cobas Cdiff Test Pro účely diagnostiky in vitro pro použití na systému cobas 4800 cobas 4800 System Sample Preparation Kit

Transkript

1 pro použití na systému cobas 4800 Pro účely diagnostiky in vitro cobas 4800 System Sample Preparation Kit cobas 4800 System Lysis Kit 1 cobas 4800 System Wash Buffer Kit 240 Tests 960 Tests 240 Tests 960 Tests 240 Tests 960 Tests P/N: P/N: P/N: P/N: P/N: P/N: cobas 4800 System Internal Control Kit 1 20 Runs P/N: cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit 80 Tests 240 Tests P/N: P/N: cobas 4800 Cdiff Controls and Cofactor Kit 10 Runs P/N:

2 OBSAH Účel použití... 4 Souhrn a výklad testu / Principy postupu Základní informace: Skríning C. difficile... 4 Princip testu... 5 Principy postupu... 5 Příprava vzorků... 5 PCR amplifikace a detekce pomocí TaqMan... 5 Selektivní amplifikace... 6 Materiály, činidla a vzorky Materiály a činidla, která jsou součástí dodávky... 7 Skladování a manipulace s činidly Další potřebný materiál Volitelné materiály Potřebné vybavení a software, které není součástí dodávky Bezpečnostní opatření a požadavky na manipulaci Upozornění a bezpečnostní pokyny Správná laboratorní praxe Kontaminace Integrita Likvidace Rozlití a čištění Odběr, přeprava a skladování vzorků Postup testu Výsledky Odběr vzorků Přeprava, skladování a stabilita vzorků Spuštění testu Pracovní postup Návod k použití Kontrola kvality a platnosti výsledků Pozitivní kontrola Negativní kontrola Doc. Rev

3 Vnitřní kontrola Interpretace výsledků PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ Hodnocení neklinických funkčních parametrů Analytická citlivost Detekce genotypů C. difficile Přesnost Analytická specificita Interference Korelace Doplňující informace Hlavní parametry testu Symboly Výrobce a distributoři Obchodní značky a patenty Autorská práva (Copyright) Literatura Revize dokumentu Doc. Rev

4 Účel použití Test cobas Cdiff na systému cobas 4800 je automatizovaný, kvalitativní diagnostický test in vitro, který využívá polymerázovou řetězovou reakci (PCR) v reálném čase pro přímou detekci genu toxinu B (tcdb) toxikogenního Clostridium difficile (C. difficile) v kašovitých (tekutých nebo měkkých) vzorcích stolice od pacientů s podezřením na infekci C. difficile (CDI). Test cobas Cdiff je určen k použití jako pomůcka při diagnostice CDI u pacientů ve spojení s klinickými a epidemiologickými faktory. Souhrn a výklad testu / Principy postupu Základní informace: Skríning C. difficile C. difficile je grampozitivní, anaerobní bakterie vytvářející spory, která byla rozpoznaná jako etiologický původce pseudomembranózní kolitidy spojené s léčbou antibiotiky v druhé polovině 70. let minulého století. 1,2 Předpokládá se, že je příčinou % průjmů spojených s léčbou antibiotiky a téměř všech případů pseudomembranózních kolitid spojených s léčbou antibiotiky. 3 V průběhu posledních 10 let počet případů spojených s infekcí C. difficile (CDI) progresivně vzrostl a infekce se nyní stává závažným klinickým problémem v rozvinutých zemích. V minulosti se v nemocnicích s akutní péčí v USA vyskytovalo případů na obyvatel; v roce 2005 vzrostl počet případů na 80 na obyvatel. 4 Již dříve byla popsána propuknutí CDI. 5 Přímý náklad spojený s léčbou CDI dosahoval v USA USD na jeden případ. 6 Nárůst případů je částečně připisován vzniku údajně vysoce virulentního kmene klasifikovaného jako ribotyp 027/severoamerický pulsotyp 1 (NAP1) a toxinotyp III. Toxikogenní kmeny C. difficile typicky vytvářejí dva toxiny: toxin A (enterotoxin) a toxin B (cytotoxin). 7 Toxin B vytváří pouze malé procento kmenů. 8 V poslední době byla popsána virulence u kmenů, které produkují jiný toxin zvaný binární toxin a mají deleci v negativním regulačním tcdc genu. 9,10 U těchto kmenů byla zjištěna vyšší virulentnost in vitro a zdá se, že u lidí způsobují vyšší nemocnost a úmrtnost. 11,12 Jedinec se po kolonizaci toxikogenním C. difficile může stát asymptomatickým nosičem nebo se u něho může rozvinout střevní onemocnění. Klinické projevy CDI sahají od mírného průjmu po život ohrožující pseudomembranózní kolitidu doprovázenou bolestí břicha, silným průjmem a systémovými příznaky jako jsou horečka, anorexie, nevolnost a malátnost. Diagnóza CDI se většinou provádí průkazem na přítomnost toxinu A a/nebo B ve vzorcích stolice. Za zlatý standard mnozí považují cytopatický účinek toxinu B na buněčnou linii. 13, 14 Průkazu cytopatického účinku lze dosáhnout přímou inkubací supernatantu stolice; alternativně je možné izoláty C. difficile kultivovat v bujonové kultuře a získaný supernatant použít pro další inkubaci na buněčné linii (toxikogenní kultura). 15 U obou technik je dostupnost konečného výsledku minimálně po 48 až 72 hodinách. Nejvíce se pro průkaz toxinu A a toxinu B používá enzymová imunoanalýza, protože poskytne pozitivní výsledky do 4 hodin; nicméně citlivost je mnohem nižší než u tkáňové kultury. 16 Při srovnání s klinickými kritérii podporujícími CDI byly u PCR zjištěny citlivost 93,3 %, specificita 97,4 %, pozitivní prediktivní hodnota 75,5 % a negativní prediktivní hodnota 99,4 % s dobou získání výsledku <4 hodiny. 15 PCR se považuje za optimální rychlý jednoduchý test průkazu přítomnosti toxinu C. difficile I přes dramatický nárůst incidence a závažnosti CDI zůstávají léčbou volby u akutních epizod a rekurentních infekcí metronidazol nebo vankomycin. 21 Doc. Rev

5 Mezi opatření zamezení infekce patří uvážlivé používání bakteriostatik, prevence zkřížené infekce a aktivní sledování případů. 22 Opakované otestování léčby se nedoporučuje, protože toxiny mohou být dlouho přítomné i bez klinických příznaků. Proto vzniká velká potřeba vysoce citlivého a rychlého automatizovaného průkazu C. difficile. Molekulární metody nabízí potenciál značně zkrácené doby detekce a následně časně zahájené antimikrobiální léčby a časné implementace opatření pro kontrolu infekce Princip testu Test cobas Cdiff zahrnuje dva hlavní postupy: (1) automatizovaná příprava vzorků pro extrakci nukleových kyselin z kašovitých vzorků stolice; (2) PCR amplifikace cílových sekvencí DNA pomocí primerů specifických pro C. difficile a detekce rozštěpených fluorescenčních C. difficile specifických oligonukleotidových detekčních sond v reálném čase. Interní kontrola obsahující nesouvisející randomizovanou sekvenci DNA se přidává do všech vzorků před automatizovanou přípravou vzorků a je amplifikována a detekována současně s každým vzorkem a monitoruje tak celý proces. Principy postupu Příprava vzorků Příprava vzorku testu cobas Cdiff je automatizována díky použití zařízení cobas x 480. Organizmy jsou rozštěpeny chaotropním činidlem, proteinázou K a činidly SDS. Uvolněné nukleové kyseliny spolu s přidanou DNA interní kontroly jsou navázány na magnetické skleněné částice. Tyto jsou promyty a poté eluovány v malém množství pufru. Zařízení poté vezme alikvotní část eluovaného materiálu a připraví PCR reakci pomocí aktivovaného činidla Master Mix. PCR amplifikace a detekce pomocí TaqMan Kroky cyklu PCR a detekce cílového signálu probíhají na analyzátoru cobas z 480. Činidlo Master Mix obsahuje páry primerů a sond, které jsou specifické pro dva cíle: jak pro toxin B, tak i pro vnitřní kontrolu. Pokud jsou přítomny cílové sekvence nukleové kyseliny, dojde k amplifikaci odpovídajícími primery termostabilní polymerázou DNA, čímž se vytvoří produkty PCR (amplikon). Tyto produkty jsou detekovány specifickými sondami TaqMan obsahujícími fluorescenční barvivo a tlumicí barvivo. Za normálních okolností tlumicí barvivo potlačí fluorescenci barviva. Pokud je však přítomen produkt PCR, sonda se hybridizuje na produkt a rozštěpí se 5' až 3' nukleázovou aktivitou polymerázy. Tato reakce umožňuje fluorescenci barviva a tento signál je zaznamenán v reálném čase každého cyklu PCR analyzátorem cobas z 480. Signál je interpretován softwarem systému cobas 4800 a hlášen jako konečné výsledky. Doc. Rev

6 Selektivní amplifikace Selektivní amplifikace cílové nukleové kyseliny ze vzorku se dosahuje v testu cobas Cdiff použitím enzymu AmpErase (uracil-n-glykosylázy) a deoxyuridin-trifosfátu (dutp). Enzym AmpErase rozpoznává a katalyzuje destrukci vláken DNA obsahujících deoxyuridin 23, ale vynechává DNA obsahující deoxythymidin. Deoxyuridin se v přirozené DNA nevyskytuje, je však vždy přítomen v amplikonu díky tomu, že se jako jeden z dntp v činidle Master Mix místo thymidintrifosfátu používá deoxyuridintrifosfát; proto je deoxyuridin obsažen pouze v amplikonu. V důsledku přítomnosti deoxyuridinu je kontaminující amplikon citlivý vůči destrukci enzymem AmpErase před amplifikací cílové DNA. Enzym AmpErase, který je obsažen ve směsi činidla Master Mix, katalyzuje štěpení DNA obsahující deoxyuridin v místě deoxyuridinového zbytku rozevřením deoxyribozového řetězce v pozici C1. Když je řetězec amplikonové DNA v prvním tepelně cyklizačním kroku při alkalickém ph směsi činidla Master Mix zahříván, štěpí se v poloze deoxyuridinu, čímž se DNA stává neamplifikovatelnou. Enzym AmpErase je při teplotách nad 55 C, tj. během fází tepelného cyklu, neaktivní, a proto cílový amplikon nerozkládá. Bylo prokázáno, že test cobas Cdiff inaktivuje nejméně 1000 kopií amplikonů C. difficile obsahujících deoxyuridin na PCR. Doc. Rev

7 Materiály, činidla a vzorky Materiály a činidla, která jsou součástí dodávky Soupravy/Kazety Součásti a složky činidel Množství na test Bezpečnostní symboly a varování Xi 93 % (hm.) Isopropanol MGP cobas 4800 System Sample Preparation Kit Souprava pro přípravu vzorků pro systém cobas testů (P/N: ) (Magnetické skleněné částice pro systém cobas 4800) Magnetické skleněné částice 93 % Isopropanol EB (Eluční pufr pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 0,09 % azid sodný 10 x 4,5 ml 10 x 18 ml Dráždivý F 93 % (hm.) Isopropanol Vysoce hořlavý R: , S: /25-26 N/A Xi 93 % (hm.) Isopropanol MGP cobas 4800 System Sample Preparation Kit Souprava pro přípravu vzorků pro systém cobas testů (P/N: ) (Magnetické skleněné částice pro systém cobas 4800) Magnetické skleněné částice 93 % Isopropanol EB (Eluční pufr pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 0,09 % azid sodný 10 x 13,5 ml 10 x 18 ml Dráždivý F 93 % (hm.) Isopropanol Vysoce hořlavý R: , S: /25-26 N/A Doc. Rev

8 Soupravy/Kazety Součásti a složky činidel Množství na test Bezpečnostní symboly a varování cobas 4800 System Lysis Kit 1 Souprava 1 s lytickým pufrem pro systém cobas testů (P/N: ) LYS-1 (Lytický pufr 1 pro systém cobas 4800) Citrát sodný 5 % Polydokanol 42,6 % guanidin thiokyanát Dithiothreitol PK (Proteináza K pro systém cobas 4800) Tris pufr EDTA Chlorid vápenatý Octan vápenatý < 2,0 % proteináza K Glycerin SDS (SDS činidlo pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl Dodecyl sulfát sodný 0,09 % azid sodný 10 x 24 testů 10 x 0,9 ml 10 x 3 ml Nebezpečí H302 Zdraví škodlivý při požití. H317 Může vyvolat alergickou kožní reakci. H318 Způsobuje vážné poškození očí. H334 Při vdechování může vyvolat příznaky alergie nebo astmatu nebo dýchací potíže. H412 Škodlivý pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. EUH032 Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. P261 Zamezte vdechování prachu/ dýmu/plynu/mlhy/par/aerosolů. P264 Po manipulaci důkladně omyjte. P270 Při používání tohoto výrobku nejezte, nepijte ani nekuřte. P272 Kontaminovaný pracovní oděv neodnášejte z pracoviště. P273 Zabraňte uvolnění do životního prostředí. P280 Používejte ochranné rukavice/ ochranný oděv/ochranné brýle/ obličejový štít. P285 V případě nedostatečného větrání používejte vybavení pro ochranu dýchacích cest. P301 + P312 PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P302 + P352 PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím vody a mýdla. P304 + P341 PŘI VDECHNUTÍ: Při obtížném dýchání přeneste postiženého na čerstvý vzduch a ponechte jej v klidu v poloze usnadňující dýchání. P305 + P351 + P338 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. P310 Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P330 Vypláchněte ústa. P333 + P313 Při podráždění kůže nebo vyrážce: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. P363 Kontaminovaný oděv před opětovným použitím vyperte. Doc. Rev

9 Soupravy/Kazety Součásti a složky činidel Množství na test Bezpečnostní symboly a varování cobas 4800 System Lysis Kit 1 Souprava 1 s lytickým pufrem pro systém cobas testů (P/N: ) LYS-1 (Lytický pufr 1 pro systém cobas 4800) Citrát sodný 10 x 96 testů 5 % Polydokanol 42,6 % guanidin thiokyanát Dithiothreitol PK (Proteináza K pro systém cobas 4800) Tris pufr EDTA Chlorid vápenatý 10 x 1,2 ml Octan vápenatý < 2,0 % proteináza K Glycerin SDS (SDS činidlo pro systém cobas 4800) Pufr Tris-HCl 10 x 9 ml Dodecyl sulfát sodný 0,09 % azid sodný Nebezpečí H302 Zdraví škodlivý při požití. H317 Může vyvolat alergickou kožní reakci. H318 Způsobuje vážné poškození očí. H334 Při vdechování může vyvolat příznaky alergie nebo astmatu nebo dýchací potíže. H412 Škodlivý pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. EUH032 Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. P261 Zamezte vdechování prachu/ dýmu/plynu/mlhy/par/aerosolů. P264 Po manipulaci důkladně omyjte. P270 Při používání tohoto výrobku nejezte, nepijte ani nekuřte. P272 Kontaminovaný pracovní oděv neodnášejte z pracoviště. P273 Zabraňte uvolnění do životního prostředí. P280 Používejte ochranné rukavice/ ochranný oděv/ochranné brýle/ obličejový štít. P285 V případě nedostatečného větrání používejte vybavení pro ochranu dýchacích cest. P301 + P312 PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P302 + P352 PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím vody a mýdla. P304 + P341 PŘI VDECHNUTÍ: Při obtížném dýchání přeneste postiženého na čerstvý vzduch a ponechte jej v klidu v poloze usnadňující dýchání. P305 + P351 + P338 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. P310 Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P330 Vypláchněte ústa. P333 + P313 Při podráždění kůže nebo vyrážce: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. P363 Kontaminovaný oděv před opětovným použitím vyperte. Doc. Rev

10 Soupravy/Kazety Součásti a složky činidel Množství na test Bezpečnostní symboly a varování cobas 4800 System Wash Buffer Kit Souprava promývacího pufru pro systém cobas testů (P/N: ) cobas 4800 System Wash Buffer Kit Souprava promývacího pufru pro systém cobas testů (P/N: ) cobas 4800 System Internal Control Kit 1 Souprava 1 vnitřní kontroly systému cobas cyklů (P/N: ) WB (Promývací pufr pro systém cobas 4800) Dihydrát citrátu sodného 0,05 % N-metylizotiazolon HCl WB (Promývací pufr pro systém cobas 4800) Dihydrát citrátu sodného 0,05 % N-metylizotiazolon HCl IC-1 (cobas 4800 IC-1) Tris pufr EDTA < 0,01 % Poly ra RNA (syntetická) 0,05 % azid sodný < 0,01 % neinfekční, syntetická DNA vnitřní kontroly zapouzdřená v bílkovině s bakteriofágním obalem Lambda 10 x 55 ml 10 x 200 ml 20 cyklů N/A N/A N/A Cdiff MMX N/A (Cdiff Master Mix pro cobas ) Tricinový pufr EDTA DMSO cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit Souprava pro amplifikaci/detekci Cdiff pro systém cobas 4800 Octan draselný Hydroxid draselný Tween 20 < 0,19 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01 % upstream a downstream primery C. difficile a vnitřní kontroly 10 x 8 testů 80 testů (P/N: ) < 0,01 % fluorescenčně značené sondy C. difficile a vnitřní kontroly < 0,01 % oligonukleotidový aptamer < 0,01 % Z05 DNA polymeráza (mikrobiální) < 0,02 % enzym AmpErase (uracil-nglykosyláza) (mikrobiální) 0,09 % azid sodný Doc. Rev

11 Soupravy/Kazety Součásti a složky činidel Množství na test Bezpečnostní symboly a varování Cdiff MMX N/A (Cdiff Master Mix pro cobas ) Tricinový pufr EDTA DMSO cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit Souprava pro amplifikaci/detekci Cdiff pro systém cobas 4800 Octan draselný Hydroxid draselný Tween 20 < 0,19 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01 % upstream a downstream primery C. difficile a vnitřní kontroly 10 x 24 testů 240 testů (P/N: ) < 0,01 % fluorescenčně značené sondy C. difficile a vnitřní kontroly < 0,01 % oligonukleotidový aptamer < 0,01 % Z05 DNA polymeráza (mikrobiální) < 0,02 % enzym AmpErase (uracil-nglykosyláza) (mikrobiální) 0,09 % azid sodný cobas 4800 Cdiff Controls and Cofactor Kit Souprava kontrol a kofaktorů Cdiff pro zařízení cobas cyklů (P/N: ) Cdiff (+) C (Pozitivní kontrola Cdiff cobas ) Tris pufr EDTA < 0,01 % Poly ra RNA (syntetická) 0,05 % azid sodný < 0,01 % neinfekční plazmid DNA (mikrobiální) obsahující sekvenci C. difficile ( ) C (Negativní kontrola pro systém cobas 4800) Tris pufr EDTA 0,05 % azid sodný < 0,01 % Poly ra RNA (syntetická) Cofactor-3 (Kofaktor-3 cobas 4800) Octan manganatý Octan hořečnatý Albumin bovinního séra z bovinní plazmy z USA 0,09 % azid sodný 10 sad 10 sad 10 cyklů N/A N/A N/A Doc. Rev

12 Skladování a manipulace s činidly Činidlo Skladovací teplota Doba skladování cobas 4800 System Sample Preparation Kit Souprava pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800 cobas 4800 System Lysis Kit 1 Souprava 1 s lytickým pufrem pro systém cobas 4800 cobas 4800 System Internal Control Kit 1 Souprava 1 vnitřní kontroly systému cobas 4800 cobas 4800 Cdiff Amplification/Detection Kit Souprava pro amplifikaci/detekci Cdiff pro systém cobas 4800 cobas 4800 Cdiff Controls and Cofactor Kit Souprava kontrol a kofaktorů Cdiff pro zařízení cobas 4800 cobas 4800 System Wash Buffer Kit Souprava promývacího pufru pro systém cobas C Stabilní do uvedeného data použitelnosti 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti C Stabilní do uvedeného data použitelnosti Poznámka: Činidla nezmrazujte. Datum použitelnosti činidla je vytvořeno na základě koordinovaného univerzálního času (UTC). Místní čas data použitelnosti činidla může být upraven až o plus nebo mínus 12 hodin, podle místního časového pásma vůči UTC. Další potřebný materiál Materiál P/N Špičky CORE, 1000 µl, stojan s 96 ks Zásobník na činidla 50 ml Zásobník na činidla 200 ml Extrakční destička pro systém cobas 4800 (s hlubokými jamkami) Mikrotitrační destička a zalepovací fólie pro systém cobas 4800, destička 0,3 ml a zalepovací fólie Aplikátor zalepovací fólie Nosič s 24 pozicemi Pytel na pevný odpad (malý) nebo (velký) Plastová skluzavka na odpad Hamilton STAR Souprava s médiem cobas PCR a vzorky s výtěry Rukavice na jedno použití bez pudru Jakékoliv rukavice na jedno použití bez pudru. Vortex mixer (pro jednu zkumavku) Jakýkoliv vířivý mixér. Centrifuga s kyvnou nádobou rotoru s min. otáčkami 1500 Jakákoliv vhodná centrifuga. Více informací ohledně samostatně prodávaných materiálů získáte u svého místního zástupce společnosti Roche. Doc. Rev

13 Volitelné materiály Materiál P/N Zalepovací fólie nebo kryt destičky s hlubokými jamkami Roche nebo Hamilton Uzávěry, neutrální barva (pro opětovné uzavření vzorků po zpracování) Sarstedt Více informací ohledně volitelných materiálů získáte u svého místního zástupce společnosti Roche. Potřebné vybavení a software, které není součástí dodávky Potřebné vybavení a software, které není součástí dodávky Systém cobas 4800 Zařízení cobas x 480 Analyzátor cobas z 480 Řídicí jednotka Software cobas Cdiff AP pro systém cobas 4800 verze nebo vyšší Aplikační software (hlavní) pro systém cobas 4800 verze nebo vyšší Více informací ohledně samostatně prodávaných materiálů získáte u svého místního zástupce společnosti Roche. Bezpečnostní opatření a požadavky na manipulaci Upozornění a bezpečnostní pokyny Jak je tomu při každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké analytické citlivosti testu je třeba dbát opatrnosti, aby mezi činidly, vzorky a amplifikačními směsmi nedošlo ke kontaminaci. Pouze pro účely diagnostiky in vitro. Zamezte mikrobiální a DNA kontaminaci činidel a vzorků. Bezpečnostní listy (SDS) zašle na vyžádání Vaše místní pobočka společnosti Roche. Činidlo LYS-1 obsahuje guanidinthiokyanát. Nesmí dojít k přímému kontaktu guanidinthiokyanátu a chlornanu sodného (bělicí prostředek) nebo jiných vysoce reaktivních činidel jako jsou kyseliny nebo zásady. Z těchto směsí by se mohl uvolňovat škodlivý plyn. MGP obsahuje isopropanol a je vysoce hořlavý. Uchovávejte mimo otevřený oheň a prostředí, ve kterém se mohou vytvářet jiskry. Zamezte expozici MGP vůči zdrojům magnetického pole. EB, Cdiff MMX, SDS, Cofactor-3, ( )C, Cdiff (+)C a IC-1 obsahují azid sodný. Doc. Rev

14 Další varování, upozornění a postupy pro snížení nebezpečí kontaminace zařízení cobas x 480 nebo analyzátoru cobas z 480 najdete v příslušné příručce systému pro systém cobas Pokud existuje podezření na kontaminaci, proveďte čištění a týdenní údržbu dle popisu v příslušné příručce systému pro systém cobas Pozn.: Konkrétní pokyny viz Odběr, přeprava a skladování vzorků. Správná laboratorní praxe Nepipetujte ústy. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Po práci se vzorky a činidly si důkladně umyjte ruce. Při práci s jakýmikoliv činidly používejte rukavice na jedno použití, pracovní oděv a ochranné brýle. Dbejte na to, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud by byla tato opatření zanedbána, může dojít k popáleninám. Pokud dojde k rozlití, zřeďte je před vytřením dosucha vodou. Všechny pracovní plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v destilované nebo deionizované vodě (zředěný bělicí prostředek pro domácnosti 1:10). Dále povrch otřete 70% etanolem. Kontaminace Je nutné nosit rukavice. Aby nedošlo ke kontaminaci, musí se rukavice vyměnit mezi manipulací se vzorky a manipulací s činidly cobas Cdiff. Zabraňte kontaminaci rukavic při manipulaci se vzorky a kontrolami. Při práci se vzorky a soupravami činidel používejte laboratorní rukavice, laboratorní pláště a ochranné brýle. Zamezte mikrobiální a ribonukleázové kontaminaci činidel. Pokud se během zacházení se vzorkem nezabrání kontaminaci vzorků, mohou být získány falešně pozitivní výsledky. Manipulace se vzorky se musí řídit pravidly pro zacházení s infekčním materiálem. Musí být používány bezpečné laboratorní postupy, např. postupy uvedené v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 24 a v dokumentu CLSI M29-A4. 25 Integrita Nepoužívejte soupravy po uplynutí data použitelnosti. Činidla nemíchejte. Položky k jednorázovému použití nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti. Všechny položky k jednorázovému použití použijte jen jednou. Pufr znovu nepoužívejte. Veškeré vybavení je nutné řádně udržovat podle pokynů výrobce. Doc. Rev

15 Likvidace Činidla pro systém cobas 4800 a činidla specifická pro test cobas Cdiff obsahují azid sodný (viz Upozornění a bezpečnostní pokyny ). Ten může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a vytvářet vysoce explozivní kovové azidy. Při likvidaci roztoků obsahujících azid sodný do laboratorního umyvadla propláchněte odtok velkým množstvím studené vody, abyste tak zabránili vytváření azidů. Nespotřebovaná činidla a odpad likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy. Pozn.: Likvidace kapalného odpadu viz příslušná příručka systému pro systém cobas Rozlití a čištění Činidlo LYS-1 obsahuje guanidinthiokyanát. Pokud se kapalina obsahující guanidinthiokyanát rozlije, postižené místo vyčistěte vodou s vhodným laboratorním detergentem. Jestliže rozlitá kapalina obsahuje potenciálně infekční látky, vyčistěte místo NEJPRVE vodou s vhodným laboratorním detergentem a potom 0,5% chlornanem sodným. Pokud dojde k rozlití kapaliny na zařízení cobas 4800, řiďte se při čištění pokyny v příslušné příručce systému pro systém cobas K čištění zařízení cobas x 480 nebo analyzátoru cobas z 480 nepoužívejte roztok chlornanu sodného (bělidlo). Dojde-li k rozlití na zařízení cobas x 480 nebo na analyzátor cobas z 480, postupujte podle pokynů v příslušné příručce systému pro systém cobas Odběr, přeprava a skladování vzorků Pozn.: Se všemi vzorky je třeba zacházet jako s infekčními. Odběr vzorků Odeberte kašovitý vzorek stolice do sterilní nádobky. Vzorky by měly být odebrány v souladu se standardními postupy vaší instituce. Přeprava, skladování a stabilita vzorků Kašovité vzorky stolice jsou stabilní při teplotě 2 30 C po dobu 2 dní nebo 2 8 C po dobu 7 dní a při teplotě 20 C po dobu 60 dní před testováním na systému cobas 4800 (bylo prokázáno testováním vzorků po skladování při teplotě 30±1 C po dobu 2 dní, následně při teplotě 2 8 C po dobu 5 dní a následně při teplotě 20 C po dobu 60 dní). Vzorek stolice smíchaný s médiem cobas PCR je stabilní 60 dní při teplotě 2 8 C nebo 7 dní při teplotě 30 C před testováním na systému cobas Při přepravě vzorků C. difficile je třeba dodržovat celostátní i místní předpisy pro přepravu infekčních biologických materiálů. Doc. Rev

16 Postup testu Spuštění testu Pracovní postup Obrázek 1: Pracovní postup testu cobas Cdiff 1 Spusťte systém. 2 Proveďte údržbu systému. 3 Vyjměte vzorky a činidla z místa skladování. 4 Spusťte cyklus: Do nosičů naplňte vzorky. 5 S LIS: potvrďte objednávku. Bez LIS: vytvořte objednávku. 6 Zaveďte spotřební materiál (destičku s hlubokými jamkami, mikrotitrační destičku, stojany na špičky) a činidla 7 Spusťte cyklus přípravy vzorku 8 Vyjměte a zalepte mikrotitrační destičku 9 Vyjměte vzorky, použitá činidla a destičku s hlubokými jamkami. 10 Zaveďte mikrotitrační destičku do analyzátoru 11 Zkontrolujte výsledky 12 S LIS: odešlete výsledky do LIS 13 Vyprázdněte analyzátor Návod k použití Všechna činidla kromě Cdiff MMX a Cofactor-3 musí mít před vložením do zařízení cobas x 480 okolní teplotu laboratoře. Činidla Cdiff MMX a Cofactor-3 je možné vzít přímo z místa skladování o teplotě 2 8 C, protože se budou vyrovnávat na okolní teplotu laboratoře v zařízení cobas x 480 do doby, než se použijí v procesu. Pozn.: Podrobné provozní pokyny pro test cobas Cdiff naleznete v příslušné uživatelské příručce pro systém cobas Velikost cyklu Systém cobas 4800 je navržen tak, aby podporoval cykly se smíšenými dávkami mezi testy cobas MRSA/SA, cobas Cdiff a cobas HSV 1 a 2. Generická souprava pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800 (Sample Preparation Kit), generická souprava cobas s lytickým pufrem pro systém (System Lysis Kit) a generická souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800 (Wash Buffer Kit) jsou k dispozici ve dvou velikostech souprav, každá obsahuje množství činidel dostatečné pro 10 cyklů po 24 nebo 96 vzorcích, které zahrnují kontroly a vzorky pro všechny potřebné testy. Doc. Rev

17 Souprava pro amplifikaci/detekci cobas 4800 Cdiff je dostupná ve dvou velikostech, každá obsahuje množství činidel dostatečné pro 80 nebo 240 vzorků, které zahrnují kontroly Cdiff a vzorky pro zpracování. V jednom cyklu je možné použít několik lahviček činidla cobas 4800 Cdiff Master Mix, pokud jsou soupravy stejné velikosti. Generická souprava 1 interní kontroly pro systém cobas 4800 (Internal Control Kit) a souprava kontrol a kofaktoru cobas 4800 Cdiff (Controls and Cofactor Kit) jsou k dispozici v jedné velikosti soupravy a je vhodná pro všechny konfigurace cyklu. Pro každý cyklus obsahující vzorky C. difficile musí být použita jedna pozitivní kontrola cobas 4800 Cdiff a jedna negativní kontrola pro systém cobas 4800 (viz Kontrola kvality ). Pro jeden cyklus testu je povolen maximální počet 94 vzorků a 2 kontroly. Pozn.: Pro cyklus s 1 22 vzorky lze použít i generické činidlo pro 96 testů, i když činidla nebudou v takovém případě optimálně využita. Různé velikosti soupravy promývacího pufru pro systém cobas 4800 (WB), soupravy pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800 a soupravu 1 s lytickým činidlem pro systém cobas 4800 však nelze míchat. Pokud je například na začátku cyklu nasnímána láhev s činidlem WB pro 96 testů, musí být použita také činidla z dalších dvou souprav pro 96 testů. Pozn.: Pro cyklus s 1 6 vzorky C. difficile lze použít i činidlo pro 24 testů cobas 4800 Cdiff MMX, i když činidla nebudou v takovém případě optimálně využita. Podrobnosti o změně velikosti soupravy viz příslušná uživatelská příručka pro systém cobas 4800, pro test cobas Cdiff a část Plnění činidel. Pracovní postup Test cobas Cdiff se provádí s použitím úplného pracovního postupu v softwaru cobas Skládá se z přípravy vzorku na zařízení cobas x 480 a poté následuje amplifikace a detekce na analyzátoru cobas z 480. Lze použít pouze cyklus pro test Cdiff, nebo testy se smíšenými dávkami s testy cobas MRSA/SA a/nebo cobas HSV 1 a 2. Podrobnosti viz část Provedení úplného pracovního postupu a příslušná uživatelská příručka pro systém cobas 4800 pro test cobas Cdiff. Přenos vzorků do zkumavky s médiem cobas PCR 1. K přenosu stolice do zkumavky s médiem cobas PCR používejte jeden polyesterový smotek druhý smotek dodávaný v balení zlikvidujte. Špičku smotku zcela zasuňte do vzorku stolice až po konec rozšířené části bez toho, abyste se dotkli stěny nádobky na stolici, poté smotek rychle vyjměte a naočkovaný ho vložte do zkumavky s médiem cobas PCR. Vzorek netestujte, pokud nádobka neobsahuje dostatek stolice pro plné ponoření špičky smotku. 2. Tlakem na stranu zkumavky zlomte tyčinku smotku v místě šedé značky. Zkumavku uzavřete a minimálně 5sekundovým vířením promíchejte. Otevřete zkumavku a vložte ji do nosiče zkumavek pro 24 vzorků pro zpracování. Zlikvidujte víčka. Pozn.: Test cobas Cdiff byl validován pro použití se soupravou s médiem cobas PCR a vzorky s výtěry. Nepoužívejte jiná zařízení nebo typy médií. Pozn.: K přenosu stolice používejte jen jeden polyesterový smotek. Nadměrné množství stolice přenesené do zkumavky s médiem cobas PCR může mít za následek ucpání a/nebo neplatné výsledky. Doc. Rev

18 Pozn.: Pro zpracování v zařízení cobas x 480 musí být vzorky se stolicí přeneseny do zkumavek s médiem cobas PCR, které jsou označeny příslušným čárovým kódem. Prostudujte si příslušnou příručku systému pro systém cobas 4800, kde najdete příslušné postupy správného označování pomocí čárového kódu a seznam přípustných čárových kódů pro systém cobas Pozn.: Aby nedošlo ke křížové kontaminaci suspenzí vzorků se stolicí v nádobce s médiem cobas PCR, je nutné po zpracování vzorků použít pro uzavření nádobky se vzorkem s médiem cobas PCR další uzávěry jiné barvy (neutrální, viz Volitelné materiály ). Pozn.: Médium cobas PCR obsahuje dostatečné množství pro několikanásobné testování suspenze stolice v systému cobas Minimální objem suspenze stolice ve zkumavce s médiem cobas PCR nutný k provedení cyklu cobas Cdiff je 3 ml. Provedení testu cobas Cdiff Pozn.: Je možné provést cykly se smíšenými dávkami testů cobas MRSA/SA a cobas Cdiff a/nebo cobas HSV 1 a 2. Další informace pro test cobas Cdiff naleznete v příslušné uživatelské příručce pro systém cobas Podle pokynů v příslušné příručce systému pro systém cobas 4800 v části Údržba systému zapněte systém a proveďte údržbu. 2. Nachystejte si všechna činidla a potřebný spotřební materiál. Činidla musí mít ve chvíli, kdy je spuštěn cyklus, pokojovou teplotu, s výjimkou činidel cobas Cdiff MMX a Cofactor-3. Pozn.: Veškerá činidla a zásobníky na činidla jsou označená čárovým kódem a jsou určena pro jedno použití. Software zařízení cobas 4800 sleduje použití činidel a zásobníků na činidla a vyřazuje již dříve použitá činidla nebo zásobníky na činidla. 3. Spusťte nový cyklus a definujte objednávku pro cyklus. Existují tři způsoby, jak vytvářet objednávku: Pomocí editoru vzorků před zavedením stojanu na vzorky do zařízení cobas x 480 (tlačítko Editor se nachází na pravé straně hlavní nabídky). Objednávky je možné v případě potřeby uložit, upravit a znovu nahrát. Pomocí softwarového průvodce pro nový cyklus a zavedení (naplnění) vzorků do zařízení cobas x 480, jakmile je k tomu uživatel vyzván. Čárové kódy budou automaticky nasnímány a musí být definovány požadované výsledky pro každý vzorek. Pomocí systému LIS vašeho zdravotnického zařízení. Další informace viz příslušná uživatelská příručka pro systém cobas 4800 pro test cobas Cdiff. Při výběru požadovaných výsledků zatrhněte Cdiff. 4. Zaveďte vzorky a definujte/zvolte objednávku nebo použijte LIS dle potřeby. Možnost Unload sample carriers after transferring to deep well plate je zvolena jako výchozí. To umožňuje obsluze získat zbývající vzorky suspenze stolice, jakmile je to možné poté, co byly rozděleny na alikvotní části pomocí zařízení cobas x 480. Pokud je nutné vzorky uskladnit, musí být nádobky se vzorky suspenze stolice opět uzavřeny pomocí nového uzávěru (viz Volitelné materiály ). 5. Při vkládání spotřebního materiálu postupujte podle softwarového průvodce. Nedoplňujte jednotlivé špičky do částečně použitého stojanu na špičky, ani je nevytahujte, protože software sleduje počet zbývajících špiček. Pokud zde není dostatek špiček pro uskutečnění cyklu, software vydá varování pro uživatele. Doc. Rev

19 6. Vložte činidla pro přípravu vzorků do zásobníků na činidla označených čárovým kódem. Zásobníky na činidla jsou k dispozici ve dvou velikostech: 200 ml a 50 ml. Při výběru správné velikosti zásobníku na činidla postupujte podle softwarového průvodce. Čárové kódy zásobníků na činidla musí směřovat na pravou stranu nosiče. Pro činidla pro přípravu vzorků použijte metodu naskenovat-naskenovat-nalít-umístit : Naskenujte čárový kód lahvičky s činidlem. Naskenujte čárový kód zásobníku na činidla. Nalijte činidlo do zásobníku na činidla. Vložte naplněný zásobník na činidla na určenou pozici do nosiče činidel. Pozn.: Systém cobas 4800 je vybaven vnitřními hodinami, které monitorují čas, po který jsou činidla umístěná v přístroji. Jakmile je WB naskenováno, je k dispozici 1 hodina na provedení vkládání a kliknutí na tlačítko Start. Na záložce Workplace se zobrazí ubíhající čas. Jestliže vyprší čas, po který mohou být činidla umístěná v přístroji, systém nedovolí spuštění cyklu. Pozn.: Aby přenos MGP proběhl správně, bezprostředně před dávkováním do zásobníku na činidla lahvičku s MGP protřepejte na třepačce nebo s ní silně zatřepejte. 7. Umístěte činidla pro amplifikaci/detekci (Cdiff MMX a Cofactor-3), proteinázu K (PK) a kontroly [Cdiff (+) C, IC a ( ) C] přímo do nosičů činidel. Aby se zabránilo kontaminaci, musí si obsluha po manipulaci s pozitivními kontrolami vyměnit rukavice. Pozn.: Softwarový průvodce vypočítá optimální množství a velikost činidla cobas Cdiff MMX. Tyto údaje budou uvedeny ve sloupci Kit size na obrazovce plnění MMX a Kofaktoru. Chcete-li použít jinou velikost činidla cobas Cdiff MMX, klikněte na tlačítko Change kit size. 8. Po úspěšném cyklu přípravy vzorků budou k dispozici tlačítka Sample Preparation results a tlačítko Unload. Pokud si přejete, zvolte tlačítko Sample Preparation results, abyste mohli zkontrolovat výsledky a poté zvolte tlačítko Unload, abyste mohli vyjmout nosič destiček. Můžete také zvolit tlačítko Unload pro vyjmutí nosiče destiček bez prohlížení výsledků. Viz příslušná uživatelská příručka pro systém cobas 4800 pro test cobas Cdiff. 9. Postupujte podle pokynů v příslušné uživatelské příručce pro systém cobas 4800 pro test cobas Cdiff a zalepte mikrotitrační destičku, přeneste destičku do analyzátoru cobas z 480 a spusťte cyklus amplifikace a detekce. Pozn.: Systém cobas 4800 má vnitřní hodiny, které monitorují čas po přidání připravených vzorků do aktivního Master mixu. Amplifikaci a detekci je nutné spustit co nejdříve, ale ne později než 90 minut po dokončení cyklu zařízení cobas x 480. Na záložce Workplace se zobrazí ubíhající čas. Jestliže vyprší čas, systém ukončí cyklus. 10. Po dokončení cyklu amplifikace a detekce vyjměte mikrotitrační destičku z analyzátoru cobas z Chcete-li prohlédnout a přijmout výsledky, řiďte se pokyny v příslušné uživatelské příručce pro systém cobas 4800 pro test cobas Cdiff. Doc. Rev

20 Výsledky Kontrola kvality a platnosti výsledků Jedna sada pozitivních a negativních kontrol testu cobas Cdiff je zařazena do každého cyklu. U každého cyklu musí mít jak pozitivní, tak i negativní kontrola platný výsledek v softwaru cobas 4800, aby bylo možné zobrazit výsledky testu cobas Cdiff z daného cyklu. Pozitivní kontrola Kontrola Cdiff (+) obsahuje neinfekční DNA plazmidy C. difficile. Kontrola Cdiff (+) monitoruje kroky extrakce nukleové kyseliny, amplifikace a detekce v daném cyklu testu. Výsledek kontroly Cdiff (+) musí být Valid. Pokud jsou výsledky testu kontroly Cdiff (+) soustavně neplatné, spojte se s místním zastoupením firmy Roche a vyžádejte si technickou pomoc. Negativní kontrola Výsledek kontroly ( ) musí být Valid. Pokud jsou výsledky testu kontroly ( ) soustavně neplatné, spojte se s místním zastoupením firmy Roche a vyžádejte si technickou pomoc. Vnitřní kontrola Vnitřní kontrola je rekombinantní bakteriofág lambda, která obsahuje randomizované sekvence a cíle pro primery a sondu specifické pro vnitřní kontrolu. Vnitřní kontrola se přidává ke všem vzorkům a pozitivním a negativním kontrolám během přípravy vzorku na zařízení cobas x 480. Vnitřní kontrola monitoruje kroky extrakce nukleové kyseliny, amplifikace a detekce u daného vzorku. Vnitřní kontrola je také nutná pro validaci kontrol cyklu. Interpretace výsledků Pozn.: Veškerou validaci testů a cyklů provádí software cobas Pozn.: Platný cyklus může zahrnovat jak platné tak i neplatné výsledky vzorků. Jestliže je cyklus platný, lze výsledky vzorků interpretovat dle uvedeného způsobu (viz Tabulka 1). Doc. Rev

21 Tabulka 1 Vyhodnocení výsledků testu cobas Cdiff Test cobas Cdiff Výsledkový protokol a interpretace POS Cdiff NEG Cdiff Neplatné Failed Cdiff pozitivní Vzorek je pozitivní na přítomnost DNA C. difficile. Cdiff negativní* Pokud se ve vzorku nachází DNA C. difficile, nebylo možné ji detekovat. Neplatné Výsledek je neplatný. Pro získání platného výsledku je nutné původní vzorek testovat znovu. Na zkumavku se suspenzí stolice s neplatným výsledkem vložte nové víčko a viřte alespoň 5 sekund. Do zkumavky s médiem cobas PCR přidejte 0,5 ml vířené suspenze stolice. Zředěnou zkumavku uzavřete a minimálně 5sekundovým vířením promíchejte. Otevřete zkumavku se zředěným vzorkem a vložte ji do nosiče zkumavek pro 24 vzorků pro zpracování. Pro vzorek není žádný výsledek Chcete-li prohlédnout příznaky cyklu a doporučené kroky, podívejte se do příslušné uživatelské příručky pro systém cobas 4800 pro test cobas Cdiff. Ve výjimečných případech, když dojde k chybě při pipetování (např. k ucpání nebo jinému zablokování), je nutné původní zkumavku se suspenzí vzorku stolice uzavřít novým víčkem a vložit do centrifugy. Zrychlujte až na otáčky 1800 RCF (nebo 1800 x g) a poté zastavte. Dbejte na to, abyste lahvičkou po víření již netřepali ani nemíchali. Otevřete zkumavku a vložte ji do nosiče zkumavek pro 24 vzorků pro zpracování. * Negativní výsledek nevylučuje přítomnost DNA C. difficile, protože výsledky závisí na adekvátním odběru vzorku, absenci inhibitorů a dostatečném množství DNA k detekci. Pokud vzorek obsahuje nadměrné množství stolice nebo inhibiční látky, které brání extrakci nebo amplifikaci a detekci cílové nukleové kyseliny, mohou být získány neplatné výsledky. Známé interferující látky viz Procedurální omezení. Pozn.: Minimální objem suspenze stolice pro test cobas Cdiff je 3 ml. PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ 1. Test cobas Cdiff byl validován pouze pro použití s kašovitými vzorky stolice, které byly přeneseny do média cobas PCR podle tohoto návodu k použití. 2. K získání spolehlivých výsledků je třeba dodržovat příslušné postupy odběru, transportu, skladování a zpracování vzorků. Řiďte se pokyny v tomto návodu k použití (také je zmiňován jako příbalový leták) a příslušné uživatelské příručce pro systém cobas 4800 pro test cobas Cdiff. 3. Detekce DNA C. difficile závisí na počtu organizmů přítomných ve vzorku a může být ovlivněna metodou odběru/zpracování vzorku, hospitalizací, léčbou pomocí antibiotik a kmeny C. difficile. 4. Falešné negativní nebo neplatné výsledky se mohou objevit v důsledku interference způsobené různými látkami. V testu cobas Cdiff je zahrnuta interní kontrola, která napomáhá identifikovat vzorky obsahující látky, které mohou interferovat s izolací nukleové kyseliny a PCR amplifikací. Mezi známé interference patří kromě jiných následující: Vzorky obsahující více než 25 % (hm./obj.) mucinu na smotek mohou vytvářet falešně negativní výsledky. Doc. Rev

22 5. Pozitivní výsledek svědčí o přítomnosti DNA C. difficile a nemusí být nutně důkazem přítomnosti životaschopných organismů. Pozitivní výsledek tedy nemusí nutně svědčit o neúspěšné eradikační léčbě. 6. Mutace nebo polymorfizmy ve vazebných oblastech primeru nebo sondy mohou ovlivnit detekci nových nebo neznámých variant, což vede k falešně negativnímu výsledku testu cobas Cdiff. 7. Prediktivní hodnota testu závisí na prevalenci onemocnění v určité populaci. 8. Přidání enzymu AmpErase k činidlu cobas 4800 Cdiff Master Mix umožňuje selektivní amplifikaci cílové DNA. Aby se však předešlo kontaminaci činidel a amplifikačních směsí, je třeba uplatňovat zásady správné laboratorní praxe a důsledně dodržovat postupy uvedené v tomto návodu k použití. 9. Tento produkt smí používat pouze personál vyškolený v technikách PCR a v používání systému cobas Pouze zařízení cobas x 480 a analyzátor cobas z 480 byla validována pro použití s tímto produktem. S tímto produktem se nesmí používat žádné jiné zařízení na přípravu vzorků nebo jiný systém PCR. 11. Vzhledem k rozdílům mezi technologiemi se doporučuje, aby uživatelé před přechodem od jedné technologie k druhé provedli ve své laboratoři studie pro stanovení rozdílů mezi těmito technologiemi a verifikovali nový postup. 12. Křížová kontaminace může způsobit falešně pozitivní výsledky. Systém cobas 4800 je automatizovaný přístroj pro PCR v reálném čase navržený k minimalizaci rizika křížové kontaminace během zpracování vzorků, extrakce nukleové kyseliny, amplifikace a detekce. K vyzkoušení odolnosti systému byla simulována neklinická šachovnicová studie na panelu střídavě vysoce pozitivních a negativních upravených vzorků za účelem vyhodnocení teoretické míry křížové kontaminace systému. Vysoce pozitivní vzorky měly hodnoty Ct dříve než by bylo pozorováno u 95 % infikovaných pacientů v populaci pro daný účel použití. Míra křížové kontaminace v této šachovnicové studii byla stanovena na 0,24 % (1/423). Míry křížové kontaminace v klinickém prostředí závisí na podílu vysoce pozitivních vzorků a prevalence onemocnění. Očekává se, že míry křížové kontaminace v běžném klinickém prostředí budou dramaticky nižší, než v této studii a je nutné je posoudit v prostředí uživatele. Hodnocení neklinických funkčních parametrů Analytická citlivost Analytická citlivost (mez detekce neboli LOD) testu cobas Cdiff byla stanovena analýzou kvantifikovaných kultur C. difficile naředěných do několika hladin koncentrace na negativním pozadí suspenze stolice v médiu cobas PCR. Všechny hladiny byly analyzovány pomocí úplného pracovního postupu testu cobas Cdiff ve třech jedinečných šaržích činidel pro test cobas Cdiff. V každé hladině bylo testováno alespoň 21 replikátů na šarži činidel. Mez detekce (LOD) tohoto testu je definovaná jako cílová koncentrace, jež může být detekována jako pozitivní ve 95 % testovaných replikátů na základě výsledků dosažených se šarží činidel s nejhoršími parametry. Sedm kmenů C. difficile testovaných ve studii analytické citlivosti uvádí Tabulka 2. Doc. Rev

23 Tabulka 2 LOD (mez detekce) testu cobas Cdiff ID kmenu Toxinotyp Typ REA* Typ PFG Ribotyp Fenotyp LOD (CFU/smotek) Podle poměru pozitivních Podle analýzy Probit ATCC (VPI 10463) 0 N/A N/A 087 A+B+CDT ATCC BAA-1382 (630) 0 R 23 N/A 012 A+B+CDT CDC III BI 8 NAP1 027 A+B+CDT R12087 (CD196) III BI NAP1 027 A+B+CDT V N/A N/A 078 N/A ATCC (1470) VIII N/A N/A 017 A-B F15 XII N/A N/A N/A N/A *Analýza restrikční endonukleázy; Pulzní gelová elektroforéza Detekce genotypů C. difficile Mez detekce (LOD) testu cobas Cdiff s 28 toxikogenními kmeny reprezentujícími další toxinotypy byla verifikována testováním 40 replikátů v každé hladině koncentrace při různých koncentracích. Ředění a testování vzorků bylo připraveno stejným způsobem jako studie meze detekce popsána výše. Nejnižší hladiny, které měly alespoň 95% pozorovanou míru úspěšnosti, viz Tabulka 3. Všech 28 toxikogenních kmenů (Tabulka 3) bylo detekováno jako pozitivní ve 95 % replikátů testovaných v koncentracích od 77,9 CFU/smotek až 460 CFU/smotek. Tabulka 3 Shrnutí verifikačních výsledků toxikogenní C. difficile Kmen Toxinotyp Ribotyp Konc. (CFU/smotek) Poměr pozitivních EX 623 S ,9 95,0 % AC 008 II ,9 95,0 % SE 844 IIIa ,0 % IV ,9 100,0 % SE 881 V ,0 % VI N/A ,0 % VII ,9 97,5 % IX ,9 100,0 % 8864 X ,9 97,5 % R 9367 XIII ,9 97,5 % R XIV ,0 % R 9385 XV ,0 % SUC36 XVI ,0 % J9965 XVII N/A ,5 % Doc. Rev

24 Tabulka 3 Shrnutí verifikačních výsledků toxikogenní C. difficile (pokračování) Kmen Toxinotyp Ribotyp Konc. (CFU/smotek) Poměr pozitivních K095 XVIII ,0 % TR13 XIX N/A ,5 % TR14 XX N/A 77,9 100,0 % CH6223 XXI N/A ,0 % CD XXII N/A ,0 % 8785 XXIII N/A ,0 % 597B XXIV ,5 % 7325 XXV ,0 % 7459 XXVI N/A ,0 % KK XXVII N/A ,0 % CD XXVIII ,5 % CD XXIX ,5 % ES 130 XXX N/A ,0 % WA 151 XXXI N/A ,0 % Přesnost Vlastní přesnost na místě byla stanovena s použitím panelu složeného z kultur C. difficile zředěných v negativní suspenzi stolice v médiu cobas PCR na hladiny koncentrace pod mezí detekce (LOD), blízko LOD a nad LOD testu cobas Cdiff. Testována byla také negativní hladina zahrnující pouze suspenzi stolice v médiu cobas PCR. Studie využívala tři unikátní šarže činidel testu cobas Cdiff a tři zařízení při celkem 36 cyklech v průběhu 12 dní. Popis panelů přesnosti a shrnutí studie viz Tabulka 4. Analýza složek odchylek hodnot (Tabulka 5) ukázala, že většina odchylek cílových hodnot Ct je připisována faktorům v rámci cyklu (náhodný) a šarže (60,0 % a 25,3 %) pro hladinu koncentrace rovnající se LOD nebo v její blízkosti. Pro hladinu koncentrace vyšší než LOD je většina odchylek hodnot Ct připisována faktorům v rámci cyklu (náhodný) a mezi přístroji (72,5 % a 24,7 %). Výsledky (Tabulka 6) ukazují, že cílové hodnoty Ct měly celkový variační koeficient (CV) (%) 1,5 % při hladině koncentrace na úrovni LOD a 1,1 % při hladině koncentrace vyšší než LOD. Tabulka 4 Vlastní analýza na místě poměru pozitivních výsledků studie přesnosti 95% CL Člen panelu Počet testů Počet pozitivních Poměr pozitivních Dolní Horní Negativní ,0 % 0,0 % 5,0 % < 1 x LOD ,2 % 19,0 % 41,1 % ~ 1 x LOD ,0 % 95,0 % 100,0 % ~ 3 x LOD ,0 % 95,0 % 100,0 % LOD = mez detekce Doc. Rev

25 Tabulka 5 Analýza složek odchylek hodnot pro členy panelu přesnosti Hladina Průměr ~ 1 x LOD 38,5 ~ 3 x LOD 37,5 LOD = mez detekce Šarže Složky variace/procentuální příspěvek Zařízení Velikost soupravy Den Náhodně Celkem 0,0789 0,0189 0,0001 0,0270 0,1875 0, ,25 % 6,04 % 0,03 % 8,65 % 60,03 % 100,00 % 0,0047 0,0404 0,0000 0,0000 0,1188 0,1638 2,84 % 24,65 % 0,00 % 0,00 % 72,51 % 100,00 % Tabulka 6 Směrodatné odchylky a variační koeficienty (%) analýzy pro členy panelu přesnosti Hladina Průměr ~ 1 x LOD 38,5 ~ 3 x LOD 37,5 LOD = mez detekce Šarže Zařízení Složky SD/procento CV Velikost soupravy Den Náhodně Celkem 0,28 0,14 0,01 0,16 0,43 0,56 0,73 % 0,36 % 0,03 % 0,43 % 1,12 % 1,45 % 0,07 0,20 0,00 0,00 0,34 0,40 0,18 % 0,54 % 0,00 % 0,00 % 0,92 % 1,08 % Analytická specificita Pro vyhodnocení analytické specificity testu cobas Cdiff byly testovány následující panely organizmů: 1) 103 bakterií, plísní a virů, které lze najít ve vzorcích lidské stolice a jedna lidská buňka (Tabulka 7); 2) 28 organizmů rodu Clostridium, včetně netoxikogenních C. difficile (* pro účely testování byl přidán Cytomegalovirus (HHV5) v koncentraci 2,0 x 10 3 PFU/ml, lidský adenovirus typu 40 v koncentraci 2,2 x 10 3 PFU/ml a lidský rotavirus v koncentraci 9,8 x 10 3 PFU/ml; Tabulka 8). Všechny bakterie a lidské buňky byly přidány v koncentraci 1 x 10 6 jednotek*/ml a všechny viry byly přidány 1 x 10 5 jednotek*/ml, kromě cytomegaloviru (HHV5), lidského adenoviru typu 40 a lidského rotaviru, které byly přidány v nižších koncentracích v důsledku omezení zásobních koncentrací. Testování bylo provedeno se samotnými organizmy nebo se dvěma izoláty C. difficile přítomnými jednotlivě při 3 x LOD (mez detekce) testu cobas Cdiff. Výsledky ukazují, že žádný z těchto organizmů neinterferoval s detekcí určených Cdiff cílů. Žádný nevykázal falešně pozitivní výsledky v případě, že nebyl přítomen žádný určený cíl C. difficile. Analytická specificita Clostridium botulinum byla potvrzena pomocí programu BLAST proti databázi nukleotidových sekvencí za účelem napodobení kroku vytvoření amplikonů PCR. *Bakterie byly kvantifikovány jako kolonie tvořící jednotky (CFU)/ml, lidská buňka byla kvantifikována jako buňky/ml a viry byly kvantifikovány jako plaky tvořící jednotky (PFU)/ml, kromě následujících mikroorganizmů. Chlamydia trachomatis byla kvantifikována jako elementární tělísko (EB)/ml. Cytomegalovirus, lidský echovirus a lidský enterovirus byly kvantifikovány jako IU/ml. Doc. Rev

26 Tabulka 7 Mikroorganizmy a lidské buňky Abiotrophia defectiva Acinetobacter baumannii Acinetobacter lwoffii Aeromonas hydrophila Alcaligenes faecalis subsp. faecalis Anaerococcus tetradius Bacillus cereus ATCC Bacillus cereus ATCC Bacteroides caccae Bacteroides merdae Bacteroides stercoris Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium longum Campylobacter coli Campylobacter jejuni Candida albicans Candida catenulata Cedecea davisae Chlamydia trachomatis, sérovar L2 Citrobacter amalonaticus Citrobacter freundii Citrobacter koseri Citrobacter sedlakii Collinsella aerofaciens Corynebacterium genitalium Desulfovibrio piger Edwardsiella tarda Eggerthella lenta Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus casseliflavus Enterococcus cecorum Enterococcus dispar Enterococcus faecalis Enterococcus faecium vana Enterococcus gallinarum vanc Enterococcus hirae Enterococcus raffinosus Escherichia coli ATCC Escherichia coli ATCC Escherichia fergusonii Escherichia hermannii Fusobacterium varium Gardnerella vaginalis Gemella morbillorum Hafnia alvei Lidské buňky HCT-15 Helicobacter fennelliae Helicobacter pylori Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae Lactobacillus acidophilus Lactobacillus reuteri Lactococcus lactis Leminorella grimontii Listeria grayi Listeria innocua Listeria monocytogenes Mitsuokella multacida Mobiluncus curtisii Moellerella wisconsensis Morganella morganii Neisseria gonorrhoeae Peptoniphilus asaccharolyticus Peptostreptococcus anaerobius Plesiomonas shigelloides Porphyromonas asaccharolytica Prevotella melaninogenica Proteus mirabilis Proteus penneri Providencia alcalifaciens Providencia rettgeri Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Ruminococcus bromii Salmonella enterica subsp. enterica, sérovar Choleraesuis Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis Serratia liquefaciens Salmonella enterica subsp. arizonae (dříve známa jako Salmonella choleraesuis subsp. arizonae) Serratia marcescens Shigella boydii Shigella dysenteriae Shigella sonnei Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae Streptococcus intermedius Streptococcus uberis Trabulsiella guamensis Veillonella parvula Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Yersinia bercovieri Yersinia rohdei Cytomegalovirus (HHV5)* Lidský adenovirus typu 40* Lidský Coxsackie virus A10 Lidský enterovirus 11 Lidský enterovirus 71 Lidský rotavirus* Norovirus GII - * Cytomegalovirus (HHV5) byl pro testování přidán v koncentraci 2,0 x 10 3 PFU/ml, lidský adenovirus typu 40 v koncentraci 2,2 x 10 3 PFU/ml a lidský rotavirus v koncentraci 9,8 x 10 3 PFU/ml. Doc. Rev

27 Tabulka 8 Organizmy rodu Clostridium, včetně netoxikogenní bakterie C. difficile Clostridium beijerinckii Clostridium bifermentans Clostridium bolteae Clostridium botulinum* Clostridium butyricum Clostridium chauvoei Clostridium difficile, séroskupina B (netoxikogenní) Clostridium difficile, séroskupina I (netoxikogenní) Clostridium fallax Clostridium haemolyticum Clostridium histolyticum Clostridium innocuum Clostridium methylpentosum Clostridium nexile Clostridium novyi Clostridium orbiscindens (přejmenován na Flavonifractor plautii) Clostridium paraputrificum Clostridium perfringens Clostridium ramosum Clostridium scindens Clostridium septicum Clostridium sordellii Clostridium sphenoides Clostridium spiroforme Clostridium sporogenes Clostridium symbiosum Clostridium tertium Clostridium tetani - - * Na základě programu BLAST. Interference Na potenciální interferenci s testem cobas Cdiff bylo testováno dvacet šest běžně užívaných léků a rovněž i fekální tuk, plná krev a mucin. Všechny látky byly testovány v koncentracích vyšších, než které by se daly očekávat při odběru vzorku stolice smotkem. Množství interferující látky je vyjádřeno jako koncentrace v primárním vzorku stolice. Dva izoláty C. difficile byly přidány do 3 x LOD (mez detekce) testu cobas Cdiff použity jako cíle. U exogenních látek nebyla pozorována žádná interference. U fekálního tuku nebyla pozorována interference do 28 %, u plné krve nebyla pozorována interference do 50 % a u mucinu nebyla pozorována interference do 25 %. Shrnutí těchto výsledků viz Tabulka 9. Doc. Rev

28 Tabulka 9 Výsledky testování interference látek Látka Koncentrace Výsledky Fekální tuk 4 ~ 28 % (hm./obj.) Žádná interference Plná krev 25, 50 % (obj.) Žádná interference Mucin 25, 50 % (hm./obj.) Žádná interference do 25 % (hm./obj.) Tums 10 % (hm./obj.) Žádná interference Vancomycin 1 % (hm./obj.) Žádná interference Metronidazol 10 % (hm./obj.) Žádná interference Imodium AD 10 % (hm./obj.) Žádná interference Přípravek na změkčení stolice 10 % (hm./obj.) Žádná interference Pepto-Bismol (Procter & Gamble) 10 % (obj.) Žádná interference Mast Nystatin USP 10 % (hm./obj.) Žádná interference Přípravek H s krémem Bio-Dyne (Wyeth) 10 % (hm./obj.) Žádná interference GYNOL II 10 % (hm./obj.) Žádná interference Krém proti svědění Vagisil 10 % (hm./obj.) Žádná interference Anusol Plus 10 % (hm./obj.) Žádná interference Opalovací krém 1 % (hm./obj.) Žádná interference Monistat 7 10 % (hm./obj.) Žádná interference Vaseline 10 % (hm./obj.) Žádná interference Čípky SAB-Dimenhydrinate (SABEX ) 10 % (hm./obj.) Žádná interference Minerální olej 10 % (obj.) Žádná interference Shodné přírodní zeleninové laxativum 10 % (hm./obj.) Žádná interference Dulcolax 10 % (hm./obj.) Žádná interference Fleet (CB Fleet Company) 10 % (hm./obj.) Žádná interference K-Y Jelly/Gelée (McNeil-PPC) 1 % (hm./obj.) Žádná interference Nosní sprej Afrin Original 10 % (obj.) Žádná interference Jeřáb obecný Barytová běloba o vysoké hustotě E-Z-HD pro suspenzi (E-Z-EM Kanada) Tekutina z 1 výtěru/smotku Žádná interference 20 % (hm./obj.) Žádná interference Kyselina palmitová 10 % (hm./obj.) Žádná interference Kyselina stearová 10 % (hm./obj.) Žádná interference Aleve 10 % (hm./obj.) Žádná interference Doc. Rev

29 Korelace Výsledek testu cobas Cdiff byl referenčně porovnán s nejmodernějším komparačním NAT testem schváleným FDA a označeným CE pomocí testu cytotoxicity tkáňové kultury na izolátech C. difficile z přímé kultury. Vzorky stolice odebrané ve 3 nemocnicích/lékařských pracovištích byly testovány pomocí testu cobas Cdiff a komparačním testem NAT a odeslány do referenční laboratoře na test cytotoxicity tkáňové kultury. Test cobas Cdiff a nejmodernější komparačním test NAT byly provedeny dle pokynů výrobce. Test cytotoxicity tkáňové kultury byl proveden pomocí přímé detekce kultury. Každý vzorek stolice byl naočkován na dopředu redukovaný agar cykloserin-cefoxitin-fruktóza (CCFA-HT). Podezřelé kolonie byly identifikovány jako C. difficile morfologickým vyšetřením, aero intolerancí a testem Pro-Disk a naočkovány do anaerobního nasekaného masového bujónu. Supernatanty získané z anaerobního nasekaného masového bujónu budou poté zpracovány na přítomnost toxinu B C. difficile pomocí testu cytotoxicity tkáňové kultury (test C. DIFFICILE TOX-B, Techlab). Bylo zapojeno celkem 1434 pacientů z pěti pracovišť. Kvůli nekompletním výsledkům bylo vyřazeno 156 pacientů. Přímou detekcí kultury bylo zjištěno 152 pozitivních vzorků na C. difficile (prevalence: 11,9 %). Srovnání testů cobas Cdiff komparačního testu NAT proti přímé detekci kultury viz Tabulka 10 a Tabulka 11. Tabulka 10 Test cobas Cdiff proti přímé detekci kultury Test cobas Cdiff Přímá detekce kultury Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Negativní Celkem Citlivost a specificita Citlivost a specificita testu cobas Cdiff v přímé detekci kultury je 96,7 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 92,5-98,6 %) a 97,3 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 96,2-98,1 %), v tomto pořadí. Pozitivní a negativní prediktivní hodnota Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty testu cobas Cdiff studovaných vzorků je 83,1 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 76,7-88,3 %) a 99,5 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 98,9-99,9 %), v tomto pořadí. Tabulka 11 Test nukleové kyseliny (NAT) ve srovnání s přímou detekcí kultury Komparační test NAT Přímá detekce kultury Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Negativní Celkem Doc. Rev

30 Citlivost a specificita Citlivost a specificita testu komparačního testu NAT v přímé detekci kultury je 96,7 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 92,5-98,6 %) a 97,4 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 96,3-98,2 %), v tomto pořadí. Korelace vůči komparačnímu testu NAT Test cobas Cdiff v přímém srovnání s nejmodernějším komparačním testem NAT schváleným FDA a označeným CE viz Tabulka 12. Tabulka 12 Test cobas Cdiff a komparační test nukleové kyseliny (NAT) Test cobas Cdiff Komparační test NAT Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Negativní Celkem Procento pozitivních a negativních shod Procento pozitivních a negativních shod testu cobas Cdiff vůči komparačnímu testu NAT je 94,9 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 90,6-97,3 %) a 99,1 % (95% dvoustranný interval spolehlivosti: 98,3-99,5 %), v tomto pořadí. Doc. Rev

31 Doplňující informace Hlavní parametry testu Typ vzorku Požadované množství vzorku Délka testu Analytická citlivost Specificita Inkluzivita Kašovité vzorky stolice 4,3 ml média cobas PCR v primární zkumavce, minimálně 3 ml je zapotřebí pro test cobas Cdiff. Výsledky jsou k dispozici do 2,5 hodin po vložení vzorků do systému (1 22 vzorků). 54 až 460 CFU/smotek v závislosti na izolátu. Nebyla zjištěna žádná křížová reaktivita se 125 blízce souvisejícími organizmy nebo organizmy, které se typicky nachází ve vzorcích stolice. Všechny známé C. difficile (toxinotypt 0 ~ XXXI, mimo netoxikogenních toxinotypů XI) včetně BI/ NAP1/027 hypervirulentních epidemických kmenů. Doc. Rev

32 Symboly V označování diagnostických produktů společnosti Roche PCR se používají následující symboly. Tabulka 13 Symboly použité při označování diagnostických produktů PCR společnosti Roche Pomocný software Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Zplnomocněný zástupce pro evropské společenství Dolní mez přiřazeného rozmezí Datový list s čárovými kódy Výrobce Číslo šarže Uchovávejte v temnu Biologická rizika Obsah vystačí pro <n> testů Katalogové číslo Omezení teploty Čtěte návod k použití Definiční soubor testu Obsah soupravy Horní mez přiřazeného rozmezí Distribuce Použitelné do Pouze pro vyhodnocení účinnosti IVD Globální číslo obchodní položky Tento výrobek odpovídá požadavkům Evropské směrnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro. Technická podpora pro zákazníky v USA Doc. Rev

33 Výrobce a distributoři Tabulka 14 Výrobce a distributoři Roche Molecular Systems, Inc US Highway 202 South Branchburg, NJ USA Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Str Mannheim Germany Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Straße 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal Obchodní značky a patenty Viz Autorská práva (Copyright) 2014 Roche Molecular Systems, Inc. Doc. Rev