Cytologie Buněčné jádro. Jindřiška Fišerová, Ph.D. Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i

Transkript

1 Cytologie Buněčné jádro Jindřiška Fišerová, Ph.D. Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i

2 Cíle přednášky Prozkoumat význam jádra Pochopit principy a mechanismy jaderného fungování

3 Funkce jádra Uchování a přenos genetické informace Transkripce DNA (syntéza mrna, trna, rrna) Sestřih RNA Oprava poškozené DNA

4 STRUKTURA, ORGANIZACE, FUNKCE Periferie Transport Chromatin a chromosomy

5 Cíle přednášky Prozkoumat význam jádra Pochopit principy a mechanismy jaderného fungování Porozumět vztahu mezi současnými poznatky a metodologií výzkumu

6 C-value a C-paradox C-value: kompletní množství DNA v haploidním genomu Zvyšující se komplexita organismu nutně neznamená větší genom! Sc: 12,495,682bp 5770 genů 2n = 32 chromosomů Dm: 122,653,977 13,379 8 At: 115,409,949 28, Rýže 3.9 x , Hs: 3.3 x , Tulipán, pšenice, žito - 10x více DNA než člověk. Zvyšování ploidie!! Tabák 4n = 48 Pšenice, žito, - 6n = 42

7 Organizace genomu Gen kompletní sekvence nukleové kyseliny nezbytná k syntéze funkčního produktu Lineární molekula DNA, 100x delší než buňka sbalování!!! Lidská DNA 4.3 cm

8

9 - fotografie - zvýraznění - video - extrakce - fígle a triky Metody výzkumu

10 Metody výzkumu Elektronová mikroskopie transmisní - TEM Elektronová mikroskopie skenovací - SEM Mikroskopie fluorescenční: FISH, imunofluorescence Super-rezoluční mikroskopie SIM, STED, PALM, STORM Imunoprecipitace (ChIP, ChIP-Chip, ChIP-seq) Genové manipulace, DamID 3C, 4C, 5C and Hi-C

11 Elektronová mikroskopie jak funguje?

12 TEM a SEM dávají odlišnou informaci 2D projekce tenkého řezu Tomografie!!!! umožňuje 3D rekonstrukci vždy 3D obraz povrchových struktur

13 TEM Fixace Dehydratace Zalití do pryskyřice Řezání Zvýraznění kovem Fixace Dehydratace Sušení Pokovení SEM

14 Cílené značení - Immunogold labelling

15 CRYO elektronová mikroskopie Vzorek pozorujeme stále hluboce zmrazený! Výhody: perfektní fixace i rozlišení zachovány ultrastruktury Nevýhody: drahá aparatura, velmi náročné technicky i finančně vzorek málo kontrastní

16 TEM CRYO TEM

17 3D TEM: Trojrozměrné zobrazení pomocí EM neboli elektronová TOMOGRAFIE

18 Sbírání dat natáčením 1 objektu Tloušťka řezů nm dle možnosti EM - napětí (alespoň 400kV) Série projekcí řezů otočených +/

19

20 Tomogram

21 Tomogram

22 Segmentace a mapování struktur Beck et. al 2004, Science

23 Super resolution- super-rezoluční mikroskopie Na principech fluorescenční mikroskopie Různými způsoby překračuje rozlišení světelné mikroskopie Rozlišení, Abbe limit, point spread function (PSF) 4Pi, PALM, STORM, SIM, STED

24 Schermelleh et al. 2010, J. Cell Biol. Vol. 190 No

25 Schermelleh et al. 2010, J. Cell Biol. Vol. 190 No

26 DAPI CENPE TPR STED images of HeLa Nup62 TPR Fišerová J, 2015, unpublished

27 FISH: fluorescence in situ hybridisation Zjišťuje přítomnost a polohu DNA sekvence na chromosomu. Fluorescenční barvička + specificka sekvence oligonukleotidu. Naváže se specificky k DNA chromosomu Používa se při detekci chromosomálních přestaveb a zlomů, druhové identifikaci, expresní profil buněk a tkání.

28 Procesy interfázních jader

29 1. Jakým způsobem je organisována DNA 2. Jakým způsobem je jádro organisováno

30 Struktura a organisace b. jádra Interfáze: Chromatin - DNA + protein Euchromatin - aktivní Heterochromatin nečinný, konstitutivní, fakultativní Silencing při diferenciaci Mitoza: chromosomy Jaderná matrix (nukleoplasma) skelet? Jaderná obálka + jaderné póry 6-10 μm Asi 10% buněčného objemu 1 μm Vnitřní kompartmentalizace jádra!!! Kompartmenty bez membrány: jadérko

31 Chromatin, chromosomy

32

33

34 Chromatin Extrakce pomocí solí korálky na niti: Linker DNA + nukleosomy

35 Nukleosom Základní strukturní a funkční jednotka chromatinu DNA kol oktamerového jádra histonů 10 nm, 1 2/3 otáčky Histony: rodina malých bazických proteinů, hlavní typy H1, H2A, H2B, H3, H4 Shama et al , Biophys J. Luger et al. 1997, Nature

36 Histone code - Zašifrované konce

37 Lysine Methylation - both transcriptional activation and represion H3H4me1 ACTIVE, enhancers H3K4me3 ACTIVE, promoters H3K36me3 ACTIVE, gene bodies H3K27me3 REPRESSIVE, temporary (developmental genes, promoters of gene rich regions), X chromosome H3K9me3 REPRESSIVE, permanent, gene poor regions (satelite repeats, telomeres, pericentromeres), X chromosome Lysine acetylation open chromatin structure H3K9Ac ACTIVE H3K27Ac ACTIVE H4K5Ac ACTIVE

38 Histone acetyltransferáza Histone deacetyláza Histone metyltransferáza Chromodoména Chromoshadow doména Hraniční elementy!

39 Chromatin immunoprecipitation, ChIP Identifikace DNA vazebních míst pro konkrétní proteiny Mapa interakcí DNA-protein IN VIVO ChIP-chip, ChIP-seq

40

41

42

43 Cik-Cak model šroubovice Woodcock et al. 1984, JCB

44 Solenoid Robinson et al. 2006, PNAS

45 Tekutá podoba chromatinu Založená na 10 nm vláknu DNA Maeshima et al Curr Opin Gene Biol

46 Metody založené na 3C (chromatin conformation capture)

47 Rowley and Corces, Curr Opin Cell Biol 2016

48 TADs topologically associated domains Replikační domény se překrývají s TADs Inzulátory a hraniční elementy Rowley and Corces, Curr Opin Cell Biol 2016

49 Rowley and Corces, Curr Opin Cell Biol 2016

50 Vyšší struktury chromatinu Nehistonové proteiny lešení + integrita DNA SARs/MARs (Scafold associated regions/matrix associated regions) - úseky mezi transkripčně aktivními smyčkami - pomocí in situ hybridizace - smyčky 1-4 Mb dlouhé Insulátory isolují od sebe jednotlivé transkripční jednotky, SARs/MARs mohou fungovat jako insulátory Chromosomální teritoria chromosom není volně rozprsknut skrz jádro

51 SMC proteiny (structure maintenance of chromosome proteins) mohou svázat 2 30nm vlákna dohromady Asociují s chromatinem mezi geny Struktura chromosomů!

52 Chromosom 2 chromatidy spojené centromerou telomery Pro replikaci musí každý chromosom obsahovat: origin, centromera, telomery U vyšších eukaryot se na centromeře tvoří kinetochor Po mitose chromosomy dekondensují jen částečně Jen velmi malá frakce dekondensuje na 10-30nm vlákno Chromosomální teritoria

53 Buněčný cyklus

54 Chromosomal territories (CT) Jednotlivé chromosomy v jádře zaujímají konkrétní polohu CT Chromocentrum (heterochromatin) organisuje CT CT velmi dynamická, mezi buňkami si neodpovídají, nepřekrývají se Cremer and Cremmer 2001, Nat. Rev. Genet.

55 Gene rich Gene poor Lymfocyt člověka Cremer and Cremmer 2001, Nat. Rev. Genet.

56 Model organisace chromatinu v rámci chromosomálních teritorií Nenáhodná poloha genů uvnitř jádra!!!

57 P. Fransz

58 Arabidopsis Heterochromatin Chromocentrum Exner and Hennig 2008, Curr. Opin. Plant Biol. pšenice 100x větší genom!! Shaw et al. 2002, J. Struct. Biol

59 Jaderné kompartmenty Jaderná periferie Jaderný transport

60

61 Jadérko továrna na ribosomy Sirri et al. 2008, Histochem. Cell Biol 700 proteinů, 150 sno RNAs, 2 RNP Tvořeno rdna několika chromosomů Podléhá buněčnému cyklu FC Fibrilar component DFC dense fibrilar component GC Granular component

62 Arabidopsis nucleoli

63 Tobacco BY-2 nucleoli

64 Cajal bodies coilin Clastosome OPT doména Paraspeckles Cleavage body Nuclear speckles SC35, SF/ASF Stresová tělíska Perinucleolar compartment PML tělíska PML Polycomb Spector 2006, Cell

65 Periferie jádra Velmi heterogení Mikrodomény různé funkce a složení Oblasti heterochromatinu, ztišených genů radiální organisace jádra

66 Periferní mikrodomény DamID fuze odhalila lamin associated domains (LADs) LADs: cca 500 kb dlouhé úseky DNA, genově chudé Telomery a subtelomery blízko jaderné periferie Represivní podmínky k expresi x i zde permisivní domény

67 Dynamicka povaha LADs Po rozdělení buňky mohou asociovat i s oblastmi kolem jadérka Kind et al Cell

68 KASH domain proteins: KASH doména cca 30 AA, role při umístění jádra v buňce, ONM SUN domain proteins, INM. Nalezeny i u rostlin!!!!! Přemosťují jadernou obálku LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton)

69 Jaderná lamina Intermediární filamenta typu V V těsné vazbě na INM (inner nuclear membrane)

70 Laminy ~ 66 kda Laminy typu B ve všech buňkách Laminy typu A v diferencovaných buňkách

71 Nuclear envelope structure and function Funkce laminy Kotví proteiny INM a ONM Kotví telomery Organisuje chromatin Regulace transkripce, umlčování Kotví jaderné póry Organisuje cytoskelet Starr et al. 2007

72 Laminy u rostlin? 80 th - 90 th : Jádra cibule Yu et al. Exp. Cell Res Imunolokalizace: lamin-like proteiny v jádrech cibule a hrachu Anti-chicken lamin in onion Anti-human lamin B in pea Minguez et al., JCS 1993 McNaulty and Saunders, JCS 1993

73 Bioinformatika: Lamin-like proteiny u rostlin: NMCP1 alias LINC NE lamin-kódující geny, ale: NMCP1 z mrkve, LITTLE NUCLEI (LINC) v Arabidopsis 134 kda protein matrix Arabidopsis mutanty wt linc1 linc2 Dittmer et al. 2007, Plant Cell

74 Plant lamina PLAMINA? Fiserova et al. (2009), Plant J.

75 Transport dovnitř a ven z jádra

76 Jaderné Based on EM póry observations

77 Struktura póru Cytoplasmatická vlákna/fibrily Centrální část -??? Jaderný košíček Osmičetná symetrie

78 Nucleoporiny, Nups 30 Nups - 450/NPC FG-Nups Alber et al. 2007, Nature Devos et al. 2003

79 FG-Nups obsahují FG-domény Tzn. bohaté na Phe a Gly

80 Transport dovnitř a ven z jádra

81 Cyklus RanGTPázy

82 Transportní mechanismus? Jak je udržována permeabilní bariéra? 1. hydrogel, síto 2. brush-like model - energie

83 Jaderné póry u rostlin Identifikace Nups: Mutantní rostliny Arabidopsis - cca 1/3 Nups Proteomika většina Nups

84 Nups rostlin Tamura 2010

85 Plant nuclear pores: What the mutants tell us? Mutantní Arabidopsis Interakce rostlina-bakterie Resistence k patogenům Hormonální poruchy (auxin) Tolerance k chladu Množství vývojových vad Parry et al. 2006, Plant Cell Defekt mrna exportu Jacob et al. 2007, Plant Physiol

86 Buňky tabáku, BY-2

87 Jádra tabákových buněk BY-2 Skenovací elektronový mikroskop SEM 1 mm 1 mm Fišerová et al. (2009), Plant J.

88 Pohled z cytoplasmy Jaderné póry v buňkách BY-2 Pohled z jádra Xenopus pore Fiserova et al. (2009), Plant J. Fišerová et al. (2009), Plant J.

89 NPC organisation over NE in 10-day-old cells Fišerová et al. (2009), Plant J.

90 Jaderné dělení

91 Prophase Anaphase A Prometaphase Anaphase B Metaphase Telophase Scholey et al. 2003, Nature

92 Rozpad a obnovení jaderné membrány vyšší eukaryota nižší eukaryota, houby rostliny živočichové S. pombe S. cerevisiae Drosophilla C. elegans Aspergillus Guttinger et al. 2009, Nat Rev.

93 NEBD, nuclear envelope break down HeLa Guttinger et al. 2009,Nat Rev.

94 Sestavení jaderné membrány HeLa Guttinger et al. 2009, Nat. Rev.

95 Poruchy, defekty a vývojové vady Laminopathie Muscle disorders Peripheral neuropathies Progerias Tumor progression Předčasné stárnutí Poškození laminy

96

97 Chromatin states Luong, P. Basic Principles of Genetics, Connexions Web site (2009)