Fermentační produkce butanolu - současné reálné možnosti a výhled do budoucnosti

Transkript

1 205 Fermentační produkce butanolu - současné reálné možnosti a výhled do budoucnosti Dr.ing. Petra Patáková, ing. Jakub Lipovský, ing. Petr Fribert, prof. ing. Mojmír Rychtera, CSc. a prof. ing. Karel Melzoch, CSc. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Technická 5, Praha 6, tel: , petra.patakova@vscht.cz, Abstrakt Kvasná technologie výroby butanolu pomocí aceton-butanolového kvašení využívá různé druhy bakterií rodu Clostridium jako producenty rozpouštědel. Typický průběh kvašení je dvoufázový, v první fázi se tvoří kyselina máselná a octová, v druhé fázi rozpouštědla, butanol, aceton a v malé míře také etanol. Hlavními problémy, které je třeba překonat, aby byla výroba butanolu rentabilní jsou omezení tvorby dalších produktů a zvýšení koncentrace butanolu v kultivačním médiu. Tyto překážky lze řešit za pomoci genového inženýrství, úpravou produkčního kmene nebo vhodným uspořádáním fermentačního procesu a jeho integrací se separačním krokem např. stripováním plynem. Velký vliv na ekonomiku celého procesu má také cena suroviny, ze které se butanol vyrábí, jako nejslibnější se jeví cukrová třtina a cukrovka, syrovátka a v budoucnu i lignocelulosové hydrolyzáty. Pro ČR je možno uvažovat i o surovinách obsahujících škrob (kukuřice, obilí). Technologie tzv. aceton-butanolového kvašení má dlouhou a zajímavou historii, sahající na počátek minulého století, kdy byl v Anglii postaven a provozován první závod, zabývající se výrobou rozpouštědel kvasným způsobem. Zatímco tehdy byl v centru pozornosti hlavně aceton, používaný jako příměs do leteckých benzínů, nyní je žádaným produktem butanol, který by na základě svých výhodných vlastností (vyšší obsah energie, nižší těkavost, hydrofilita a nižší korozivita) mohl být přidáván nejen do motorové nafty, ale také do benzinu namísto tzv. bioetanolu. Producentem butanolu a dalších rozpouštědel jsou bakterie rodu Clostridium; nejznámějším druhem je Clostridium acetobutylicum, ale butanol dokážou tvořit i další druhy jako např. Clostridium beijerinckii nebo Clostridium saccharobutylicum. Všechny tyto druhy bakterií jsou anaerobní, heterofermentativní (tj rostou za nepřístupu vzdušného kyslíku a tvoří zároveň různá množství různých metabolitů), rostou ve formě tyčinek a obvykle v určitém stadiu života vytváří tzv. spory. Spory obecně slouží bakteriím k přečkání nepříznivých podmínek a u klostridií je proces sporulace spojen s tvorbou rozpouštědel. Zdrojem uhlíku a energie pro zmíněná klostridia mohou být různé mono-, di-, oligo- a polysacharidy jako jsou např. glukosa, xylosa, arabinosa, laktosa, sacharosa, inulin nebo škrob, což usnadňuje výběr vhodné suroviny, kterou tedy mohou být škrobnaté plodiny, obilí kukuřice, brambory, dále řepa cukrovka, syrovátka nebo hydrolyzáty lignocelulosových odpadů. Schopnost přímého využívání různých sacharidů, bez nutnosti energeticky náročné předúpravy, s výjimkou celulosových materiálů, je jednou z výhod klostridií oproti kvasinkám Saccharomyces cerevisiae, využívaným k produkci etanolu. Metabolická dráha, vedoucí k tvorbě rozpouštědel, je znázorněná na Obr.1. V první fázi růstu se tvoří kyseliny máselná a octová a v druhé fázi rozpouštědla butanol, aceton a etanol. Zároveň se po celou dobu aktivního růstu a sporulace tvoří i fermentační plyny, oxid uhličitý a vodík, a také další minoritní produkty kyselina mléčná a acetoin. Přepnutí metabolismu z kyselinotvorné do rozpouštědlotvorné fáze nastává při nahromadění kyselin v kultivačním médiu, doprovázeném poklesem ph. Butanol a aceton se vytváří při simultánní 1375

2 spotřebě sacharidického zdroje uhlíku a vytvořených kyselin máselné a octové; k tvorbě etanolu dochází po celou dobu fermentace pouze ze sacharidu (Jones a Woods 1986, Dürre a Bahl 1996). V minulosti používané kmeny klostridií tvořily nejčastěji butanol, aceton a etanol v poměru 6:3:1, nyní je však zřejmé, že některé kmeny tvoří pouze velmi málo etanolu a poměr mezi vytvářenými množstvími butanolu a acetonu bývá 2:1. Tvorba produktů je kmenově specifická, a zároveň ji lze do jisté míry ovlivnit kultivačními podmínkami. Jednou z podmínek při výběru či konstrukci kmene klostridií je i omezení tvorby acetonu. Již před sto lety byla vyslovena domněnka, že zahájení tvorby rozpouštědel je těsně spjaté s počátkem procesu sporulace. Tato hypotéza byla potvrzena nalezením operonu spo0a v dědičné informaci klostridií, který je zodpovědný jak za iniciaci sporulace, tak za přepnutí metabolismu z kyselinotvorné do rozpouštědlotvorné fáze (Ravagnani a další 2000). Ačkoliv byly nalezeny i klostridiální kmeny, které netvoří pod mikroskopem viditelné spory, bylo prokázáno, že i u nich dochází k iniciaci sporulace, která však neprobíhá až do konce. Obr. 1 Zjednodušené schema metabolické dráhy, vedoucí k tvorbě rozpouštědel V první tzv. kyselinotvorné fázi růstu se tvoří acetát a butyrát, v druhé tzv. rozpouštědlotvorné fázi se tvoří aceton a butanol. Ethanol, oxid uhličitý a vodík se tvoří po celou dobu fermentace. Z pyruvátu se dále mohou tvořit minoritní produkty laktát a acetoin (na obrázku neukázáno). 1376

3 Tradičním způsobem produkce butanolu a dalších rozpouštědel je vsádková kultivace, při které se však dosahuje pouze nízkých výtěžností butanolu na vnesený substrát, max. kolem 20%, při konečné koncentraci butanolu v kultivačním médiu g/l a produktivitě systému 0,3-1,2 g.l-1.h-1 (Ezeji a další 2005). Hlavními problémy při vsádkové kultivaci jsou inhibice substrátem, hlavně však inhibice produktem a nízká koncentrace buněk v bioreaktoru. Lepším řešením je proto přítokovaná kultivace, kdy reaktor nejdříve pracuje vsádkově s nízkou koncentrací substrátu v malém objemu a poté se začne dávkovat koncentrované médium v množství odpovídajícím rychlosti spotřeby substrátu - reakční objem i koncentrace produktu se zvyšuje do doby, kdy nastane inhibice produktem nebo kdy je proces ukončen a produkt separován. Přítokované uspořádání se bohužel samostatně nehodí pro produkci butanolu z důvodu jeho vysoké toxicity k produkčním kmenům, a proto ho lze použít jen v případě, že je zároveň odstraňován z kultivačního prostředí. Další možností je kontinuální kultivace, kterou lze realizovat v různém provedení jako tzv. chemostat, kdy zřeďovací rychlost je konstantní a růst buněk je limitován některou živinou, nebo auxostat, ve kterém je udržován na konstatní hodnotě některý parametr, závislý na růstu buněk (ph, koncentrace buněk, koncentrace produktu..), pomocí regulace zřeďovací rychlosti (průtok média vztažený na objem fermentačního média v reaktoru). Avšak vzhledem ke složitosti metabolických drah u klostridií a také fenoménu tzv. degenerace produkčního kmene, kdy produkční kmen po určité době trvání kontinuální kultivace přestane produkovat rozpouštědla a tvoří pouze kyseliny, je realizace klasické kontinuální kultivace obtížná. Možným řešením prvního zmíněného problému je provedení kontinuální kultivace ve dvou stupních, kdy kyselinotvorná a rozpouštědlotvorná fáze probíhají odděleně ve dvou bioreaktorech. Ve srovnání se vsádkovou kultivací se při kontinuální kultivaci dosahuje vyšší produktivity systému, avšak obvykle na úkor nižších koncentrací rozpouštědel a horšího využití dodávaného sacharidu (Ezeji a další 2005). Zlepšením problému toxicity butanolu vůči produkujícím buňkám může být imobilizace buněk v bioreaktoru buď formou tzv. entrapmentu ( uvěznění v matrici polymeru) nebo sorpce na vhodném materiálu. Tím se současně řeší problém nízké koncentrace buněk v reaktoru, lze to však řešit i recirkulací určité části bakteriální populace. Řešením problému inhibice produktem, butanolem, je však zejména integrace separačního kroku s vlastní fermentací. Historickým způsobem izolace a rozdělení směsi produktů, rozpouštědel, je destilace. Přímá destilace butanolu, acetonu a etanolu z prokvašeného média je však velmi energeticky náročná, což je způsobeno vysokým bodem varu butanolu (117oC); je nutno destilovat velké objemy, protože celková konečná koncentrace rozpouštědel i při použití vysokoprodukčních kmenů nepřesahuje 30 g/l. Destilaci navíc komplikuje skutečnost, že butanol tvoří s vodou azeotropickou směs (55 % butanolu a 45 % vody), která má nižší bod varu (93oC) než obě složky této směsi, a proto je nutné využít např. extraktivní destilaci ve vhodném uspořádání (odvodňovací a regenerační kolona), což je způsob také používaný při odvodňování etanolu. Energeticky výhodnějším způsobem je využití dvou destilačních kolon spolu s dekanterem; z první kolony odchází azeotrop o koncentraci butanolu 55%, ten se po ochlazení rozdělí na dvě vrstvy vrchní vrstva je tvořena butanolem v koncentraci 79,9 % a tvoří 71,5% původní azeotropické směsi, zatímco ve spodní vrstvě je koncentrace butanolu pouze 7,7%. Horní vrstva je vedena do druhé kolony, z jejíž paty se získá čistý butanol; z hlavy této druhé kolony odchází azeotropická směs, která je opět vracena do dekanteru. Spodní vrstva se vrací do nástřiku první kolony (Ramey a Yang 2004). Destilace je nezastupitelným krokem při dělení směsi rozpouštědel, je však výhodnější nevyužívat ji jako první separační krok, ale rozpouštědla nejprve izolovat z kultivačního média jiným způsobem a tím je zkoncentrovat. Jako izolační krok, vedoucí jak ke snížení koncentrace rozpouštědel v kultivačním médiu, tak k zakoncentrování rozpouštědel před jejich destilačním rozdělením byly testovány různé metody. Tyto techniky je možné rozdělit do dvou kategorií na separace za pomoci 1377

4 membrán reverzní osmózu, pervaporaci a perstrakci a na separace bez využití membrán stripování plynem, extrakci kapalina-kapalina a sorpci na vhodném materiálu. Jako velmi slibné řešení se momentálně jeví stripování dusíkem nebo přímo fermentačním plynem, odcházejícím z fermentoru. Stripování má řadu výhod ve srovnání s ostatními separačními technikami: je jednoduché, nenáročné a nedochází při něm k problémům se zanášením membrán buňkami nebo jinými součástmi kultivačního média. Pokusy s integrací stripování se vsádkovým nebo přítokovaným procesem fermentace navíc vedly ke zkrácení doby fermentace, k vyšší rychlosti spotřeby sacharidu, k využití veškerých sacharidů i kyselin na tvorbu rozpouštědel a k vyššímu nárůstu biomasy produkčních buněk v bioreaktoru. Při propojení stripování s přítokovanou kultivací bylo dosaženo celkové koncentrace rozpouštědel až 172 g/l (Ezeji a další 2005). Avšak nevýhodou stripování je velká spotřeba energie pro kondenzaci par; energeticky výhodněji vychází sorpce na vhodných materiálech např. na silikalitu (zeolitu). Bylo zjištěno, že spotřeba energie na získání butanolu je v tomto případě cca 3x nižší než u stripování a cca 2x nižší než u pervaporace (Qureshi a další 2005). V nedávné době byl zveřejněn způsob produkce butanolu, snažící se v sobě kombinovat všechna výše popsaná slibná řešení, týkající se jak fermentačního procesu, tak izolace a purifikace produktu (Ramey a Yang 2004). Tento způsob spočívá ve dvoustupňové kontinuální kultivaci, kdy v prvním stupni je vytvářena zejména kyselina máselná pomocí kyselinotvorného kmene Clostridium tyrobutyricum. Konečnými produkty fermentace sacharidů u této bakterie jsou normálně hlavně kyseliny máselná a octová (viz Obr.1), jelikož však tato bakterie také patří mezi tzv. heterofermentativní mikroorganismy tvoří se v malém množství i další produkty např. kyselina mléčná a také fermentační plyny oxid uhličitý a vodík. Ve zmiňované práci (Ramey a Yang 2004) byl u kmene Clostridium tyrobutyricum knokautován známý gen pro produkci kyseliny octové (do funkčního genu byla vmezeřena cizí sekvence DNA, zabraňující normálnímu přepisu daného genu), aby se zvýšila produkce kyseliny máselné. Tento genetický zásah však bohužel nevedl k naprosté eliminaci tvorby kyseliny octové, avšak dosáhlo se určitého zvýšení produkce kyseliny máselné za cenu prodloužení kultivační doby. Fermentační médium obsahující kyselinu máselnou je vedeno do druhého bioreaktoru, kde se kyselina máselná využívá bakteriemi Clostridium acetobutylicum na produkci butanolu. I do tohoto druhého stupně je však třeba dodávat sacharid a vytváří se samozřejmě nejen butanol, ale i aceton v proměnlivém poměru 3:1 až 2:1. Druhý fermentační stupeň se odehrává v bioreaktoru s tzv. vláknitým ložem, kde jsou buňky imobilizovány na vlákna polymerního materiálu a je integrován s odstraňováním rozpouštědel stripováním pomocí oxidu uhličitého. Butanol se ze zakoncentrovaného roztoku rozpouštědel separuje pomocí destilace, kombinované s dekantací, jak je popsáno výše v textu. Jako surovina byla využita syrovátka, která je velmi levným zdrojem sacharidu, laktosy, který je dobře využíván oběma druhy bakterií. Přes to, že autoři, Ramey a Yang, počítali s brzkou realizací tohoto způsobu výroby butanolu v průmyslovém měřítku, dosud k tomu nedošlo. V loňském roce se konaly dvě mezinárodní konference, zabývající se problematikou biopaliv: Bioenergy 2008: Challenges and Opportunities, která se konala v dubnu, v portugalském městě Guimaraes a Clostridium 10: The 10th Workshop on the Genetics and Physiology of Acid and Solvent Producing Clostridia, konanou v září, ve Wageningen, v Holandsku. Zatímco na té první se řešila problematika produkce bioetanolu, biodieselu a bioplynu a panovala na ní velká skepse ohledně reálné možnosti skutečně naplnit Evropskou unií vytyčenou kvótu a do roku 2020 nahradit 20% pohonných hmot bioetanolem, na té druhé vládl velký optimismus ohledně spuštění průmyslové výroby biobutanolu ve skutečně velkém měřítku. Kromě akademických výzkumníků se této konference zúčastnilo i několik menších firem, zabývajících se výzkumem technologie výroby biobutanolu např. americká firma Cobalt Biofuels nebo anglická firma Green Biologics. Většina přednášek nešla do detailů a neodkrývala všechna důležitá data, téměř všichni se však shodovali v názoru, že spuštění 1378

5 ekonomicky rentabilní produkce biobutanolu je doslova na spadnutí. Ostatně stejný dojem vyvolávají webové stránky firem DuPont a British Petrol, které již poslední 2-3 roky oznamují, že spustí poloprovoz a brzy také výrobu biobutanolu. Velmi zajímavé bylo také vystoupení prof. Davida Jonese z Nového Zélandu, který dlouhá léta pracoval v Jihoafrické republice na problematice biobutanolu; v JAR totiž fungoval až do 80.let minulého století poslední velký závod na výrobu biobutanolu v západním světě. Prof. Jones se v loňském roce podílel na otevření nového malého závodu, zřejmě spíše na úrovni poloprovozu, v Brazílii. Tento závod vyrábí biobutanol tradičním způsobem tj vsádkovou kultivací z cukrové třtiny, na níž navazuje destilace jako separační krok a dosahuje se zde max. koncentrací biobutanolu kolem 20g/l. Dále na konferenci v Holandsku vystoupili zástupci Čínské akademie věd, kteří přednesli, že v Číně se v několika provozech biobutanol tradičním způsobem stále vyrábí a objemy roční produkce jsou v řádu statisíců tun, přičemž Čína plánuje v následujících třech letech výrobu 10x navýšit. Jisté je, že v Číně jsou s výzkumem produkce biobutanolu opravdu daleko, což potvrzuje i na podzim loňského roku podepsaná dohoda mezi firmou DuPont a čínskou stranou o vybudování zkušebního poloprovozu na výrobu biobutanolu v Číně, v tomto roce. Velkou podporu výzkumu produkce biobutanolu věnovala také americká vláda (viz např. již citovaná zpráva Ramey a Yang 2004). Hlavními překážkami ekonomicky rentabilní výroby biobutanolu jsou množství bakteriemi produkovaných látek a nízká koncentrace butanolu. Bohužel však ani jeden z těchto problémů není jednoduše řešitelný; klostridia jsou vývojově velmi starými mikroorganismy a za dobu své existence si vybudovaly vynikající strategii pro přežití založenou na vysokém stupni regulace komplexních metabolických drah, vedoucích k široké diverzifikaci produktů, tvorbě spor a možnosti využívat široké spektrum různých substrátů pro svou výživu. Z hlediska technologie výroby butanolu je výhodou pouze poslední ze jmenovaných fenoménů. Přestože jsou známé kompletní sekvence DNA pro dokonce dva druhy bakterií, tvořících rozpouštědla, Clostridium acetobutylicum a Clostridium beijerinckii, pokusy směřující ke genetické úpravě klostridií vedoucí k omezení tvorby široké palety produktů, byly úspěšné jen částečně a obvykle na úkor zhoršení růstu nebo nižší dosahované koncentrace butanolu. Toxicita a stresový vliv butanolu na klostridia byly studovány za pomoci tzv. DNA čipů, moderních nástrojů genového inženýrství, umožňujících současně sledovat aktivitu až stovek různých genů. Při tomto výzkumu bylo zjištěno, že vyšší koncentrace butanolu v kultivačním médiu působí změnu aktivity ve 200 různých genech (Tomas a další 2004) a zřejmě z tohoto důvodu dosud nebyl připraven ani klasickými mutacemi, ani genovým zásahem, mikroorganismus skutečně odolný vůči vyšším koncentracím butanolu. Důležitým faktorem, ovlivňujícím ekonomiku celého procesu, je volba vhodné suroviny pro aceton-butanolové kvašení; uvádí se, že cena suroviny se podílí na provozních nákladech na výrobu butanolu až 40%. V současnosti se zmiňuje, že z tzv. tradičních surovin je nejekonomičtější využití cukrové třtiny, v Evropě pak cukrové řepy, protože tyto plodiny vykazují vyšší účinnost fotosyntézy a tím mají obvykle i vyšší hektarový výnos ve srovnání s obilninami, kukuřicí a bramborami. Dále je určitě, alespoň v určitých lokalitách, zajímavé využití syrovátky, jako odpadu mlékárenského průmyslu. Pro výrobu biopaliv tzv. druhé generace se předpokládá využití nepotravinářských plodin, energetických dřevin, trav, odpadů ze zemědělství a lesnictví jako je sláma, kukuřičné oklasky, kůra a dřevní štěpka. Tyto materiály však obsahují jako využitelný zdroj sacharidů celulosu, která není klostridiemi přímo využitelná. I na tomto poli probíhá intenzivní výzkum, protože jiné druhy klostridií, které však netvoří rozpouštědla, dokážou celulosu přímo využívat. Dosud však žádný úspěch v této oblasti, tj pomocí genové manipulace upravený kmen bakterií schopný růst na celulose a tvořit rozpouštědla, zveřejněn nebyl. Proto je nutné celulosové materiály, po mechanické předúpravě, štěpit na glukosu a další stravitelné sacharidy (v případě hemicelulos a 1379

6 lignocelulozy) pomocí kombinace různých zásahů jako je např. alkalická a kyselá hydrolýza, parní expanze, exploze vláken za použití amoniaku, vaření a parní expanze za použití oxidu siřičitého, extrakce pomocí rozpouštědel, extruze nebo oxidace mokrou cestou. Nevýhodou většiny uvedených metod je jejich vysoká energetická náročnost a také častý vznik látek inhibujících růst a produkci mikroorganismů, které je často nutné z hydrolyzovaného materiálu odstraňovat. V dnešní době jsou již na trhu také enzymové preparáty s různými celulolytickými aktivitami, které umožňují štěpení částečně předupraveného lignocelulosového materiálu na monosacharidy. Hlavními problémy, které brání masivnímu použití celulolytických enzymů, jsou cena, nutnost použití velké dávky enzymatického preparátu (až 0,5 g enzymu na 1g celulosového materiálu), doba nutná pro štěpení (optimální doporučovaná doba působení 72h) a existence zpětnovazebné inhibice enzymových aktivit uvolňovanou glukosou. Je tedy zřejmé, že lignocelulozové hydrolyzáty jsou, doufejme, slibným zdrojem sacharidů pro produkci butanolu, avšak spíše v budoucnosti, protože i v této oblasti ještě zbývá řada problémů k řešení. Dalším problémem, který dále nerozebíráme je i velké množství odpadu, tj. minimálně na úrovni výroby etanolu (a to za předpokladu zvládnuté integrace fermentačního procesu a separace produktů). Závěrem lze shrnout, že na výrobě biobutanolu se intenzivně pracuje na celém světě a je naděje, že v brzké budoucnosti se dočkáme vyřešení všech zásadních problémů, které zatím činí průmyslovou produkci butanolu kvasným způsobem nekonkurenceschopnou s chemickou výrobou butanolu z ropy. Vzorem nám v tomto případě mohou být naši předkové, kteří butanol a aceton dokázali fermentačně a se ziskem vyrábět již před sto lety. Je to ovšem i otázka politická, vzhledem k tomu, že nelze zodpovědně předvídat vývoj cen ropy v budoucnosti; pokud by cena ropy rostla tempem, kterého jsme byli svědky v poslední době, s výjimkou posledního cca půl roku, kdy propukla celosvětová ekonomická krize, byla by výroba biobutanolu rentabilní již brzy. Nicméně je zřejmé, že biopaliva mohou nahradit jen malou část fosilních paliv a patrně ještě řadu let bude cena fosilních paliv nižší a biopaliva bude nutno dotovat státem na základě určitých ekologických direktiv. Avšak je politicky předvídavé mít připravenu nějakou alternativu pro případ, že by k nám ropa snad z nějakého důvodu přestala proudit. Zde je možné poukázat na leden letošního roku a problémy s dodávkami zemního plynu. Tato studie byla zpracována s finanční podporou projektu NAZV č. QH81323/2008 a výzkumného záměru MŠM Literatura: Dürre P. and Bahl H. Microbial production of acetone/butanol/isopropanol pp in Biotechnology eds H.-J. Rehm and G.Reed, VCH Weinheim Ezeji T.C., Qureshi N., Blaschek H.P.: Industrially relevant fermentations pp v Handbook on Clostridia ed. P. Dürre (2005), CRC Press, Boca Raton. Jones, D.T. and Woods, D.R. Acetone-Butanol Fermentation Revisited. Microbial. Rew. 1986, 50 (4), Qureshi N., Hughes S., Maddox I.S. and Cotta M.A. Energy-efficient recovery of butanol from model solutions and fermentation broth by adsorption. Bioprocess Biosyst. Eng. 2005, 27(4), Ramey, D. And Yang S-T. Production of butyric acid and butanol from biomass. Final report of work performed under contract No.:DE-F-G02-00ER86106 for U.S. Department of Energy, Ohio, USA (2004). Ravagnani A., Jennert K.C.B., Steiner E., Grünberg R., Jefferies J.R., Wilkinson S.R., Young D.I., Tidswell E.C., Brown D.P., Youngman P., Morris J.G. and Young M. Spo0A directly controls the switch from acid to solvent production in solvent-forming clostridia. Mol. Microbiol. 2000, 37(5), Tomas C.A., Beamish J. And Papoutsakis E.T. Transcriptional analysis of butanol stress and tolerance in Clostridium acetobutylicum. J. Bacteriol. 2004, 186(7),