítomnost vakcinového kmene E. coli potvrzena aglutinací se specifickým králíčím antiserem), hladiny cytokinů (IL-4, 5, 6, l0, l3, IFN-gama, TGF beta), hladiny sérových immunoglobulinů stanoveny metodou ELISA (20), celkové siga v kolostru,mléce a filtrátech stolice radiální imunodifuzí s použitím kitů Binding Site. Statistické hodnocení: výskyt alergie ve sledovaných časových intervalech byl srovnáván mezi sledovanými skupinami použitím analyzy podle Kaplan Meiera a Mantel-Haenszelovým testem. Po adjustaci k rozdílům mezi kovariálními vlivy Coxovým proporcionálním modelem (3). Rozdíly v hodnotách cytokinů mezi skupinami byly porovnávány Mann-Whitneovým U testem a rozdíly ve výskytu patogenů Fišerovým testem Hladina významnosti pro všechny testy byla alfa = 0,05. Výsledky jsou vyjádřeny v mediánech. Výsledky: V délce kojení nebyly zjištěny významné rozdíly mezi sledovanými skupinami. Průměrná délka kojení byla 28, 28 a 31 týdnů (tab. 1). Přítomnost vakcinového kmene E. coli u osídlených dětí ve sledovaném období byla prokázána od 3. dne u 74 % 41 % ve 3 letech (tab. 2). Výskyt klinických projevů alergie do 3 let byl významně snížen u osídlené skupiny (1 dítě, 6.6 %), zatímco ve Tab. 1: Délka doby kojení u sledovaných skupin dětí skupina Týdny < NK 13,3 % (45) 11,1 % (45) 6,7 % (45) 33,3 % (39) 64,3 % (28) AK 6,9 % (57) 10,5 % (57) 26,3 % (57) 41,9 % (43) 53,6 % (28) A0 0,0 % (56) 10,7 % (56) 26,8 % (56) 32,0 % (50) 61,3 % (31) NK = děti zdravých matek, AK = kontrolní děti alergických matek, A0 = osídlené děti alergických matek 184

3 Tab. 2: Průkaz vakcinového kmene u osídlených dětí 3 dny 3 měs 6 měs 1 rok 2 roky 3 roky n = 56 n = 55 n = 49 n = 31 n =17 n = 12 O83+ 7 (12 %) 34 (62 %) 27 (55,1 %) 17 (54,8 %) 6 (35,3 %) 2 (16,7 %) O83 35 (62 %) 13 (24 %) 7 (14,3 %) 5 (16,1 %) 3 (17,6 %) 3 (25,0 %) Celkem 74,0 % 86,0 % 69,4 % 70,9 % 52,9 % 41,7 % O83+ vakcinový kmen + jiné kmeny E. coli, 083 pouze vakcinový kmen E. coli. Tab. 3: Výskyt alergie v průběhu sledování (procenta a celkový počet dětí) Skupina měsíce NK 6,6 % (45) 7,1 % (42) 7,1 % (42) 21,4 % (14) 21 % (14) AK 14,0 % (57)* 20,0 % (50)** 16,0% (38) 33,0 % (15)* 36,0 % (14)** AO 1,8 % (56) 2,0 % (51) 2,9 % (35) 5,9 % (17) 6,6 % (15) Významné rozdíly ve srovnání s A0 skupinou jsou vyjádřeny *, **, *** (hladina významnosti 0.05, 0,01, 0,001) Tab. 4: Výskyt patogenů ve stolici Typ patogenu Pseudo Staph Klebs Součet patogenů Skup. 3 dny 3 měsíce 6 měsíců 1 rok % n % n % n % n NK 31** AK AO NK AK 31*** AO NK 22 * *** AK 20 * ** AO NK 63 *** *** AK 61 *** ** AO * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 Významné rozdíly ve srovnání s AO skupinou Pseudo Psedomonas aeruginosa, Staph Staphylococus epidermidis, Klebs Klebsiella. skupině kontrolních dětí alergických matek mělo alergii 14 dětí (36 %) (p < 0.001), a ve skupině dětí zdravých matek 3 děti (21 %) (tab 3). Výsledky Mantel-Haenszelova dlouhodobého testu přitom předpokládaly 8,6 případů alergie v osídlené skupině a 6,4 případů v kontrolní skupině dětí alergických matek. Též pravděpodobnost že se nevyskytne alergie zůstávala celou dobu sledování nejvyšší v osídlené skupině dětí alergických matek a byla vyšší i ve srovnání s kontrolní skupinou dětí zdravých matek (graf 1) Mikrobiologické vyšetření stolice osídlení vakcínou COLINFANT ovlivnilo výskyt patogenních a potencionálně patogenních mikrobů, sledováný rutinními kultivačními metodami. Třetí den byl výskyt Pseudomonas earuginosa prokázán u 6 % dětí osídlené skupiny, l3 % dětí alergických a 31 % dětí zdravých kontrolních matek (p < 0,01) Kmeny Klebsiel byly prokázány u 4 % osídlených dětí avšak u 19 % a 20 % dětí kontrolních skupin Kontrolní d ti nealergických matek (NK) Kontrolní d ti alergických matek (AK) Osídlené d ti alergických matek (AO) Doba sledování (roky) Graf 1: Pravděpodobnost vývoje alergie 185

4 Tab. 5a: Pupečníková krev a sérum Pupečníková krev Sérum 3 dny NK AK AO NK AK AO IL4 132 ** *** ,5 IL5 86,5 *** *** 108 ** 201 IL6 63, , ** 81,5 IL10 141* , IgM 35,5 ** , Tab. 5b: Stolice a mléko Stolice 3. den Mléko 3 den NK AK AO NK AK AO IL4 154* * IL5 97 ** 140, *** 126* 176 IL ** ,5 TGF - β 581 ** siga Tab. 5c: Serum Sérum 3 měsíce 6 měsíců 1 rok NK AK AO AK AK AO NK AK AO IL4 88 *** ,5 83 *** 149 * 198 IL * 156 ** * 87 * 46 IL ,5 1640, ,5 496 * 1601, IFN - γ ,5 319,5 87 * TGF - β ,5 * IgA 22 *** 19 *** *** *** 37,5 *** 230,5 IgG 133,5 *** 140 *** 354 *** 306,5 *** *** 160 *** 1054,5 IgM 239 * 184 ** , , ,5 Tab. 5d: Filtráty stolice 3 měsíce 6 měsíců 1 rok NK AK AO NK AK AO NK AK AO IL4 78 *** ,5 86 ** ,5 IL , , IL * 89 69,5 80,5 145** 51 IFN - ă * 511,5 321,5 112,5* ** ,5 TGF - â , (p < 0,020). Též Staphyloccocus epidermidis byl prokázán u 6 % osídlených a 19 % a 3l % dětí kontrolních (p < 0,002). Ve 3 měsících zůstávaly stále významné rozdíly ve výskytu kmenů Klebsiella 5 % u osídlených, 45 % a 24 % u kontrolních dětí zdravých a alergických matek (p < 0,00l ). Ve věku 6 měsíců a l roku nebyly již rozdíly mezi skupinami významné (tab. 4). Cytokiny - hladiny cytokinů v mléce alergických matek byly vyšší než u nealergických matek též hladiny cytokinů v seru a filtrátech stolice dětí byly vyšší po dobu kojení. Osídlení střeva probiotickým kmenem E. coli u dětí alergických matek ovlivnilo hodnoty IL-4, IL-5, IL-6 a IL- Continuation Serum 2 roky 3 roky NK AK AO AK AO IL4 80, , IL ** 123 IL ** 51 IL ** 159 IL * * 1121 IgG 292 *** 267 ***

5 Stolice 2 roky 3 roky NK AK AO AK AO IL4 33, * 42 IL5 194,5 437 ** IL6 39, * 31 IL13 372, * 769 IFN - γ 231,5 35 ** 79, TGF - β 1237, * 809 l3. Hladiny těchto cytokinů byly obdobné jako u dětí zdravých matek, zatímco u kontrolních dětí alergických matek hladiny uvedených cytokinů mezi 2 3 rokem výrazně stoupaly. Hodnoty sérového IgA byly významně nižží u kontrolních dětí alergických matek než u osídlených dětí alergických matek ve věku 3,6 a l2 měsíců (p < 0,01) u osídlených dětí byly hladiny IgA podobné nebo vyšší než u dětí zdravých matek. Rozdíly v hladinách siga v mléce a filtrátech stolice mezi skupinami se významně nelišily. Významné rozdíly mezi skupinami jsou uvedeny v tab. 5 a, b, c, d. Hladiny sérového IgE byly u alergických matek v obou skupinách zvýšené u 84 % a 83 %, převážně v rastové skupině II, III, IV. U dětí byly hodnoty IgE zvýšené u l6 % osídlených dětí a 8 % dětí kontrolních alergických matek, ve všech případech v první rastové skupině. Diskuse Mechanismus odpovídající za příznivý vliv osídlení nepatogenními kmeny E.coli není dosud plně objasněn. Předpokládaný mechanismus interference, který brání adhezi jiných mikrobů včetně patogenních, je podpořen průkazem přítomnosti t1 fimbrií. Je-li kmen podán po narození, zůstává v kvantitativní převaze, což mu přináší různé výhody např. při nutritivní kompetici. Mechanismus je jistě komplexní. V posledním desetiletí dochází k významným změnám ve složení střevní mikroflory, zvláště v zemích s vysokou úrovní hygieny, jako je Švédsko nebo USA ubývá enterobakterií a počínají převládat stafylokoky. V rozvojových zemích jsou děti do 3. dne života osídleny kmeny E. coli a jinými enterobakteriemi. Pozdější osídlení kmeny enterobakterií snižuje expozici imunitního systému působení lipopolysacharidů, stimulujících jeho zrání a schopnost rozlišovat škodlivé a neškodné antigeny (např. potravinové) a má rozhodující vliv na vývoj tolerance. Stoupající vývoj alergií v rozvinutých zemích je dáván do souvislosti se změnami střevní flory (9). V současné studii byly do 3 let věku zjištěny klinické příznaky alergie pouze u jednoho osídleného dítěte alergické matky. Z neznámých důvodů však nebyla u tohoto dítěte prokázána přítomnost vakcinového kmene E. coli ani po opakovaném podávání. V kontrolní skupině dětí alergických matek mělo do 3 let věku alergii 36 % dětí. Rozdíl je tedy vysoce významný (p < 0,001). Hodnoty IgE v séru dětí neodpovídaly zcela výskytu klinických příznaků především u osídlené skupiny (zvýšené IgE u 8 dětí (16 %), klinické příznaky u l dítěte, u kterého však zvýšené IgE prokázáno nebylo). Celkový počet dětí v průběhu studie klesal, neboť některé děti nedosáhly ještě 3 let věku jejich sledování dále pokračuje. V průběhu prvního roku života (především do 3 měsíců) byly počty patogenů ve stolici osídlených dětí významně nižší než u obou kontrolních skupin, a to kmeny Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa a Staphyloccocus epidemidis tj. patogenů v prvních měsících života velmi nebezpečných. Hodnoty cytokinů v mateřském mléce alergických matek a v séru jejich dětí sledovala řada autorů (2). Předložené výsledky jsou unikátní v komplexním pojetí jsou sledovány cytokiny v mateřském mléce, séru matek, séru dětí a ve filtrátech stolice v průběhu prvních tří let života. Rozdíly v hladinách IL-4 a IL-l3 zjištěné mezi zdravými a alergickými skupinami potvrzují úlohu těchto cytokinů pro vznik alergických reakcí (1). Zvýšené hodnoty IL-4 v časném období života potvrzují zvýšení typu Th2 odpovědi a mohly by být prognostickým ukazatelem pozdějšího vzniku alergie. Cytokiny IL-5 a IL-6, které jsou v přímém vztahu k tvorbě IgA, byly u osídlených dětí alergických matek podobné hodnotám zjištěným u dětí zdravých matek. Kontrolní děti alergických matek měly významně zvýšené hladiny IL.-5 a IL-6 v séru ve 3 letech a ve filtrátech stolice v 1 roce a ve 3 letech. Zvýšené hladiny IgA v séru osídlených dětí s možností zkřížených reakcí by mohly mít ochranný vliv proti enterálním infekcím. Tab. 5e: Mateřské mléko Mléko 3 měsíce 6 měsíců 1 rok NK AK AO NK AK AO NK AK AO IL4 82 *** *** 159, , IL ,5 * IL * , IFN - γ 85 * 225, * 135 * 395, ,5 122 p < 0,05, < 0,01 < 0,001 *, **, *** 187

6 Závěry 1) Po perorálním podávání probiotického kmene E. coli (vakcina COLINFANT) po narození se kmen rychle uchytil a zůstával ve střevě po celou dobu tříletého sledování kmenem dominantním. 2) Preventivní osídlení po narození snížilo výskyt patogenů a potenciálních patogenů ve střevě osídlených dětí. 3) Osídlení probiotickým kmenem E. coli ovlivnilo hladiny některých cytokinů. 4) Osídlení probiotickým kmenem E. coli snížilo významně výskyt klinických příznaků alergie u dětí alergických matek. 5) Nahrazení přirozeného, avšak náhodného osídlení střeva cíleným osídlením probiotickým kmenem E. coli s výhodnými vlastnostmi po narození je účinným preventivním opatřením u dětí alergických matek. Studie byla schválena etickou komisí Ministerstva zdravotnictví a probíhala v rámci grantu č. NI 7525/3, a s informovaným souhlasem matek. MUDr. Raja Žádníková Ústav pro péči o matku a dítě Podolské nábřeží l l0 Praha 4 Podolí LITERATURA 1. Borres MP. Peripheral blood eosinophils and IL-4 in infancy in relation to the appearance of allergic disease during the first 6 years of life. Pediatr Allergy Immunol 1995: l5: 2l Bottcher MF, Jenmalm MC, Garofalo RP, Bjorksten B. Cytokines in breast-milk from allergic and nonallergic mothers. Pediatr Res 2000: 47 (1): Cox DR. Regression models and life-tables (with discussion). Journal of the Royal Statistical Society, Series B: Methodological 1972: 34: Cukrowská B, Lodinova-Žádníková R, Enders C, Sonnenborn U, Schulze J, Tlaskalová-Hogenová H. Specific proliferative and antibody response of premature infants to intestinal colonization with non-pathogenic probiotic E.coli strain Nissle Scand J Immunol 2002: 55: Fanaro S., Chierici R, Guerini P, Vigi V. Intestinal microflora in early infancy: composition and development. Acta Paediatr 2003: suppl 441: Isolauri E, Grönlund MM, Salminen S, Arvilommi H.. Why don t we bud? J Pediatr Gastroent 2000: 30: Isolauri E, Stas Y, Kankaanpää P, Arvilommi H, Salminen S. Probiotics: effects of immunity. Am J Clin Nutr 2001: 73 (suppl): 444S-450S. 8. Jones CA, Holloway JA, Warner JO. Does atopic disease start in foetal life? Allergy 2000: 55: Kalliomaki M, Isolauri E, Role of intestinal flora in the development of allergy. Curr 0pin Allergy clin Immunol 2003 (1): Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Koro L, Isolauri E. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomized placebo-controlled trial. Lancet 2000: 357: Kirjavainem P, Gibbon GR. Healthy gut microflora and allergy: factors influencing development of the microdota. Ann Med l999: 3l (4): Lari AR, Gold F, Borderon JC, Laugier J, Lafont P. Implantation and in vivo antagonistic effects of antibiotic-susceptible Escherichia coli strains administered to premature newborns. Biol Neonate 1990: 58: Lodinova-Žádníková R, Sonnenborn U. Effect of preventive administration of a nonpathogenic Escherichia coli strain on the colonization of the intestine with microbial pathogens in newborn infants. Biol Neonate 1997: 71: Lodinova-Žádníková R, Slavíková M, Tlaskalová-Hogenová H, Adlerberth I, Hanson LA, Wold A, et al. The antibody response in breast-fed and non-breast-fed infants after artificial colonization of the intestine with E.coli 083. Pediatr Res 1991: 29: Lodinova-Žádníková R, Cukrowská B, Tlaskalová-Hogenová, H. Oral administration of probiotic Escherichia coli after birth reduces frequency of allergies and repeated infections later in life (after 10 and 20 years). Int Arch Allergy Immunol 2003: 131: Lodinova-Žádníková R, Tlaskalová H, Korych B, Bartáková Z. The antibody response in infants after oral administration of inactivated and living E.coli vaccines and their protective effect against nosocomial infections. In: Mestecky J, ed Adv Mucosal Immunol Plenum Press, New York 1995: pp Macaubas C, de Klerk NH, Holt BJ, Wee C, Kendall G, Firth M, Sly PD, Holt PG. Association between antenatal cytokine production and the development of atopy and asthma at age 6 years. Lancet 2003: 362: Mestecky J, Russel MV, Elson CO. Intestinal IgA: novel views on its function in the defence of the largest mucosal surface. Gut 1999: 44: Noverr MC, Huffnagle GB. The microflora hypothesis of allergic diseases. Clin Exp Allergy 2005: 35 (12): Prokešová L, Lodinová-Žádníková R, Žižka J, Kocourková I, Novotná 0, Petrásková P, Šterzl I. Cytokine levels in healthy and allergic mothers and their chidren during the first year of life. Pediatr Allergy Immunol 2006:17:l75-l Rautava S, Kalliomaki M, Isolauri E. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infant. J Allergy Clin Immunol 2002: 109: Rautava S, Kalliomaki M, Isolauri E. New therapeutic strategy for combinating the increasing burden of allergic diseases: Probiotics Nutrition, Allergy, Mucosal Immunology and Intestinal Microbiota (NAMI) Research Group report. Allergy Clin Immunol 2005: 116 (1): Zdolsek HA, Jenmalm MC. Reduced levels of soluble CD14 in atopic children. Clin Exp Allergy 2004, 34(4):