CYTOLOGIE 3. týden. Jádro a jeho komponenty Buněčný cyklus, mitosa, meiosa. Ústav histologie a embryologie

Transkript

1 CYTOLOGIE 3. týden Jádro a jeho komponenty Buněčný cyklus, mitosa, meiosa Ústav histologie a embryologie MUDr. Radomíra Vagnerová, CSc. Předmět: Obecná histologie a obecná embryologie Přednášky 2. paralelka 14. a

2 JÁDRO NUCLEUS Membránou ohraničený kompartment - u eukaryotických buněk obsahuje genetickou informaci - zajišťuje jejich autoreprodukci, diferenciaci, maturaci a funkci. jádro s hrudkovitým chromatinem Mikrofotografie: Sbírka ÚHIEM měchýřkovité jádro s dobře patrným jadérkem Stavební složky (komponenty) jádra buňky v interfázi chromatin (komplex DNA a proteinů) jadérko (nucleolus) obal jádra jaderná matrix

3 Jádro v interfázi - chromatin (komplex DNA a proteiny), jadérko (nucleolus), jaderný obal, jaderná matrix (nukleoplasma) - nukleoskelet, Jaderný obal - dvě membrány, perinukleární cisterna, jaderné póry, lamina fibrosa (laminy IMF, k lamina fibrosa připojené chromosomy) Jadérko - místo syntézy rrna a tvorby ribosomových podjednotek nukleolární organizátor (sekvence bazí DNA kódujících rrna), pars fibrosa (iniciální ribonukleoproteinová vlákna), pars granulosa (dozrávající ribosomy),

4 BUNĚČNÉ JÁDRO (schema) jádro jadérko lamina fibrosa HC jaderný obal F ribosomy EC G heterochromatin (HC), euchromatin (EC), pars fibrosa (F), pars granulosa (G) Schéma: Junqueira, Carneiro, Basic Histol, 2003

5 JÁDRO - (elektronogram) perinukleolární heterochromatin (asociovaný s nukleolem) perinukleární prostor (cisterna) euchromatin (EC) heterochromatin (HC) NUKLEOLUS marginální heterochromatin (připojený k lamina fibrosa) EC zevní jaderná membrána (perinukleární prostor) ribosomy připojené k zevní jaderné membráně Elektronogram: Basic Histology, Junqueira, Carneiro, 2003

6 JADERNÝ OBAL Světelný mikroskop tenká linie ohraničující jádro Elektronový mikroskop - obal tvořený dvěma membránami - perinukleární prostor (cisterna) mezi oběma membránami k zevní membráně mohou být připojeny polyribosomy místy je membrána napojena na zrnité ER k vnitřní membráně - připojena lamina fibrosa (LF) - - tenká elektrondenzní proteinová vrstva s funkcí jaderného skeletu. Je tvořená sítí intermediárních filament (IMF) složených z laminů (proteiny), navázaných na laminové receptory vnitřní jaderné membrány. LF zajišťuje připojení chromatinových vláken k vnitřní membráně jaderného obalu pomocí asociovaných proteinů Na počátku mitosy vymizí LF a laminy se uvolňují, na konci anafáze se laminy opět uspořádají do intermediárních filament a LF plní důležitou funkci při rekonstrukci jaderného obalu v telofázi. - jaderné póry

7 JADERNÝ OBAL (šipky - jaderné póry) Hitsology, Ross and Pawlina,, 2006 JADERNÉ PÓRY - elektronogram, metoda mrazového lomu

8 JADERNÉ PÓRY Okrouhlé až osmihranné (oktagonální) otvory v jaderném obalu o průměru 70 až 80 nm Jaderné póry - proteinové komplexy (složené z 50 různých proteinů - - nukleoporinů), které protínají jaderný obal a vytvářejí nukleární pórový komplex Selektivní obousměrný transport látek mezi jádrem a cytoplasmou Transport iontů a malých hydrofilních molekul - prostou difusí Transport velkých molekul (velké proteiny a makromolekulární komplexy) - - založen na rozpoznání specifických signálních sekvencí uvnitř jádra (nukleární lokalizační signál a nukleární exportní sekvence) receptorovými molekulami (importiny, exportiny), které realizují transport pórovým kanálem za přítomnosti GTP, který zajišťuje pro transport energii Import do jádra - histony, laminy, ribosomové proteiny, transkripční faktory, hormony (steroidy) Export z jádra - ribosomové podjednotky, mrna, trna, transkripční faktory

9 SCHEMA JADERNÉHO PÓROVÉHO KOMPLEXU proteinové fibrily subjednotka cytoplasmatického prstence centrální kostra subjednotka nukleoplasmového prstence jaderný koš CYTOPLASMA zevní jaderná membrána Obvod póru 8 proteinových podjednotek - osmiboká centrální kostra - vložena mezi cytoplasmatický a nukleoplasmový prstenec Do cytoplasmy vstupuje z cytoplasmatického prstence 8 krátkých proteinových fibril lamina fibrosa (nukleární lamina) luminální podjednotka centrální pór vnitřní jaderná membrána terminální prstenec Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011 JÁDRO Nukleoplasmový prstenec - zakotven - do koše z osmi tenkých filament připojených k terminálnímu prstenci.

10 Vnitřní a zevní jaderná membrána perinukleární prostor (cisterna) granulární ER (GER) LAMINA FIBROSA (jaderná lamina) jaderný pór jádro nukleární lamina fibrosa - - síť intermediárních filament DNA vlákna chromatinu Histology, Ross, Pawlina, 2006 Obraz sítě (metoda mrazového lomu)

11 JADERNÁ MATRIX (nukleoplasma) Vysoce dynamická struktura - vytváří otevřený kompartment pro volnou difusi látek v jádře Amorfní hmota - z proteinů - enzymů, metabolitů a iontů Jaderný skelet (nukleoskelet) - síť proteinových mikrofibril o průměru 2 až 3 nm; udržuje tvar jádra a uspořádání jeho struktur Lamina fibrosa jaderného obalu - k ní připojené proteinové mikrofibrily nukleoskeletu

12 Tvar jádra, chromatinová struktura a počet nukleolů závisí na druhu buňky a její aktivitě DNA (genetická informace) - replikace v S fázi buněčného cyklu Počet chromosomů - somatické buňky - 46 chromosomů - 23 párů = diploidní počet - 2n (jedna sada otcovských a jedna sada mateřských chromosomů); 22 párů homologických chromosomů + 1 pár heterochromosomů (pohlavní chromosomy XY nebo XX). V buňkách ženského pohlaví zůstává trvale jeden X kondensován sex chromatin (Barrovo tělísko) - zralé pohlavní buňky (gamety) - 23 chromosomů = haploidní počet -1n Polyploidní počet chromosomů vzniká endomitosou (megakaryocyt až 64n) RNA - realizace genetické informace, vzniká traskripcí z DNA - tvořena jedním polynukleotidovýmřetězcem - tři druhy- mrna, trna a rrna - tvorba specifických bílkovin (enzymů) dlouhé raménko krátké raménko chromatidy (sesterské) Schema stavby chromosomu v metafázi obr. Google centromera

13 Chromosomy pozorované v transmisním EM (spermatogonie 1denního laboratorního potkana) Karyotyp (sada chromosomů) somatické buňky. Mužské chromosomy isolované z buňky v mitose. (použití speciálních fluorescenčních barviv - - FISH technika) Elektronogram Z. Jirsová XY Histology, Ross, Pawlina, 2011 XX chromosom z normálního karyotypu ženy

14 Molekula DNA se skládá ze dvou polynukleotidovýchřetězců uspořádaných do dvoušroubovice Stavební jednotkou chromatinu je nukleosom složený z oktamerního histonového jádra (8 histonů - H2A, H2B, H3 a H4 každý typ ze dvou molekul), okolo kterého je dvakrát ovinutá molekula DNA. Další segment DNA s připojeným histonem H1 tvoří spojnici s následujícím nukleosomem. Šňůra nukleosomů se dále stáčí a vytváří chromatinovou fibrilu o průměru 30 nm, která se skládá v kličky. Kličky chromatinové fibrily zakotvené do chromosomové kostry (složené z nehistonových proteinů) tvoří chromatinové vlákno interfázového jádra. Podle stupně kondensace se jeví jako heterochromatin nebo euchromatin. Heterochromatin tvoří úseky silně kondesovaných chromatinových vláken. Barví se hematoxylinem a dalšími basickými barvivy, dá se prokázat Feulgenovou reakcí. H1 H1 Euchromatin je složen z volně uspořádaných chromatinových vláken, kde je uložena převážnáčást transkribovaných genů EUCHROMATIN HETEROCHROMATIN V profázi buněčného dělení dochází k vystupňované kondenzaci chromatinových vláken do formy chromosomů Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006 metafázový chromosom

15 SCHEMA NUKLEOSOMU Středníčást - 8 histonových molekul (H2A, H2B, H3 a H4) Nukleosomy - dynamické struktury, uvolnění H1 a despiralisace DNA umožní přístup dalších proteinů (transkripční faktory, enzymy) k DNA H1 histon centrální DNA dvakrát obtočená (obsahuje kolem 150 bazí) vázající (připojovací) DNA Schéma: Junqueira s Basic Histology, Mescher, 2010

16 JADÉRKO (NUKLEOLUS) - není ohraničeno membránou, je místem syntézy rrna a tvorby ribosomových podjednotek - na koncových úsecích pouze pěti chromosomů - geny pro rrna - v interfázi probíhá transkripce (syntéza rrna) - počet jadérek a jejich velikost závisí na metabolické aktivitě buňky Nukleolární organizátor (NO) - DNA kódující rrna Pars fibrosa (PF) - ribonukleoproteinová vlákénka (5-10 nm) - obsahují primární transkripty rrna Pars granulosa (PG) -granulární materiál ze zrajících ribosomových podjednotek. Ribosomové proteiny - syntetizovány v cytoplasmě a transportovány do jádra, ribosomové podjednotky jsou exportovány nukleárními póry do cytoplasmy. Perinukleolární heterochromatin (NAC) - chromatin asociovaný s nukleolem NE jaderný obal, C - cytoplasma Schéma: Junqueira s Basic Histology, Mescher, 2010

17 Jadérko (nukleolus) Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006 Pars granulosa Pars fibrosa Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002 Fibrilární centrum (nukleolární organizátor DNA kódující rrna)

18 Jadérko v jádru nervové buňky Transmisní EM fibrilární centra (FC, organizátor nukleolu) a nukleolonemata SM - barvení hematoxylin-eosin jadérko (šipka) JADÉRKA FC Nukleolonemata (síť z fibrilárního a granulárního materiálu) Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006 Wheater s Functional Histology, 2011

19 BUNĚČNÝ CYKLUS Morfologické a biochemické pochody v buňkách mezi jejich vznikem a rozdělením na dvě dceřinné buňky Čtyři fáze buněčného cyklu: G 1 - (presyntéza) buněčný růst, syntéza RNA a proteinů, obnovení objemu buňky, některé buňky - příprava na diferenciaci (G 0 ) S - syntéza DNA, replikace DNA, chromosomy tvořené dvěma chromatidami G 2 - syntéza RNA a proteinu (tubulin), tvorba a akumulace energie pro nadcházející mitózu M - mitosa - vznik identických dceřinných buněk se stejným množstvím chromosomů a obsahem DNA Regulace buněčného dělení - rozhodující pro normální vývoj mnohobuněčných organismů (ztráta kontroly může vést k nádorovému bujení) Kontrola buněčného cyklu - CYKLINY a CYKLIN-dependentní kináza TUMOR - SUPRESOROVÉ GENY - kontrola normální buněčné proliferace

20 SCHEMA BUNĚČNÉHO CYKLU Restrikční uzlové body (branky) - pokračování umožňují CYKLINY a CYKLIN-dependentní kinázy (CDK) G 2 - post DNA duplikace syntéza tubulinu příprava na vznik mitotického vřeténka oddělování chromosomů (vznik chromatid) NBP (neproliferující buněčná populace) bod kontroly úplnosti replikace DNA G 1 - presyntéza DNA S - replikace DNA restrikční bod PBP (proliferující buněčná populace) Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006

21 MITOSA Dělení buněčného jádra s následným rozdělením buňky na dvě dceřinné buňky, geneticky identické s mateřskou buňkou FÁZE MITOSY Profáze - kondenzace replikovaných chromosomů ( spojené chromatidy COHESINEM chromatin vázající protein) spojených v místě centromery; tvorba mitotického vřeténka mezi centrosomy rozestupují se od sebe prometafáze - dezintegrace jaderného obalu (fosforylace nukleárních laminů - intermediární filamenta lamina fibrosa) - rozpad jaderného obalu; připojení chromosomů svými kinetochorami k mikrotubulům vřeténka; nejsou patrné nukleoly Metafáze - centriolové páry na pólech buňky, chromosomy v ekvatoriální rovině (metafázová ploténka), párové kinetochorové mikrotubuly na každém chromosomu jsou připojeny k opačným pólům vřeténka; mizí jaderný obal (vesikuly)

22 pól vřeténka replikovaný chromosom (sest. chromatidy) kinetochora PROTEINY ASOCIOVANÉ s mikrotubuly astrální mikrotubuly (nepřipojené) kinetochorové mikrotubuly polární mikrotubuly Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002 Pól mitotického vřeténka - centrosom (pár centriolů obklopený amorfní proteinovou matrix) - MTOC (mikrotubuly organizující centrum); mikrotubuly připojené svými (-)konci POLÁRNÍ mikrotubuly spojují oba póly mitotického vřeténka, mezi mikrotubuly vzájemné interakce PROTEINY ASOCIOVANÝMI s mikrotubuly (stabilisace jejich (+)konců a tím menší pravděpodobnost depolymerace); základní kostra vřeténka KINETOCHOROVÉ mikrotubuly po rozpadu jádra některé mikrotubuly vyrůstají svými (-)konci z MTOC centriolů a zapojují se do kinetochor - - každý zreplikovaný chromosom je připojen k oběma pólům vřeténka ASTRÁLNÍ mikrotubuly ukotvení centrosomů k buněčné membráně

23 Anafáze - cohesinová spojení mezi chromatidami se rozštěpí SEPARASOU (proteolytický enzym), oddělení sesterských chromatid anafáze A - zkracování kinetochorových mikrotubulů depolymerací od (+) konce (od kinetochory) - chromatidy směřují k opačným pólům mitotického vřeténka anafáze B - vzdalují se póly vřeténka - polární mikrotubuly polymerují, prodlužují se a klouzavým pohybem po sobě tlačí oba póly od sebe; astrální mikrotubuly pólů vřeténka táhnou póly směrem k povrchu buňky - hybné síly - mikrotubulární motorové proteiny (kinesinové motory) anafáze A i B průběh současně anafáze A anafáze B chromosomy k opačným pólům vřeténka vzdalování pólů 1 - klouzavá síla mezi polárními mikrotubuly 2 - tažná síla přímo na póly vřeténka Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002 polymerace polárních mirotubulů na (+) konci

24 Telofáze - rekonstrukce jaderného obalu (defosforylace laminů), dekondensace chromosomů, obnova jadérek Cytokinese - prodloužení buněk, zaškrcení uprostřed mezi póly mitotického vřeténka ( štěpná brázda ); separace je způsobena pásovitým zaškrcením (aktinová filamenta, myosin) Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002

25 jaderná membrána centrioly MTOC centroméra PROFÁZE mikrotubuly vřeténka pól mitotického vřeténka mikrotubuly kinetochory PROMETAFÁZE zbytky jaderného obalu - vesikuly polární mikrotubuly ekvatoriální rovina METAFÁZE Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993 Kerr, Functional Histol, 2010

26 vesikuly jaderného obalu migrují k pólům prodloužení polárních mikrotubulů ANAFÁZE chromatidy směřují k pólům zkrácení mikrotubulů kinetochor dekondenzace chromosomů TELOFÁZE obnova jaderného obalu centrioly CYTOKINEZE akto-myosinové zaškrcení Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993 Kerr, Functional Histol, 2010

27 M M M M M M mitotické figury - M M M mitóza (leukocyty)

28 MEIOSA - redukční dělení pohlavních buněk (gametogenese) vznik buněk s haploidním počtem chromosomů - do každé zárodečné buňky pouze jedna sada chromosomů z původní diploidní buňky Meiosa I první zrací dělení PROFÁZE I - dlouhá - pět stádií LEPTOTEN - kondenzace chromatinu, každý homologický chromosom - ze dvou sesterských chromatid ; chromosomy připojené k jadernému obalu ZYGOTEN - seskupení homolog. chromosomů do párů synapse (konjugace), vytvoření synaptonemálních komplexů mezi homologickými chromosomy homologické chromosomy nesesterské chromatidy počátek vzniku synaptonemálního komplexu centromera sesterské chromatidy jaderný obal mateřský X chromosom otcovský X nebo Y chromosom SYNAPSE centrioly počátek konjugace (synapse) homolog. chromosomů LEPTOTEN ZYGOTEN Histol and Cell Biol. Kierszenbaum, 2007

29 PACHYTEN - homologické chromosomy - po délce zcela spojeny synaptonemálním komplexem - kompletní synapse (bivalenty); COHESIN- upevňuje spojení mezi sesterskými chromatidami; rekombinační uzlíky (kolem 90 nm) - přerušení a překřížení (crossing-over) nesesterských chromatid výměna úseků chromatid (genových lokusů); rekombinace (opětovná rekonstrukce chromatid); chiasmata (dočasná spojení míst výměny - jejich počet odpovídá počtu překřížení) DIPLOTEN - oddělení homologických chromosomů (bivalentů) - disjunkce (desynapse) - začíná v místě centromery směrem k periferii jádra; přetrvává spojení bivalentů jedním nebo více chiasmaty v místech, kde proběhl crossing-over; přesun chiasmat ke konci chromosomu (terminalisace) - - na konci stádia; replikace centriolů DIAKINESE kondenzace chromosomů (zkracují se, dosahují maximální tloušťky), dezintegrace jaderného obalu, uvolnění chromosomů ze spojení s jaderným obalem; tvoří se dělící vřeténko centromera rekomb. uzlík synaptonemální komplex crossing-over COHESIN chiasma disjunkce (desynapse) chromosomů chiasma chiasma (morfologická representace crossing-over) PACHYTEN DIPLOTEN DIAKINESE mikrotubuly vřeténka Histol and Cell Biol. Kierszenbaum, 2007

30 METAFÁZE I - metafázové uspořádání chromosomů v - ekvatoriální rovině; homologické chromosomy v časné metafázi ještě spojeny chiasmaty; později uvolnění chiasmat ANAFÁZE I - homologické chromosomy - homology (spojené cohesinovými komplexy a centromérami) se od sebe oddělíčinností dělícího vřeténka a putují k protilehlým pólům buňky; náhodná distribuce homologů ( mateřský nebo otcovský homologický chromosom je náhodně navázán na různém místě metafázové ploténky) do dceřiných buněk - přispívá ke genetické rozmanitosti TELOFÁZE I oddělení dceřiných buněk s haploidním počtem chromosomů (tvořené dvěma chromatidami) PO PRVNÍM ZRACÍM DĚLENÍ NEDOCHÁZÍ K SYNTÉZE (REPLIKACI DNA) Meiosa II druhé zrací dělení - nastupuje bez S fáze charakter mitózy profáze II, metafáze II, anafáze II, telofáze II enzym SEPARASA (proteasa) rozštěpí COHESIN PROTEINOVÝ KOMPLEX mezi sesterskými chromatidami, dojde k uvolnění vazby v oblasti centromer a oddělení sesterských chromatid vzniknou dceřiné buňky s haploidním počtem jednoduchých chromosomů - chromatid (1n) a s polovičním obsahem DNA (1d) Při oplození - obnoví se diploidní počet chromosomů (46) - počet chromosomů nevzrůstá

31 PREMITOTICKÁ/MEIOTICKÁ FÁZE dva páry homologických chromosomů MITOSA profáze metafáze anafáze telofáze G 1 fáze G 2 fáze profáze I LEPTOTEN ZYGOTEN PACHYTEN DIPLOTEN DIAKINESE metafáze I SPERMATO- GENESE anafáze I telofáze I OOGENESE MEIOSA MEIOSA I dceřiné buňky Buňky produkované mitosou - geneticky identické spermatidy metafáze II první pólové tělísko druhá pólová tělíska MEIOSA II spermie zralý oocyt Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011 Buňky vzniklé meisou - geneticky specifické (jedinečné)