Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

Transkript

1 Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky

2 ANTIGEN (Ag) specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab antibody) molekula bílkoviny vážící specificky daný antigen EPITOP specifická část molekuly antigenu reagující a vážící se na protilátku HAPTEN většinou nízkomolekulární látka schopna vyvolat imunitní reakci tj. vazby na protilátku ale pouze po vazbě na větší molekulu (většinou protein) AGLUTINACE srážení antigenu specifickou protilátkou

3 Antigeny částice jiné buňky, baktérie, viry molekuly individuální bílkoviny, směsi bílkovin (např. krevního séra), části bílkovin peptidy kusy tkání, orgánů, membrán Ne všechny protilátky mohou reagovat se svým antigenem

4 Protilátky bílkoviny základní tvar molekuly - Y dva těžké a dva lehké řetězce disulfidické můstky variabilní část imunoglobulíny pět tříd: IgA, IgG, IgD, IgE, a IgM

5 Vazba antigenu a protilátky Nevazebné interakce - vodíkové můstky - iontové interakce - van der Waalsovy síly - dipol-dipol Interakce mezi antigenem a protilátkou závisí na ph, iontové síle a přítomnosti dalších látek např. detergentů, chaotropních činidel

6 Více protilátek reagujících s jednou částicí Precipitace

7 Vizualizace Precipitace protilátky s antigenem Značená primární protilátka (reaguje s antigenem) Značená sekundární protilátka (váže se na primární protilátku) Značený antigen Značení protilátek (antigemnů) enzymatická barevná reakce fluorescence chemilumiciscence radioizotopové značení

8 Aglutinace - precipitace

9 Přímé značení značená primární protilátka Nepřímé značení primární protilátka neznačena, značku nese sekundární protilátka - druhově specifická vůči primární protilátce Značená primární protilátka Značená sekundární protilátka

10 Příprava protilátek Imunizace, očkování odezva imunitního systému na přítomnost antigenu Hostitel - myši, králíci, kozy, prasata, koně Adjuvantní látky

11 Jedna nebo více dávek antigenu maximum IgM asi po týdnu, IgG asi po třech týdnech

12 Krevní sérum s protilátkou odběr krve z ucha malé množství, malé zvíře ze žíly větší zvířata (více antiséra) vykrvení zabití a získání veškeré krve sražení krve centrifugace získání krevního séra izolace protilátek a jejich přečištění (srážení, chromatografie

13 Imunodetekce detekce přítomnosti antigenu nebo protilátky Sérologické metody Imunoprecipitace ELISA Imunoblotování

14 Imunodetekce Volně v roztoku - sérologické metody Detekce protilátek - pomocí precipitace s příslušným antigenem (Salmonela, Listerie,...) Detekce mikroorganismů pomocí předem připravených protilátek (Salmonela, Streptokoky, Stafylokoky,...) Detekce antigenů vylučovaných mikroorganismy pomocí předem připravených protilátek (Streptokoky zápal plic, Haemophillus influenzae meningitida,...) Krevní skupiny průkaz krevních skupin reakcí protilátek s antigeny na červených krvinkách

15

16 Krevní skupiny Na povrchu erytrocytů - červených krvinek se vyskytují aglutinogeny speciální antigeny určující krevní skupiny Na jejich základě určujeme čtyři základní krevní skupiny: A, B, AB a 0 V krvi se také vyskytují protilátky proti cizím krevním skupinám (aglutinogenům)

17 Antigeny na povrchu erytrocytů - aglutinogeny A a B (aglutinogen aglutinace krve) Skupina A tvoří aglutinogen A Skupina B tvoří aglutinogen B Skupina AB tvoří oba aglutinogeny Skupina 0 netvoří ani jeden z aglutinogenů A a B (tvoří typ H, prekurzor A a B)

18 Protilátky tvořené v krvi aglutiny anti-a a anti-b Skupina A tvoří aglutinin anti-b Skupina B tvoří aglutinin anti-a Skupina AB netvoří žádný aglutinin Skupina 0 tvoří oba aglutininy anti-a i anti-b

19 Aglutinace zjišťování krevní skupiny

20

21 Imunodetekce Imunoprecipitace v gelech V agarózovém gelu Možnost použít více protilátek v jednom experimentu Možnost detekce více antigenů v jednom experimentu Kombinace s elektroforézou Kvantifikace

22

23 Reakce králičích protilátek proti lidskému séru s různými séry z: člověka (Ho), krávy (Bo), koně (Eq), kočky (Fe), kozy (Cap), ovce (Ov), mýši (Mu), psa (Ca), králíka (Ra), prasete (Su)

24 Kvantifikace antigenu Kalibrační křivka Protilátka je přítomna v agarózovém gelu, do jamek je přidáno známé množství antigenu.

25 Imunoelektroforéza Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku, imunodifuzí a precipitací.

26 Imunoelektroforéza Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku, imunodifuzí a precipitací.

27 Rocket imunoelectroforéza Kvantitativní metoda Agarózový gel s příslušnou protilátkou, ph přibližně 8.6 protilátky se nepohybují Elektroforéza proteinů (antigenů) o známé koncentraci a neznámých vzorků

28

29 Imunodetekce Metody ELISA

30 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Barevná reakce protilátky a antigenu

31 Využívá vlastnosti biologických makromolekul pevně se vázat na některé polymery (polystyrén...)

32 ELISA metody lze dělit podle řady kritérií Stanovení antigenu (Přímá ELISA) Stanovení specifických protilátek (Nepřímá ELISA) Normální vazba přímo na povrch jamky Sendvičová vazba přes zprostředkovatele

33 Pevná fáze s navázaným antigenem

34 Pevná fáze s navázanou protilátkou

35 Vizualizace značená primární protilátka (reaguje s antigenem) značená sekundární protilátka (váže se na primární protilátku) značený antigen enzymatická barevná reakce fluorescence chemilumiciscence radioizotopové značení Značení

36

37 Western blotting Imunologická detekce bílkovin separovaných pomocí ELFO

38 Přenos proteinů na membránu elektroforetický přenos pasivní přenos difuzí Výběr membrány: PVDF, nitrocelulosa, radioaktivní a neradioaktivní detekce, glykoproteiny, druhá detekce, screening exprese

39 Přenesení proteinů Vizualizace proteinů Blokace volných vazebných míst na membráně Navázání primární specifické protilátky Navázání značené protilátky specifické proti primární protilátce

40 Vizualizace sekundární protilátkou Barevná reakce Chemiluminiscence Fluorescence Radioaktivní detekce

41

42 Imunoafinitní preparace Využití specifické vazby antigenu a protilátky při jejich izolaci a přečištění Izolace přímo z roztoku precipitací Izolace z roztoku pomocí antigenu nebo protilátky navázané na specifické částice nebo molekuly (protein A, magnetická separace) Imunoafinitní chromatografie

43 Směsný vzorek před čištěním Aplikace specifických protilátek Oddělení protilátek s navázaným antigenem

44 Využití vazby protilátky (nebo antigenu) na částice se specifickým vazebným místem

45 Příklad využití částic při magnetické separaci Magnetická částice s navázanou protilátkou Reakce protilátek s antigenem Separace částic pomocí magnetu

46