Cytologie Buněčné jádro. Jindřiška Fišerová, Ph.D. Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i

Transkript

1 Cytologie Buněčné jádro Jindřiška Fišerová, Ph.D. Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i

2 Cíle přednášky Prozkoumat význam jádra Pochopit principy a mechanismy jaderného fungování

3 Funkce jádra Uchování a přenos genetickéinformace TranskripceDNA (syntéza mrna trna rrna) Transkripce DNA (syntéza mrna, trna, rrna) Sestřih RNA Oprava poškozené DNA

4 STRUKTURA, ORGANIZACE, FUNKCE Periferie Transport Chromatin a chromosomy

5 Cíle přednášky Prozkoumat význam jádra Pochopit principy a mechanismy jaderného fungování Porozumět vztahu mezi současnými poznatky a metodologií výzkumu ýk

6 M. Schleiden 30. léta 19. st A. Van Leeuvenhoek R. Wirchow 1876 O. Hertwig 50. léta 19. st G. Mendel 1900 T. H. Morgan 1953 Watson and Crick

7 Metody výzkumu fotografie zvýraznění video extrakce fígle a triky

8 Metody výzkumu Elektronová mikroskopie transmisní TEM Elektronová mikroskopie skenovací SEM Mikroskopie fluorescenční: FISH, imunofluorescence Super rezoluční mikroskopie SIM, STED, PALM, STORM Imunoprecipitace (ChIP, ChIP Chip, ChIP seq) Genové manipulace, DamID IDfůze

9 Elektronová mikroskopie jak funguje?

10 TEM a SEM dávají odlišnou informaci 2Dprojekce tenkého řezu fi!!!! žň j vždy 3Dobraz povrchových struktur Tomografie!!!! umožňuje 3D rekonstrukci

11 TEM SEM Fixace Dehydratace Zalití do pryskyřice Řezání Zvýraznění kovem Fixace Dehydratace Sušení Pokovení

12 Cílené značení Immunogold labelling

13 CRYO elektronová mikroskopie Vzorek pozorujeme stále hluboce zmrazený! Výhody: perfektní fixace i rozlišení zachovány ultrastruktury Nevýhody: drahá aparatura, velmi náročné technicky i finančně vzorek málo kontrastní

14 TEM CRYO TEM

15 3D TEM: Trojrozměrné zobrazení pomocí EM neboli elektronová TOMOGRAFIE

16 Sbírání dat natáčením 1 objektu Tloušťka řezů nm dle možnosti EM napětí (alespoň 400kV) Série projekcí řezů otočených +/ 60 80

17

18 Tomogram

19 Tomogram

20 Segmentace a mapování struktur Beck et. al 2004, Science

21 Super resolution superrezoluční mikroskopie Na principech fluorescenční mikroskopie Různými způsoby překračuje rozlišení světelné mikroskopie Rozlišení, Abbe limit, point spread function (PSF) 4Pi, PALM, STORM, SIM, STED

22 Schermelleh et al. 2010, J. Cell Biol. Vol. 190 No

23 Schermelleh et al. 2010, J. Cell Biol. Vol. 190 No

24 DAPI CENPE TPR STED images of HeLa Nup62 TPR Fišerová J, 2015, unpublished

25 FISH: fluorescence in situ hybridisation Zjišťuje přítomnost a polohu DNA sekvence na chromosomu. Fluorescenční barvička + specificka sekvence oligonukleotidu. Naváže se specificky k DNA chromosomu Používa se při detekci chromosomálních přestaveb a zlomů, druhové identifikaci, expresní profil buněk a tkání.

26 Chromatin immunoprecipitation, ChIP Identifikace DNA vazebních míst pro konkrétní proteiny Mapa interakcí DNA protein IN VIVO ChIP chip, ChIP seq

27 Procesy interfázních jader

28 Funkce jádra Uchování a přenos genetickéinformace TranskripceDNA (syntéza mrna trna rrna) Transkripce DNA (syntéza mrna, trna, rrna) Sestřih RNA Oprava poškozené DNA

29 C value a C paradox C value: kompletní množství DNA v haploidním genomu Zvyšující se komplexita organismu nutně neznamená větší genom! Sc: 12,495,682bp 5770 genů 2n = 32 chromosomů Dm: 122,653,977 13,379 8 At: 115,409, , Rýže 3.9 x , Hs: 33x , Tulipán, pšenice, žito 10xvíce DNA než člověk. Zvyšování ploidie!! Tabák 4n = 48 Pšenice, žito, 6n = 42

30 Organisace genomu Gen kompletní sekvence nukleové kyseliny nezbytná k syntéze funkčního produktu Lineární molekula DNA, 100x delší než buňka sbalování!!! 1. Jakým způsobem je organisována DNA 2. Jakým způsobem je jádro organisováno

31 Struktura a organisace b. jádra Interfáze: Chromatin DNA + protein Euchromatin aktivní Heterochromatin nečinný, konstitutivní, fakultativní Silencing při diferenciaci Mitoza: chromosomy Jd Jaderná matrix ti (nukleoplasma) l skelet? klt? Jaderná obálka + jaderné póry 6 10 μmm Asi 10% buněčného objemu 1 μm Vnitřní kompartmentalizace jádra!!! Kompartmenty bez membrány: jadérko

32 Chromatin, chromosomy

33

34

35 Chromatin Extrakce pomocí solí korálky na niti: Linker DNA + nukleosomy

36 Nukleosom Základní strukturní a funkční jednotka chromatinu DNA kol oktamerového jádra histonů 10 nm, 1 2/3 otáčky Histony: rodina malých bazických proteinů, hlavní typy H1, H2A, H2B, H3, H4 Shama et al , Biophys J. Luger et al. 1997, Nature

37 Histone code Zašifrované konce

38 H3K4me2, Ac aktivní chromatin H3K9me2+3 neaktivní chromatin H3K27me3 neaktivní chromatin, inaktivace X chromosomu H3K36me3 neaktivní chromatin

39 Histone acetyltransferáza Histone deacetyláza Histone metyltransferáza Chromodoména Chromoshadow doména Hraniční elementy!

40

41 Cik Cak model šroubovice Woodcock et al. 1984, JCB

42 Solenoid Robinson et al. 2006, PNAS

43 Vyšší struktury chromatinu Nehistonové proteiny lešení + integrita DNA SARs/MARs (Scafold associated regions/matrix associated regions) úseky mezi transkripčně aktivními smyčkami pomocí in situ hybridizace smyčky 1 4 Mb dlouhé Insulátory isolují od sebe jednotlivé transkripční jednotky, SARs/MARs mohou fungovat jako insulátory Chromosomální teritoria chromosom není volně rozprsknut skrz jádro

44 SMC proteiny (structure maintenance of chromosome proteins) mohou svázat 2 30nm vlákna dohromady Asociují s chromatinem mezi geny Struktura chromosomů!

45 Chromosom 2 chromatidy spojené centromerou telomery Pro replikaci musí každý chromosom obsahovat: origin, centromera, telomery U vyšších eukaryot se na centromeře tvoří kinetochor Po mitose chromosomy dekondensují jen částečně Jen velmi malá frakce dekondensuje na 10 30nm vlákno Chromosomální teritoria

46 Buněčný cyklus

47 Chromosomal territories (CT) Jednotlivé chromosomy v jádře zaujímají konkrétní polohu CT Chromocentrum (heterochromatin) organisuje CT CT velmi dynamická, mezi buňkami si neodpovídají, nepřekrývají se Cremer and Cremmer 2001, Nat. Rev. Genet.

48 Gene rich Gene poor Lymfocyt člověka Cremer and Cremmer 2001, Nat. Rev. Genet.

49 Model organisace chromatinu v rámci chromosomálních teritorií Nenáhodná poloha genů uvnitř jádra!!!

50 P. Fransz

51 Arabidopsis Heterochromatin Chromocentrum Exner and Hennig 2008, Curr. Opin. Plant Biol. pšenice 100x větší genom!! Shaw et al. 2002, J. Struct. Biol

52 Jaderné kompartmenty Jaderná periferie Jaderný transport

53

54 Jadérko továrna na ribosomy Sirri et al. 2008, Histochem. Cell Biol 700 proteinů, ů 150 sno RNAs, 2 RNP Tvořeno rdna několika chromosomů Podléhá buněčnému cyklu FC Fibrilar component DFC dense fibrilar component GC Granular component

55 Arabidopsis nucleoli

56 Tobacco BY 2 nucleoli

57 Cajal bodies coilin Clastosome OPT doména Paraspeckles Cleavage body Nuclear speckles SC35, SF/ASF Stresová tělíska Perinucleolar compartment PML tělíska PML Polycomb Spector 2006, Cell

58 Periferie jádra Velmi heterogení Mikrodomény různé funkce a složení Oblasti heterochromatinu, ztišených genů radiální organisace jádra

59 Periferní mikrodomény DamID fuze odhalila lamin associated domains (LADs) LADs: cca 500 kb dlouhé úseky DNA, genově chudé Telomery a subtelomery blízko jaderné periferie Represivní podmínky k expresi x i zde permisivní domény

60 KASH domain proteins: KASH doména cca 30 AA, role při umístění jádra v buňce, ONM SUN domain proteins, INM. Nalezeny i u rostlin!!!!! Přemosťujíjadernouobálku jadernou obálku LINC (linkerof nucleoskeleton andcytoskeleton)

61 Jaderná lamina Intermediární filamenta typu V V těsné vazbě na INM (inner nuclear membrane)

62 Laminy ~ 66 kda Laminy typu B ve všech buňkách Laminy typu A v diferencovaných buňkách

63 Nuclear envelope structure and function Funkce laminy Kotví proteiny INM a ONM Kotví telomery Organisuje chromatin Regulace g transkripce, umlčování Kotví jaderné póry Organisuje cytoskelet Starr et al. 2007

64 Laminy u rostlin? 80 th 90 th : Jádra cibule Yu et al. Exp. Cell Res Imunolokalizace: lamin like proteiny v jádrech cibule a hrachu Anti chicken lamin in onion Anti human lamin B in pea Minguez et al., JCS 1993 McNaulty and Saunders, JCS 1993

65 Lamin like proteiny u rostlin: NMCP1 alias LINC Bioinformatika: NE lamin kódující geny, ale: NMCP1 z mrkve, LITTLE NUCLEI (LINC) v Arabidopsis 134 kda protein matrix Arabidopsis mutanty wt linc1 linc2 Dittmer et al. 2007, Plant Cell

66 Plant lamina PLAMINA? Fiserova et al. (2009), Plant J.

67 Transport dovnitř a ven z jádra

68 Jaderné Based on EM póry observations

69 Struktura póru Cytoplasmatická vlákna/fibrily y p / y Centrální část??? Jaderný košíček Osmičetná symetrie

70 Nucleoporiny, Nups 30 Nups 450/NPC FG Nups Alber et al. 2007, Nature Devos et al. 2003

71 FG Nups obsahují FG domény Tzn. bohaté na Phe a Gly

72 Transport dovnitř a ven z jádra

73 Cyklus RanGTPázy

74 Transportní mechanismus? Jak je udržována permeabilní bariéra? 1. hydrogel, síto 2. brush like model energie

75 Jaderné póry u rostlin Identifikace Nups: Mutantní rostliny Arabidopsis cca 1/3 Nups Proteomika většina Nups

76 Nups rostlin Tamura 2010

77 Mutantní Arabidopsis Plant nuclear pores: What themutants tell us? Interakce rostlina bakterie Resistence k patogenům Hormonální poruchy (auxin) Tolerance k chladu Množství vývojových vad Defekt mrna exportu Parry et al. 2006, Plant Cell Jacob et al. 2007, Plant Physiol

78 Buňky tabáku, BY 2

79 Jádra tabákových buněk BY 2 Skenovací elektronový mikroskop SEM 1 m 1 m Fišerová et al. (2009), Plant J.

80 Pohled z cytoplasmy Jaderné póry v buňkách BY 2 Pohled z jádra Xenopus pore Fiserova et al. (2009), Plant J. Fišerová et al. (2009), Plant J.

81 NPC organisation over NE in 10 day old cells Fišerová et al. (2009), Plant J.

82 Jaderné dělení

83 Prophase Anaphase A Prometaphase Anaphase B Metaphase Telophase Scholey et al. 2003, Nature

84 Rozpad a obnovení jaderné membrány vyšší eukaryota nižší eukaryota, houby rostliny živočichové S. pombe S. cerevisiae Drosophilla C. elegans Aspergillus Guttinger et al. 2009, Nat Rev.

85 NEBD, nuclear envelope break down HeLa Guttinger et al. 2009,Nat Rev.

86 Sestavení jaderné membrány HL HeLa Guttinger et al. 2009, Nat. Rev.

87 Poruchy, defekty a vývojové vady Laminopathie Muscle disorders Peripheral neuropathies Progerias Tumor progression Předčasné stárnutí Poškození laminy

88