Identifikace geneticky modifikovaných organismů (GMO) v plodinách pro výrobu potravin a potravinách

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Identifikace geneticky modifikovaných organismů (GMO) v plodinách pro výrobu potravin a potravinách Disertační práce Vedoucí práce: Prof. Ing. Oldřich Chloupek, DrSc. Vypracovala: Ing. Veronika Kýrová Brno 2011

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma IDENTIFIKACE GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ORGANISMŮ (GMO) V PLODINÁCH PRO VÝROBU POTRAVIN A POTRAVINÁCH vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis doktoranda

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji prof. Ing. Oldřichu Chloupkovi, DrSc. za cenné rady, připomínky a odborné vedení, které mi poskytl při vypracování této disertační práce. Současně bych ráda poděkovala doc. MVDr. Jiřímu Ruprichovi, CSc. a doc. MVDr. Vladimíru Ostrýmu, CSc. ze Státního zdravotního ústavu (SZÚ) v Brně za poskytnutý materiál, podklady, přístrojové vybavení a cenné rady pro zpracování disertační práce. Zpracovaná disertační práce byla finančně podpořena z prostředků projektu MŽP/750/33/GMO/08 o zabezpečení uchovávání vzorků a ověřování metodik detekce geneticky modifikovaných organismů provedeného na SZÚ v Brně. Dále bych ráda poděkovala svému manželovi za podporu a tvorbu potřebného zázemí při studiu a zpracování této práce.

4 ABSTRAKT Téma disertační práce je Identifikace geneticky modifikovaných organismů (GMO) v plodinách pro výrobu potravin a v potravinách. Cílem práce byla diagnostika schválených a neschválených geneticky modifikovaných organismů (GMO) ve vybraných zemědělských plodinách a potravinách rostlinného původu. Jednalo se o plodiny a potraviny na bázi sóji a kukuřice, dále to byly rajčata, brambory, rýže a papája. Vzorky byly analyzovány v letech na Státním zdravotním ústavu Centru zdraví, výživy a potravin v Brně. K diagnostice byly využity metody kvalitativní a kvantitativní polymerázové řetězové reakce (PCR) a imunochemická metoda ELISA. Byl také hodnocen vliv zpracování a použité extrakční metody pro následnou amplifikaci, zejména u brambor, rýže, papáji, kukuřičné mouky a sójových výrobků. Celkem bylo zpracováno 792 vzorků potravin a rostlinného materiálu. 46 vyšetřených vzorků (kukuřice, vzorky na bázi sóji) bylo vyrobeno nebo obsahovalo GMO. Roundup Ready sója (RRS) byla přítomna ve 24 vzorcích (3%), dále hybrid kukuřice MON 810 v 10 vzorcích (1,3%), Bt 176 ve čtyřech vzorcích (0,5%), StarLink v jednom vzorku (0,1%) a NK 603 ve dvou vzorcích (0,2%). Kromě těchto GMO byla také detekována genetická modifikace (GM) u pěti (0,6%) vzorků rýže. Žádná GM nebyla zjištěna u vzorků čerstvé papáji a rajčat. Vliv zpracování na amplifikaci byl prokázán u vzorků předvařené rýže a papáji (sušená, kandovaná a konzervovaná), kde nebylo možné metodou PCR prokázat přítomnost transgenu. U 13 vzorků brambor nebyl prokázán vliv kulinárních úprav na detekci transgenu. Použitá PCR metoda byla vhodná pro identifikaci genetické modifikace i u kulinárně upravených brambor. Klíčová slova: GMO, výskyt, Česká republika, sója, rýže, rajče, kukuřice, brambory, papája, PCR, ELISA

5 ABSTRACT The topic of my dissertation was Identification of genetically modified organisms in crops for food production and in foods. The aim was the detection and identification of approved and non-approved genetically modified organisms (GMOs) in some agricultural crops and foodstuffs. The food which was evaluated in National Institute of Public Health in Brno during the years of include soybean and soybean products, maize and maize flour, tomato, rice, potato and papaya. Qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR)-based methods and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used for the detection of GMOs. Impact of processing on DNA amplification, mainly in potatoes, rice, papaya, maize flour and soybean products was also evaluated. A total of 792 samples of foodstuffs (maize flour, soybean products, tomato, rice, papaya) and agricultural products (maize, potato) were analyzed. 46 samples (maize, soybean and soybean products) contained GMOs. Roundup Ready soybean (RRS) was detected in 24 samples (3%), maize line MON 810 in 10 samples (1.3%), Bt 176 in four samples (0.5%), Star Link in one sample (0.1%) and NK 603 in two samples (0.2%). GM rice was detected in five (0.6%) samples. All investigated samples of tomato and raw papaya were negative for GMOs. The impact of processing on DNA amplification was proved in samples of parboiled rice and papaya. The recombinant DNA was detected in all samples of potato (raw tubers and after culinary processing). The PCR method was suitable for the detection of transgenic potato in processed food. The recombinant DNA was detected in all samples of potato (raw and after processing. Keywords: GMO, food, PCR, ELISA, soybean, rice, tomato, maize, potato, papaya, Czech republic

6 OBSAH 1 ÚVOD.8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED Charakteristika geneticky modifikovaných organismů Situace v ČR a ve světě Rizika GMO a jejich vnímání veřejností Geneticky modifikované vyšší rostliny Geneticky modifikovaná sója Geneticky modifikovaná kukuřice Geneticky modifikovaný brambor Geneticky modifikované rajče Geneticky modifikovaná rýže Geneticky modifikovaná papája Metody využívané pro detekci GMO Metody založené na detekci nukleových kyselin Metody založené na detekci proteinu Ostatní techniky pro detekci GMO Chromatografie Infračervená spektroskopie Kontrola kvality detekce CÍL PRÁCE.35 4 MATERIÁL A METODY Materiál Extrakce a izolace DNA Polymerázová řetězová reakce Kvalitativní PCR Sója a sójové výrobky Kukuřice a kukuřičné výrobky Rýže.43

7 Rajčata Papája Brambor Kvantitativní PCR Imunochemické metody ELISA.46 5 VÝSLEDKY A DISKUSE Vliv zpracování na amplifikaci DNA Detekce Roundup Ready sóji Detekce GM kukuřice Detekce GM rajčat Detekce GM papáji Detekce GM rýže Detekce GM brambor 59 6 ZÁVĚR 62 7 LITERATURA 66 8 SEZNAM ZKRATEK 9 SEZNAM TABULEK 10 SEZNAM OBRÁZKŮ

8 1 ÚVOD V posledních desetiletích došlo k rozvoji genového inženýrství, což umožnilo vývoj geneticky modifikovaných organismů. Geneticky modifikované organismy (GMO) jsou organismy do nichž byl vnesen gen (geny) z nepříbuzného organismu kromě člověka, jejichž dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací. První GMO byly použity pro produkci léků. Organismy takto vytvořené mají geny kódující nové vlastnosti, např. toleranci k herbicidům, rezistenci k hmyzím škůdcům, zpomalené dozrávání nebo sterilitu potomstva. Transgenóze začala také postupně pronikat do šlechtění rostlin, jako výsledek zavádění moderních biotechnologických metod. Přenos genů provádí šlechtitel, aby získal odrůdu s určitou vlastností, kterou nelze získat konvenčním šlechtěním. První geneticky modifikovanou potravinou bylo rajče, u něhož se genetickou modifikací utlumil enzym štěpící pektin, což zabránilo měknutí rajčat a tak i transport na delší vzdálenost; komerční název je Flavr-savr. S rozvojem biotechnologií stále více a více GMO vstupuje na trh, zejména ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu. Ke komerčnímu pěstování na území EU je povolen pouze GM kukuřice hybrid MON 810 a klon bramboru EH Ve světě se nejvíce pěstují odrůdy geneticky modifikované sóji, kukuřice, bavlníku a řepky. Několik členských států EU však uplatnilo tzv. bezpečnostní doložku (čl. 23 směrnice 2001/18/EC). Podle této doložky mohou členské státy dočasně omezit nebo zakázat použití nebo prodej GM produktů na jejich území. V současné době tuto bezpečnostní položku uplatnilo šest členských států: Rakousko, Francie, Řecko, Maďarsko, Německo a Lucembursko. V současnosti se GMO využívají také jako geneticky modifikované potraviny a krmiva. Na evropský trh je povoleno uvádět pro potravinářské a krmné účely produkty těchto geneticky modifikovaných plodin: sója, kukuřice, řepka, brambor a bavlník. Produkce GMO živočišného původu (např. ryby) pro potravinářské účely není v Evropské unii povolena. Spotřebitelé se obávají negativních dopadů GM potravin na jejich zdraví, a proto požadují vědecké studie a informace, že GMO používané jako potraviny či krmiva jsou bezpečné. Z toho důvodu evropská legislativa požaduje označování potravin, které jsou vyrobeny, obsahují či sestávají z GMO. Tyto potraviny musí být na obalu označeny - 8 -

9 nápisem geneticky modifikovaný organismus popř. konkrétně geneticky modifikovaná kukuřice, sója apod. a doplněny tzv. jednoznačným identifikačním kódem, který přesně určuje, jaká modifikace byla v rámci šlechtění u rostliny použita. Taková informace umožňuje spotřebiteli svobodnou volbu a možnost rozhodování při výběru potravin, které konzumuje. Jednoznačný identifikační kód by měl zajistit identifikaci GM plodiny v průběhu celého procesu od pěstování, přes zpracování až ke spotřebiteli, tzv. od vidlí až po vidličku. Aby bylo možné sledovat výskyt GMO na trhu a v potravinách, je nutné provádět laboratorní detekci. Metody využívané k detekci GMO jsou založeny na detekci transgenní DNA nebo transgenního proteinu. V současné době je pro detekci transgenní DNA nejvíce používanou metodou polymerázová řetězová reakce (PCR). Pro detekci transgenního proteinu je využívána imunochemická metoda ELISA. Moje disertace byla zaměřena na diagnostiku schválených a neschválených GMO ve vybraných zemědělských plodinách pocházející z konvenčního a ekologického zemědělství a potravin rostlinného původu odebraných v obchodní síti. K diagnostice byly využity metody kvalitativní a kvantitativní PCR a imunochemická metoda ELISA. Je tedy věnována studiu bezpečnosti potravin (food safety) na našem trhu

10 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Charakteristika geneticky modifikovaných organismů Mezi geneticky modifikované organismy patří organismy, do kterých byl vnesen gen o známé sekvenci a funkci, kódující požadovanou vlastnost za použití metod genového inženýrství. Ostatní geny zůstanou prakticky nedotčeny (ZDEŇKOVÁ et al., 2002). Výzkum je v současné době zaměřen na přenos příslušných genových sekvencí do zemědělsky a potravinářsky významných rostlin. Stále častěji se také diskutuje využití transgenních rostlin k odstraňování kontaminantů z životního prostředí a využití transgenních rostlin se zvýšenou schopností akumulace nebo přeměny látek znečišťujících životní prostředí (FRANČOVÁ et al., 2001). Ke vzniku geneticky modifikovaných vyšších rostlin (GMVR) se nejčastěji využívají dva odlišné způsoby k přenosu cizí DNA do genomu rostlin. Vkládaný genetický konstrukt musí obsahovat promotor, sekvenci kódující požadovaný gen a terminátor. První způsob využívá přenosu DNA do rostlinných buněk pomocí půdních bakterií Agrobacterium tumefaciens (viz. obr. 1) a A. rhizogenes. Metoda je založena na přirozené vlastnosti bakterií napadat vyšší rostliny. Tato bakterie vnáší své specifické geny, lokalizované do části velkého plazmidu, tzv. Ti plazmid, do rostlinného genomu. Tato část plazmidu Ti se nazývá T-DNA (transferred DNA) (ONDŘEJ et al., 1999, FRANČOVÁ et al., 2001, VEJL, 2007). Při použití této metody se do rostlinné DNA introdukuje nízký počet kopií T-DNA. Postupy jsou většinou méně účinné a nevýhodou je i začlenění transgenů ve větším počtu kopii. To vede k jejich různé přestavbě v důsledku homologních rekombinací a také umlčování transgenů (ŘEPKOVÁ, RELICHOVÁ, 2001). Další způsob využívá přímého přenosu genu do rostlinné buňky (např. biolistické metody). Tyto metody umožňují vnášet geny do buněk i do celých neporušených rostlin. Vnášenou DNA se obalí mikročástečky zlata nebo wolframu a speciálním přístrojem se nastřelí přímo do buněk rostlin (ONDŘEJ et al., 1999, FRANČOVÁ et al., 2001, VEJL, 2007)

11 Obr. 1: Přenos DNA do rostlinných buněk (KARCHER et al., 2011) GMO můžeme rozdělit do několika skupin (ROBINSON, 2001): 1) GMO první generace vyznačují se přínosy zejména pro pěstitele. Nově získané vlastnosti vedou k novým typům GM odrůd, které jsou odolné proti hmyzím škůdcům (tzv. Bt odrůdy), tolerantní k herbicidům (HT odrůdy), rezistentní vůči bakteriálním, houbovým a virovým chorobám. 2) GMO druhé generace produkty mají zvýšené nebo změněné nutriční vlastnosti (vhodnější složení mastných kyselin, upravený obsah vitamínu apod.). 3) GMO třetí generace odolné biotickým stresům (např. rezistence/tolerance k chladu suchu, zasolení půdy, nedostatku světla)

12 2.2 Situace v ČR a ve světě GMVR se také využívají jako potraviny a krmiva. GMVR povolené v EU jsou uvedeny v tzv. registru společenství pro potraviny a krmiva. Přehled povolených GMVR pro dovoz a zpracování jako potraviny a krmiva, příp. pro komerční pěstování dle registru je uveden v tabulce 1 (EU, 2010a). V roce 2008 opět došlo celosvětově k nárůstu ploch osetých GM plodinami na 125 mil. ha. Komerčně byly GM plodiny pěstovány v 25 státech; nejvíce jsou pěstovány v USA (62,5 mil ha), Argentině (21), Brazílii (15,8), Indii a Kanadě (7,6) (GMO COMPASS, 2010h). Plochy oseté GM kukuřicí měly do roku 2008 v ČR vzrůstající trend. V roce 2009 došlo k poklesu (tab. 2). Hlavním důvodem poklesu je problematický odbyt pro tento typ kukuřice, kterou je nutno oddělovat od klasické produkce a označovat jako geneticky modifikovaný organismus. Zmenšení ploch Bt kukuřice také může souviset s celkovým poklesem ploch kukuřice na zrno v roce 2009 (dle údajů ČSÚ z cca 108 tis. ha v roce 2008 na 92 tis. ha v roce 2009) (MZe ČR, 2009). V roce 2009 došlo globálně ke zvýšení pěstování GM plodin. Ve srovnání s rokem 2008 vzrostly plochy o 9 milionů ha na celkem 134 milionů ha. Ve vyspělých zemích došlo k nárůstu o 2 miliony ha (3%) a v rozvojových zemích o 7 milionů ha (13%). Nadprůměrný nárůst byl zaznamenám v Brazílii a Burkina Faso (GMO COMPASS, 2010a). V roce 2009 byli největšími producenty GM plodin USA (64 mil. ha), Brazílie (21,4), Argentina (21,3), Indie (8,4) a Kanada (8,2), Čína (3,7). Nejčastěji pěstované plodiny a jejich plocha v roce 2009 jsou uvedeny v tabulce 3 (GMO COMPASS, 2010a). V EU je k pěstování povolena kukuřice MON 810, která je toxická pro zavíječe kukuřičného (Ostrinia nubilalis Hübner, 1796). Pěstitelé kladně hodnotí úroveň dosaženého výnosu, případně zlepšenou kondici porostů. Zápory byly zejména ve vysoké ceně osiva, nutnosti evidence (KUČERA, ČEŘOVSKÁ, 2006). V současné době je v procesu schvalování kukuřice T 25. V roce 2008 bylo pěstování Bt kukuřice zakázáno ve Francii a v roce 2009 i v Německu. Tyto státy uplatnily tzv. bezpečnostní doložku (čl. 23 směrnice 2001/18/EC). Podle této doložky mohou členské státy dočasně omezit nebo zakázat použití nebo prodej GM produktů na jejich území. V roce 2009 došlo k poklesu ploch osetých GM plodinami v EU. Své plochy snížil i největší

13 evropský producent Bt kukuřice, Španělsko (GMO COMPASS, 2010b). Plochy pěstování GM plodin (Bt kukuřice, sójové boby) v EU jsou uvedeny v tabulce 4. V roce 2010 evropská komise povolila pěstování brambor EH (Amflora) v EU pro průmyslové použití (např. výroba papíru) a využití vedlejších produktů škrobu z těchto brambor jako krmiva. V ČR se v současné době jako v jediné zemi EU pěstují jak GM kukuřice, tak GM brambory (stav 2010: Bt kukuřice ha, GM brambory Amflora 150 ha) (MZe, 2010). Tab. 1: Přehled povolených GMO jako potraviny a krmiva (ke dni ) GM plodina Jednoznačný identifikátor Výrobce Vložený gen /Získaná vlastnost Bavlník MON1445 MON Monsanto cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Bavlník MON15985 MON Monsanto Cry1A(c) a cry2ab2 gen rezistence k lepidopterám Bavlník MON15985 x MON1445 MON MON x Monsanto cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1A(c) a cry2ab2 gen rezistence k lepidopterám Bavlník MON531 MON Monsanto Cry1A(c) gen insekt rezistence Bavlník MON531 x MON1445 MON MON x Monsanto Cry1A(c) gen insekt rezistence cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Bavlník LLCotton25 ACS-GH001-3 Bayer Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Kukuřice Bt 11 SYN-BT011-1 Syngenta Cry1A(b) gen insekt rezistence Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému

14 Kukuřice DAS1507 DAS Pioneer and Dow AgroSciences Kukuřice DAS1507xNK 603 DAS xMON Pioneer and Dow AgroSciences Kukuřice DAS59122 DAS Pioneer and Dow AgroSciences Kukuřice 1507x59122 DAS xDAS Pioneer Cry1F gen rezistence k European corn borer a dalším lepidopterám Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Cry1F gen rezistence k European corn borer (Ostrinia nubilalis) a dalším druhům rodu Sesamia Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému CP4 EPSPS protein tolerance k herbicidu glyfosátu Cry34Ab1 a cry35ab1 proteiny ochrana proti určitým coleopterám (Diabrotica spp.) PAT protein tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Cry1F gen ochrana proti lepidopterám Cry34Ab1 a cry35ab1 geny ochrana proti coleopterám Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Kukuřice GA 21 MON Syngenta mepsps protein tolerance k herbicidu glyfosátu Kukuřice MON 810 MON Monsanto Cry1A(b) gen rezistence k lepidopterám Kukuřice MON 863 MON Monsanto Úsek genu Cry3Bb1 insekt rezistence nptii gen selekční marker Kukuřice MON 863 x NK 603 MON MON x Monsanto Úsek genu Cry3Bb1 insekt rezistence nptii gen selekční marker cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu

15 Kukuřice MON 863 x MON x Monsanto Cry1A(b) gen MON 810 MON rezistence k lepidopterám Úsek genu Cry3Bb1 insekt rezistence nptii gen selekční marker Kukuřice NK 603 MON Monsanto cp4 epsps gen tolerance k herbicidu Kukuřice NK 603 x MON 810 Kukuřice MON863xMON810xNK 603 MON MON MON xMON xMON x Monsanto Monsanto glyfosátu cp4 epsps tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1Ab protein rezistence k lepidopterám (Ostrinia nubilalis, Sesamia spp.) Cry3Bb1 gen ochrana proti coleopterám Cry1Ab gen ochrana proti lepidopterám cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu nptii gen vložen jako selekční marker Kukuřice T25 ACS-ZM003-2 Bayer Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Kukuřice MON88017 MON Monsanto Cry3Bb1 gen ochrana proti coleopterám cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Kukuřice MON89034 MON Monsanto Cry1A.105 a cry2ab2 geny ochrana proti lepidopterám Kukuřice 59122xNK603 DAS xMON Pioneer Cry34Ab1 a cry35ab1 geny ochrana proti coleopterám Pat geny tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému cp4 epsps geny tolerance k herbicidu glyfosátu Kukuřice MIR604 SYN-IR604-5 Syngenta Cry3A gen ochrana proti coleopterám pmi gen vložen jako selekční marker

16 Kukuřice Bt 11xGA 21 Kukuřice MON88017xMON 810 Kukuřice MON89034xNK 603 Kukuřice 59122x1507xNK 603 Bakteriální biomasa (pcabl-bacterial Biomass) Kvasniční biomasa (pmt742 nebo pak729 kvasniční biomasa) SYN-BT011-1xMON MON xMON MON xMON DAS xDAS xMON Syngenta Monsanto Monsanto Pioneer Ajinomoto Eurolysine SAS NOVO Nordisk A/S Cry1Ab gen ochrana proti lepidopterám Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému mepsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1Ab gen ochrana proti lepidopterám Cry3Bb1 gen ochrana proti coleopterám cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1A.105 a cry2ab2 geny ochrana proti lepidopterám cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1F gen ochrana proti lepidopterám Cry34Ab1 a cry35ab1 geny ochrana proti coleopterám Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému cp4 epsps gen tolerance k herbicidu glyfosátu Bakteriální protein, vedlejší produkt při fermentaci L-lysinu HCl získaného z (Brevibacterium lactofermentum kmen SO317/pCABL) mrtvých mikroorganismů NOVO Yeast Cream je produkován z GM kvasinkových kmenů (Saccharomyces cerevisiae kmeny MT663/pMT742 nebo pak729) kultivovaných na substrátech zeleninového původu

17 Řepka GT73 MON Monsanto Geny cp4 epsps a goxv247 tolerance k herbicidu glyfosátu Řepka MS8, RF3, ACS-BN005- Bayer bar (pat) gen MS8xRF3 8,ACS-BN003-6, rezistence k herbicidu ACS-BN005-8 x glufosinátu amonnému ACS-BN003-6 Gen barnáza pylová sterilita Gen barstar pylová sterilita Řepka T45 ACS-BN008-2 Bayer Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Brambor EH BPS BASF Inhibovaný gen gbss odpovědný za biosyntézu amylázy, hlízy produkují amylopektin nptii gen vložen jako selekční marker Sója MON MON Monsanto cp4 epsps tolerance k herbicidu glyfosátu Sója A ACS-GM005-3 Bayer Pat gen tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Sója MON89788 MON Monsanto cp4 epsps tolerance k herbicidu glyfosátu Cukrovka H7-1 KM KWS SAAT cp4 epsps tolerance a Monsanto k herbicidu glyfosátu Zdroj EU: Tab. 2: Plochy oseté GM kukuřicí v ČR v letech Rok Výměra Bt kukuřice v ha Počet pěstitelů Zdroj: Ministerstvo zemědělství ČR,

18 Tab. 3: Celosvětové plochy pěstování GM plodin v roce 2009 Plocha (mil. ha) Plocha GM (mil. ha) Podíl GM (%) Sója Kukuřice Bavlník Řepka 31 6,4 21 Cukrovka 4,4 0,5 9 Zdroj: Tab. 4: Pěstování GM plodin v EU v letech v ha Španělsko Francie Česká republika Portugalsko Německo Slovensko , Rumunsko (sójové boby) (sójové boby) Polsko Celkem GM kukuřice Zdroj:

19 Zdroj: Obr. 2: Celosvětové plochy pěstování GM plodin v letech (v mil.ha) Rizika GMO a jejich vnímání veřejností Pomocí genového inženýrství získávají rostliny další nové vlastnosti a význam pro pěstování a posklizňové použití. GM rostliny první generace měly vlastnosti přínosné pro producenty, zatímco GM plodiny následných generací jsou určeny k zajištění užitných vlastností pro spotřebitele, např. zlatá rýže (YONEKURA- SAKAKIBARA, SAITO, 2006). Potraviny vyrobené z geneticky modifikovaných organismů musí být zdravotně bezpečné, jinak by nemohly být schváleny k použití. Všechny GM produkty jsou testovány, zda mohou vyvolávat alergie nebo obsahují toxické látky, které by mohly být nebezpečné pro lidské zdraví (GMO COMPASS, 2010g). Potraviny, které jsou vyrobeny, obsahují či sestávají z GMO a obsah GMO je vyšší než 0,9% musí být v EU na obalu označeny dle nařízení 1830/2003. Na obalu musí být označeny nápisem geneticky modifikovaný organismus popř. konkrétně geneticky modifikovaná kukuřice, sója apod. a doplněny tzv. jednoznačným identifikačním kódem, který přesně určuje, jaká modifikace byla v rámci šlechtění u rostliny použita. Taková

20 informace umožňuje spotřebiteli svobodnou volbu a možnost rozhodování při výběru potravin, které konzumuje. Toto označení se nevztahuje na potraviny a krmiva vyrobené s pomocí GMO (např. enzymy, potraviny ze zvířat krmených GM krmivy). Hranice pro označování potravin je odlišná na různých místech světa, např. 1% v Austrálii a na Novém Zélandu, 3% v Koreji a 5% v Japonsku a Indonésii (BERDAL et al., 2008). Zásah do našich systémů potravinové produkce vždy vyvolal veřejný zájem. Největší zájem spotřebitelů je o možné riziko spojené s GMO. Zvažování rizik komplikuje otázka snižování použití chemických pesticidů, snižování nákladů a zvyšování nutriční hodnoty (SINGH et al., 2006, FERBER, 1999). RUPRICH (2006) uvádí, že u potravin se zejména posuzují následující zdravotní rizika: 1. Výskyt signálních a selekčních genů, 2. toxické účinky, 3. alergenní účinky, 4. nutriční účinky, 5. patogenita (u GM mikroorganizmů). Největší obavy vyvolává možnost alergenních účinků. Proto je zásadní, aby posuzovatelé sledovali schopnost nového GMO tvořit proteiny, které v původním organizmu nebyly, a u těchto proteinů pak hodnotit jejich alergenní potenciál (RUPRICH, 2006). Geny pro rezistenci k antibiotikům se používají jako selektovatelné geny, způsobující necitlivost k určitému antibiotiku (např. gen pro rezistenci ke kanamycinu). Daný gen pro rezistenci ke kanamycinu kóduje enzym neomycinfosfotransferázu (NPTII), který inaktivuje příslušné antibiotikum. V trávícím traktu je NPTII rychle rozštěpen a totéž platí i pro veškerou DNA. Možnost, že by se snad nějaký gen mohl potravou přenést do genomu konzumenta je naprosto vyloučena (ŘEPKOVÁ, RELICHOVÁ, 2001). Spotřebitelé se hlavně zajímají o složení jejich potravin a musí mít právo výběru kvalitních potravin. Spolehlivý a efektivní způsob zajištění kvality je označování GM potravin (SINGH et al., 2006). Jako velký nedostatek uvádí DOMINGO (2007), že vědecké studie zaměřené na hodnocení toxických účinků a zdravotní rizika z GM plodin uvádí data, která jsou nedostatečná. Většina vyšetření byla prováděna jako krátkodobé studie, zejména nutriční studie s velmi limitovanými toxikologickými informacemi

21 2.3 Geneticky modifikované vyšší rostliny Geneticky modifikovaná sója Sója (Glycine max L.) má 2n = 40 chromozómů, je ekonomicky důležitá luštěnina. Pro vysoký obsah proteinů (40%) a oleje (20%) v semenech má široké použití jako potravina, krmivo i jako surovina pro zpracovatelský průmysl (SINGH, HYMOWITZ, 1999). GM sója linie GTS (Roundup Ready sója), která byla vyvinuta firmou Monsanto, je tolerantní k herbicidu glyfosátu. K přenosu rekombinantní DNA byla využita biolistická metoda. Inhibice k herbicidu glyfosátu je dána genem 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase z Agrobacterium tumefaciens kmene CP4 (CP4 EPSPS). GM sója obsahuje jednu funkční kazetu CP4 EPSPS genu, která je tvořena promotorem viru květákové mozaiky (CaMV E35S), chloroplast tranzitním peptidem (CTP4 z Petunia hybrida), kódující sekvence CP4 EPSPS a terminátorem nopalin syntázou (T-nos) z A. tumefaciens), jak je uvedeno na obr. 3 (PADGETTE et al., 1995). V roce 1996 byla v EU povolena k dovozu a zpracování jako potravina a krmivo dle nařízení pro potraviny nového typu. Rostlinná DNA Rostlinná DNA P-E35S promotor CaMV 35S, CTP chloroplast tranzitní peptid, CP4 EPSPS - 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase z Agrobacterium tumefaciens kmene CP4, T-nos terminátor nopalin syntáza P-E35S CTP4 CP4 EPSPS T-nos Obr. 3: Schéma genové kazety Roundup-Ready sóji (GTS ) Celosvětově došlo v průběhu 12 let k nárůstu ploch, kde se pěstuje GM sója (obr. 4). V roce 1997 se pěstovala na 5,1 ha (7,6%) v USA a Argentině. V roce 2009 to již bylo 69 ha (77%) (tab. 3). Největšími pěstiteli jsou USA, Argentina a Brazílie (GMO COMPASS, 2010c)

22 Zdroj: er_cultivation.html Obr. 4: Plochy oseté GM sójou z celkové plochy oseté sojovými boby v letech (v procentech) Geneticky modifikovaná kukuřice Kukuřice (Zea mays L.) má 2n = 20 chromozomů, je pěstována v mírném a teplém klimatu téměř na celém světě. Její největší producenti jsou USA, Čína, Brazílie, Mexiko, Indie. Používá se jako krmivo, potravina, výroba škrobu i v průmyslu. Metodami genového inženýrství vznikly nové odrůdy, jejichž nejčastěji nově získané vlastnosti se využívají v zemědělství. Nové vlastnosti umožňují ochranu proti hmyzím škůdcům (Bt odrůdy) a toleranci k herbicidům (HT odrůdy). Tyto GM hybridy se od konvečních hybridů liší pouze v nově získaných vlastnostech. Bt odrůdy jsou odrůdy, které mají vložený gen z bakterie Bacillus thuringiensis pro Cry-proteiny (nebo pro jejich účinnou část) přímo do genomu rostliny, která pak tvoří ve svých buňkách příslušný toxický protein (δ-endotoxin) a hmyz konzumující tuto rostlinu je usmrcen. Zabudování genu pro produkci tohoto endotoxinu do rostliny umožnilo vzhledem k mnoha kmenům Bt specifické působení proti nejrůznějšímu hmyzu (Cry1, Cry2 proti lepidopterám, Cry3 proti coleopterám, Cry1 a Cry4 proti dipterám). Vysoká specifičnost účinnosti toxinu vylučuje škodlivost pro zvířata a lidí po

23 požití těchto plodin (CHLOUPEK, 2000). Patří sem hybridy MON 810, Bt 11, Bt 10, StarLink, DAS 1507, Bt 176. Přehled genů pro tvorbu cry-proteinů u jednotlivých linií je uveden v tabulce 5. Tab. 5: Přehled genů pro cry-proteiny (CERA) Kukuřice - linie Producent Gen MON 810 Monsanto Cry1Ab Bt 176 Ciba-Geigy Cry1Ab Bt 11 Syngenta Cry1Ab Bt 10 Syngenta Cry1Ab DAS 1507 Monsanto Cry1Fa2 StarLink (CBH351) Aventis CropScience Cry9C Zdroj: databáze CERA Odrůdy tolerantní k herbicidům tolerují účinné látky, jako jsou glufosináty (fosfinotriciny) nebo glyfosáty. Glyfosát inhibuje enzym účastnící se na syntéze aromatických kyselin. Glufosinát je produktem druhů aktinomycet Streptomyces hygroscopicus a Streptomyces viridochromogenes. Fosfinotricin blokuje enzym glutaminsyntázu, který je významný pro detoxikaci amoniaku v rostlinných buňkách. Tyto plodiny se vyznačují schopností tolerovat ošetření neselektivními herbicidy, které by za normální situace zahubily veškerou vegetaci (ONDŘEJ, DROBNÍK, 2002, HOLEC, SOUKUP, 2006). Hybridy tolerantní ke glyfosátu jsou GA 21, NK 603 a hybrid tolerantní ke glufosinátu je označen T 25. Tolerance ke glyfosátu je kódována genem epsps původem z Agrobacterium spp. Tolerance k herbicidu glufosinátu je kódována geny pat (phosphinotricin acetyltransferase) ze Streptomyces viridochromogenes nebo bar (bialaphos resistence) získaný ze Streptomyces hygroscopicus. Genové kazety jednotlivých hybridů jsou uvedeny na obrázku

24 MON 810 P-35S Hsp70 Cry1Ab Bt 11 P-35S IVS2 Pat T-nos P-35S IVS6 Cry1Ab T-nos Bt 176 PEPC Cry1Ab T-35S poly(a) P-CDPK Cry1Ab T-35S poly(a) TC1507 P-35S pat T-35S poly(a) P-Ubi ZM Cry1Fa2 ORF25 poly(a) StarLink P-35S bar T-nos P-35S CTP Cry9c T-35S poly(a) GA 21 P-ract1 CTP m-epsps T-nos NK 603 P-ract1 Ract1 int CTP2 CP4 EPSPS T-nos P-35S Hsp70 CTP2 CP4 EPSPS T- nos T 25 P-35S pat T-35S poly(a) P-35S - promotor CaMV 35S, hsp70 -, cry1ab delta endotoxin z Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki, T-nos terminator nopalin syntáza z A. tumefaciens, pat fosfinotricin N-acetyltransferáza, PEPC fosfoenolpyruvát karboxyláza, CDPK calcium-dependent protein kináza, T-35S terminátor CaMV 35S, CTP chloroplast tranzitní peptid, Ubi ubiqiutin ZM (Zea mays), cry1f delta endotoxin z Bacillus thuringiensis var. Aizawai, ORF otevřený čtecí rámec, bar fosfinotricin N- acetyltransferáza, cry9c delta endotoxin z Bacillus thuringiensis subsp. Tolworthi, P-ract - promotor z rýžového actinu, epsps 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntáza. Obr. 5: Schémata genových kazet hybridů kukuřic (CERA GMO databáze, 2011) V současné době se nově vyvíjí také hybridní linie (tzv. stacked gene), které kombinují vlastnosti odrůd tolerantních k herbicidu a Bt odrůd (např. MON 810xNK 603). Evropská komise v roce 2010 povolila GM odrůdu MON 863xMON 810, MON

25 863xNK 603 a MON 863xMON 810xNK 603 pro použití jako potraviny a krmiva a pro dovoz a zpracování (EU, 2010) Geneticky modifikovaný brambor Brambor (Solanum tuberosum L.) má 4n = 48 chromozomů, pochází z Jižní Ameriky. Patří mezi lilkovité. Je to jednoletá, dvouděložná rostlina, rozmnožující se jak generativně, tak vegetativně (CHLOUPEK et al., 2005). Bramborové hlízy se využívají v potravinářství i v průmyslu. S geneticky modifikovanými odrůdami se v ČR nakládá v rámci polních pokusů. Nejčastěji využívané modifikace mají za cíl změněnou skladbu škrobu v bramborových hlízách (snížený obsah amylázy). Z celkové struktury vlastností GM bramboru lze vysledovat také zvyšující se trend využívání genu ahas na úkor selekčních markerů založených na rezistenci k antibiotikům (gen nptii). Další vlastnosti GM modifikovaných brambor jsou rezistence k houbovým a virovým chorobám (ŘÍHA, 2006). V roce 2010 byla v EU povolena ke komerčnímu pěstování odrůda brambor Amflora EH firmy BASF s vysokým obsahem amylopektinu pro použití jako krmivo i jako potravina a také ke komerčnímu pěstování. Potraviny obsahující, sestávající nebo vyrobené z GM odrůdy (klonu) brambor EH by neměla převyšovat podíl 0,9% v potravině (EU, 2010a). V roce 2010 bylo v ČR osázeno GM odrůdou Amflora celkem 146 ha (MŽP, 2011). GM odrůda Amflora má ve svých hlízách zvýšený obsah amylopektinu ( 98%) ve srovnání s konvenčními odrůdami. Mateřská odrůda byla přeměněna pomocí konstruktu nesoucí fragment kódující gbss gen v antisense orientaci. Výsledkem modifikace je produkce škrobu obsahující více amylopektinu než amylosy (WANDELT, 2007). Výsledný produkt obsahuje ve dvou kazetách následující DNA (EU, 2010b): Kazeta 1: gen nptii z Tn5, řízený promotorem pro nopalin syntázu zajišťující expresi genu, ukončený polyadenylační sekvencí z genu pro nopalin syntázu z A. tumefaciens; Kazeta 2: úsek genu gbss kódující protein syntázy škrobu vázaný v granulích, který byl vložen v antisense orientaci řízený promotorem gbss a ukončený polyadenylační sekvencí z genu pro nopalin syntázu z A. tumefaciens

26 2.3.4 Geneticky modifikované rajče Rajče (Lycopersicum esculentum Mill.) má 2n = 24 chromozomů, patří do čeledi lilkovitých. Pochází ze střední a jižní Ameriky. Plodem je bobule. Zralé plody jsou bohaté na beta karoten, vitamín C, v menší míře obsahují také vitamín B a lykopen. Existují dva typy transgenních rajčat. První typ jsou rajčata Flavr-savr. Obsahují transgen, který inhibuje nebo tlumí funkci genu pro tvorbu enzymu polygalakturonasy (PG). PG je syntetizována během zrání a svým rozkladem pektinu ve střední lamele buněčné stěny plodu způsobuje měknutí rajčat. V roce 1994 uvedla firma Calgene Inc. na trh zcela první GM plodinu, kterou byla právě odrůda Flavr-savr. U plodů se silně redukovanou aktivitou PG (pod 10%) došlo k několika změnám vlastností. Plody byly podstatně větší, méně napadány bakteriálními a houbovými chorobami, šťáva měla hustší konzistenci, větší viskozitu a více sušiny. Jinak se ale proti původnímu předpokladu příliš nezměnila jejich tendence k měknutí (FRANČOVÁ et al., 2001, ONDŘEJ, DROBNÍK, 2002). V roce 1996 byl na trh ve Velké Británii úspěšně uveden první produkt z GMO rajčatové pyré vyrobené z GM rajčat firmy Zeneca. V roce 1999 však musel být tento výrobek stažen z trhu (NCBE, 2011). Druhým typem jsou rajčata, do jejichž genomu byl vnesen transgen, který zamezuje expresi rostlinného genu pro syntézu ethylenu, jenž spouští procesy vedoucí ke zrání plodů (FRANČOVÁ et al., 2001). V letech probíhaly v EU polní pokusy s GM odrůdami rajčat v Itálii, Španělsku, Francii, Portugalsku, Holandsku, Velké Británii a Řecku (GMO COMPASS, 2010d) Geneticky modifikovaná rýže Rýže (Oryza sativa) má 2n = 24 chromozomů, tvoří hlavní zdroj potravin pro téměř více než polovinu světové populace. Největšími producenty jsou Čína, Indie a jižní Asie. Největším světovým exportérem je Thajsko. Nejdůležitějším evropským pěstitelem je Itálie. Vzhledem k tomu, že rýže obsahuje málo železa a vitamínu A, je v zemích, kde je převážně hlavním zdrojem obživy široce rozšířen nedostatek vitamínu A v potravě. To vede ke zdravotním problémům, např. slepotě. Proto se vědci rozhodli vytvořit odrůdu rýže, který obsahuje vyšší množství beta-karotenu, prekurzoru vitamínu A. Díky

27 tomu má rýže žluté zbarvení, proto dostala označení Zlatá rýže (GMO COMPASS, 2010i). Kromě změny nutričních hodnot rýže, se metody genového inženýrství uplatnily při tvorbě odrůd tolerantních k herbicidům. Odrůdy LLRICE601, LLRICE06 a LLRICE62 jsou rezistentní k herbicidu fosfinotricinu (glufosinát amonný). Bar gen, který kóduje enzym PAT, byl izolován ze Streptomyces hygroscopicus kmene HP632. Podobnosti mezi liniemi LLRICE601 a -06, -62: 1. Všechny obsahují jednoduchý transgen bar řízený 35S CaMV promotorem. 2. Všechny jsou rezistentní k herbicidu glufosinátu. 3. Odlišnost od konvenční rýže je pouze přidáním sekvence bar genu do genomu a expresí PAT proteinu. Odlišnosti mezi liniemi LLRICE601, -06 a -62: 1. DNA konstrukt u linií LLRICE06 a -62 byl vložen metodou bombardování, ale u linie LLRICE601 byla provedena transformace pomocí Agrobacterium tumefaciens S CaMV promotor je nepatrně delší pro -601 než -06 a LLRICE601 má NOS terminátor, ačkoli -06 a-62 mají 35S CaMV terminátor. 4. LLRICE06, -62 a -601 reprezentují odlišné odrůdy rýže, které mají transformovaný bar gen. LLRICE06 byla transformována do odrůdy se středně velkým zrnem M202, LLRICE62 do střednězrnné odrůdy Bengál a LLRICE601 do dlouhozrnné odrůdy Cocodrie. 5. Jsou také nepatrné rozdíly v obsahu PAT proteinu mezi všemi 3 liniemi. Hladina PAT proteinu v semenech LLRICE601 je nižší než u -62 a -06. Hladina PAT proteinu v listech LLRICE601 je nižší než u 62, ale nepatrně vyšší než u 06 (CUMMINS, 2001). Rýže LL 601 není toxická a neškodí v životním prostředí a na cílové organismy. LL 601 se neliší v morfologických, agronomických a biochemických vlastnostech od konvenčních linií. Odlišnost je dána pouze nově získanou vlastností (USDA-APHIS, 2006). Odrůda LL 62 byla v roce 2006 povolena jako potravina a krmivo v Kanadě

28 a v roce 2008 v Austrálii (pouze jako potravina). Odrůda LL601 byla jako potravina a krmivo povolena v roce 2008 v Kolumbii. GM rýže Bt 63 byla vyvinuta v Číně. Do svého genomu má vnesené geny cry1ab a Cry1Ac z Bacillus thuringiensis pro produkci Bt toxinu. Transgenní rýže Bt 63 není povolena v EU Geneticky modifikovaná papája Papája (Carica papaya L.) má 2n = 18 chromozomů, pochází ze střední Ameriky (Mexiko, Guatemala), v současné době se pěstuje v řadě tropických a subtropických oblastí světa (např. Brazílie, jižní Amerika, Indie). Plody se konzumují syrové nebo se z nich připravují kompoty, džemy apod. Geneticky modifikovaná papája odrůd 55-1 a 63-1 byla vyvinuta z důvodu zvyšujících se výskytů virového onemocnění působeného Papaya Ring Spot Virus (PRSV), který způsoboval problémy farmářům na celém světě. PRSV je celosvětově příčinou virového onemocnění. Klony 55-1 a 63-1 jsou rezistentní k infekci působené virem kroužkovitosti (PRSV). Byla vložena odvozená virová sekvence, která kóduje plášťový protein (CP) PRSV. Vložená virová sekvence nevytváří žádné infekční částice. Exprese PRSV CP genu je kontrolována promotorem a terminátorem 35S. Do genomu těchto klonů byl vložen markerový gen neo kódující enzym neomycinfosfotransferázu II (nptii), který způsobuje rezistenci k antibiotiku kanamycinu a neomycinu. Schéma genové kazety je uvedeno na obrázku 6 (CERA GMO Database, 2011). V roce 2010 byla v Japonsku povolena GM papája k prodeji. Plody musí být přísně označeny. Jedná se o první produkt, který může být prodáván a konzumován v nezpracované formě (GMO COMPASS, 2011). P-35S Prsv-cp T-35S P-nos nptii T-nos P-35S gus T-nos Gus - beta-d-glucuronidase, nptii neomycin fosfotransferáza II, prsv papaya ringspot virus Obr. 6: Schéma genové kazety papáji 55-1/

29 2.4 Metody využívané pro detekci GMO Základní schéma detekce GMO zahrnuje odběr vzorku matrice, homogenizaci, extrakci nukleové kyseliny nebo proteinu, testovací metody potvrzující přítomnost transgenu a jeho kvantifikaci. Doporučený postup je uveden na obrázku 7. Existuje několik analytických metod, jak kvalitativních, tak kvantitativních, které byly vyvinuty pro určení přítomnosti a/nebo množství GMO v zemědělských plodinách, potravinách a vysoce zpracovaných potravinách. Kromě klasických metod založených na detekci DNA nebo proteinu, lze využít i další chemické metody zaměřené na určitou složku GM matrice, jakou jsou chromatografie nebo infračervená spektroskopie (ANKLAM, 2002). Odběr vzorků Homogenizace Extrakce DNA Kontrola kvality DNA Detekce rostlinné DNA metodou PCR + - Screeningové metody + - GMO přítomny Detekce GMO metodou ELISA Identifikace transgenu metodou PCR Kvantifikace transgenu metodou real-time PCR Obr. 7: Doporučený postup detekce GMO

30 2.4.1 Metody založené na detekci nukleových kyselin K detekci nukleových kyselin se nejčastěji využívá metoda polymerázové řetězové reakce (PCR) a její modifikace (multiplex PCR, nested PCR, DNA čipy). Princip PCR byl objeven K. Mullisem v roce 1985 a od té doby byl mnohokrát publikován (např. SAMBROOK, RUSSEL, 2000; ANKLAM et al., 2002). Je to in vitro reakce, umožňující amplifikaci vybraného úseku DNA, který se nachází mezi dvěma místy o známé sekvenci nukleotidů. PCR je metoda vysoce citlivá a specifická. Princip PCR využívají i některé komerčně dodávané kity např. GeneScan nebo TaqMan (Applied Biosystem, USA). Multiplex PCR mnohonásobná PCR, kdy je do reakční směsi přidáno více párů primerů umožňující detekci několika genů současně v jedné reakci. Nested PCR využívá vnitřní a vnější primery. Primární produkt získaný reakcí s vnějšími primery je templátem pro reakci s vnitřními primery. Zvyšuje se specifita reakce (ŠMARDA et al., 2005). Real-time PCR - umožňuje přímou kvantifikaci PCR produktu v průběhu reakce. Kvantifikace se provádí prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním zařízení, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování postupu v reálném čase bez nutnosti detekovat produkty PCR elektroforeticky. K detekci produktu existují tři obecné metody založené na použití: interkalačního barviva vázajícího se na DNA (např. SybrGreen), fluorescenčně značených sond vázajících se na střední část amplifikovaného produktu (např. TaqMan sondy) a fluorescenčně značených primerů (např. AmpliFluor) (ŠMARDA et al., 2005). DNA čipy (DNA microarrays) principem je spojení polymerázové řetězové reakce a mikročipové gelové elektroforézy. Proces je založen na miniaturizaci nástřiku, zpracování i analýze v jednom zařízení. Systém umožňuje možnost stanovit současně více GMO (ZDEŇKOVÁ et al., 2002). Tento systém dovoluje detekovat rozdílné GM odrůdy a také neschválené GMO. Další výhodou je, že tato technologie může být pravidelně doplňována o nově schválené GMO (RIZZI et al., 2004). Nevýhodou je však vysoká cena

31 Metody PCR pro detekci GMO lze rozdělit podle jejich specifiky nejméně do 4 kategorií (HOLST-JENSEN et al., 2003): 1) Metoda k detekci rostlinné DNA detekce specifické sekvence chloroplastového genu vyskytujícího se u rostlin: - detekce chloroplastového genu intron trna Leu. 2) Metody detekující specifický druh detekce specifické sekvence typické pro daný druh: - genomická DNA - virus květákové mozaiky (CaMV), - kukuřice hmg, invertázový gen, zein, - sója lectinový gen, - rajče polygalacturonasový gen. 3) Screeningové metody (kategorie 1) detekce nejčastěji používaných elementů vyskytující se v konstruktu. Potvrzuje, že je přítomna transgenní DNA, neidentifikuje však GMO: - promotor CaMV (P-35S), - terminátor CaMV (T-35S), - terminátor nopalin syntéza z Agrobacterium tumefaciens (T-nos), -neomycinfosfotransferáza II (nptii) kódující rezistenci k neomycinu/kanamycinu, - beta laktamásový gen (bla) kódující rezistenci k ampicilinu u prokaryot. 4) Genově-specifické metody (kategorie 2) detekují daný gen, je možné identifikovat daný typ GMO: - bar (fosfinotricin acetyltransferase) gen, - Cry1A(b) gen (syntetický). 5) Metody pro detekci specifického konstruktu (kategorie 3) detekují přechodnou část mezi sousedními elementy konstruktu: - Bt 11: IVS6-Cry1A(b) gen, - Bt 176: CDPK promotor syntetický Cry1A(b) gen, - MON 810: P-35S hsp70 intron; hsp70 intron-cry1a(b) gen, - RR sója: P-35S CTP. 6) Metody odrůdově specifické (kategorie 4) detekují přechod v místě mezi recipientním genomem a inzertem. MON

32 Obr. 8: Specifita PCR metod (4 kategorie) (HOLST-JENSEN et al., 2003) Metody založené na detekci proteinu K detekci proteinu se nejčastěji využívá imunochemická metoda ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Metoda je založena na reakci antigenu (transgenního proteinu např. CP4 EPSPS, Cry1Ab, PAT) s protilátkou, u níž se měří množství navázaných látek pomocí přidání enzymem značeného antigenu či protilátky. Měření se provádí spektrofotometricky (závislost absorbance na koncentraci) (OSTRÝ et al., 2001). Metody mají dvě nevýhody, které brání použití jako rutinních detekčních metod. První nevýhodou je dispozice jen mála protilátek specifických proti proteinům produkovaným expresí vloženého genu. Druhou nevýhodou je degradace proteinů v průběhu zpracování potravin (ZDEŇKOVÁ et al., 2002). Tato metoda nemůže být použita, jestliže vložená DNA neexprimuje žádný protein (HELLER, 2006). K detekci lze využít rychlé a jednoduché metody tzv. stripů, které využívají principů ELISA metod. Imunochemické metody se použily jako semi-kvantitativní analýza a potvrzení výsledků získaných metodou PCR

33 2.4.3 Ostatní techniky pro detekci GMO Chromatografie Chromatografické metody se využívají k detekci rozdílu chemického profilu určité složky v GMO od nemodifikovaných (např. změněné mastné kyseliny nebo triglyceridy). Tato metoda je použitelná pouze při významné změně ve složení GMVR nebo odvozených produktů (ANKLAM et al., 2002). Metoda je spíše vhodná pro kvalitativní analýzu než pro kvantifikaci GMO. Např. nízké přídavky řepkového oleje se změněnou skladbou triacylglyceridů k tradičnímu řepkovému oleji nebudou s vysokou pravděpodobností detekovány vzhledem k přirozeně se vyskytujícím změnám ve složkách nemodifikovaného oleje (ZDEŇKOVÁ et al., 2002) Infračervená spektroskopie Pomocí této metody mohou být detekovány určité zásahy do struktury vláken v rostlinách, zatímco nemusí být pozorovány žádné významné rozdíly ve složení proteinů nebo olejů (HURBURGH et al., 2000, ANKLAM et al., 2002). Rozlišit malé množství GMO v nemodifikovaných produktech je v tomto případě také značně obtížné Kontrola kvality detekce GMO V průběhu celého procesu stanovení GMO metodou PCR je vhodné sledovat systém kontrol kvality detekce, které umožňují správnou interpretaci výsledků a ukazují na případnou kontaminaci. Tento systém zahrnuje duplicitní odběr vzorků, extrakční negativní kontrolu, extrakční pozitivní kontrolu, pozitivní a negativní kontrolu mastermixu: Duplicitní odběr kontrola kontaminace během homogenizace, odběru vzorku a celého procesu analýzy. Extrakční negativní kontrola sterilní voda nebo negativní materiál zpracovaný současně s vyšetřovaným vzorkem. Kontrola čistoty práce během extrakce a izolace. Extrakční pozitivní kontrola templátová DNA o známém množství obsahu GMO, nejlépe v hraničním množství detekovatelném danou metodou. Negativní kontrola mastermixu sterilní destilovaná voda. Kontrola kontaminace mastermixu

34 Pozitivní kontrola mastermixu templátová DNA slouží ke kontrole správného složení mastermixu a celého průběhu amplifikace. HELLER (2006) doporučuje několik metod k ověření PCR výsledků, které se liší spolehlivostí, přesností a cenou. Nejjednodušší metodou k identifikaci amplifikačních produktů je specifické štěpení restrikčními endonukleázami. Více specifickou metodou je přenos separovaných PCR produktů na membránu následované hybridizací se specifickou sondou (Southern Blot). PCR produkty mohou být také ověřeny přímým sekvenováním. To je nejpřesnější důkaz amplifikované DNA zemědělců

35 3 CÍL PRÁCE Moje disertace byla zaměřena na identifikaci schválených a neschválených GMO ve vybraných zemědělských plodinách pocházejících z konvenčního a ekologického zemědělství a potravinách rostlinného původu odebraných v obchodní síti. Byly vybrány zejména plodiny, které mohou sloužit pro výrobu potravin a mohou se vyskytovat na českém trhu. Jednalo se zejména o plodiny a potraviny na bázi sóji a kukuřice, dále to byly rajčata, brambory, rýže a papája. K diagnostice byly využity metody kvalitativní a kvantitativní PCR a imunochemická metoda ELISA. Vzorky byly analyzovány v laboratoři molekulárně-biologických metod (LMBM) Státního zdravotního ústavu (SZÚ) v Brně v letech Disertace sestává ze: 1. Zhodnocení vlivu zpracování na amplifikaci DNA, zejména u brambor a zpracovaných potravin. 2. Prokázání výskytu a identifikace typu GMO v potravinách rostlinného původu odebraných v obchodní síti (sója, rajčata, kukuřice, rýže, papája) metodou PCR. 3. Prokázání výskytu a identifikace typu GMO v zemědělských plodinách (kukuřice, brambor) metodou PCR. 4. Srovnání použitých PCR metod u sóji a kukuřice s výsledky imunochemické metody ELISA

36 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Materiál K detekci GMO byl použit rostlinný materiál (zejména listy a zrna kukuřice, hlízy brambor, plody rajčat a papáji, sójové boby) a potraviny (sójové výrobky, sójové boby, mouka kukuřičná, rýže, sušená, kandovaná a konzervovaná papája). Listy a zrna kukuřice i hlízy brambor byly odebrány ve spolupráci s Českou inspekcí životního prostředí (ČIŽP) a s Ministerstvem životního prostředí (MŽP) na polích v ČR. Odběr vzorků byl proveden dle metodického pokynu GMO Potraviny, plody rajčat a papáji byly nakoupeny v tržní síti ve spolupráci se Zdravotními ústavy v rámci projektu GENOMON. Vzorky potravin byly nakoupeny na 12 místech ČR (obr. 9) ve čtyřech termínech za rok (březen, květen, září, listopad). Celkem bylo zpracováno 792 vzorků potravin a rostlinného materiálu. Hlízy GM brambor (EH ) byly použity syrové i kulinárně upravené. Byly použity běžné kulinární úpravy jako je loupání, vaření (s/bez soli), smažení. Vzorky byly odebrány v letech Přehled odebraných a vyšetřovaných vzorků potravin a rostlinného materiálu je uveden v tabulce 6. Vzorky byly zpracovány a vyšetřeny v laboratoři molekulárně biologických metod (LMBM) Státního zdravotního ústavu Centra zdraví, výživy a potravin v Brně. Obr. 9: Odběrná místa potravin