SACHARIDY ANALYTICKÉ ÚKOLY. Kvalitativní analýza identifikace, určení konfigurace, konformace. Kvantitativní analýza.

Transkript

1 SACHARIDY zdroj energie funkční vlastnosti textura údržnost chutnost interakce s jinými složkami aromatickéa chuťovélátky pigmenty ANALYTICKÉ ÚKLY Kvalitativní analýza identifikace, určení konfigurace, konformace Kvantitativní analýza Handbook of Food Analytical Chemistry: Background Information The analytical methodology for the determination of sugars has improved dramatically and is continually evolving. The traditional wet chemistry and enzymatic assays that detected classes of sugars (e.g., reducing sugars) have largely been replaced by chromatographic methods utilizing both gas-liquid (GLC) and high-performance liquid (HPLC) chromatography. These methods offer high specificity and the ability to detect several sugars at the same time, and have been actively developed over the past two decades. The HPLC technique is the key method for routine sugar analysis. 1

2 1. VLNÉ SACHARIDY 1. IZLACE extrakce: voda, 80 % ethanol 2. ČIŘENÍ odstranění optickyaktivních látek zroztoku cukrů (taniny, aminokyseliny, glykosidy) odstranění koloidních látek (proteiny) odbarvení roztoku (různépigmenty) G nesmí docházet k adsorbci cuků nesmí docházet ke změně spektra cukrů Chirální molekula Nejčast astěji využívan vaná čiřidlaidla neutrálníoctan olovnatý (roztokpbv CH 3 CH) zásaditý octan olovnatý (Pbs Pb(CH 3 CH) 2 ) = směs zásaditých octanů (Pb(H)CCH 3 nebo Pb 3 (H) 4 (CCH 3 ) 2 ) -nevhodnýpro redukujícícukry kyselina hexakiswolframanofosforečná (fosfowolframová) H 3 [P(W 3 10 ) 4 ] kyanoželeznatan zinečnatý (Carrezovo činidlo) 2 ZnS 4 K 4 ] Zn 2 ] 2 K 2 S 4 - univerzální aktivní uhlí - může adsorbovat cukry -kvalit. analýza měničeiontů -odstraňují bázickéa kyseléinterferenty hydroxid hlinitý -pro produkty bohaté na fruktózu zásaditýdusičnan olovnatý (adiční sloučenina PbsPb(N 3 ) 2 ) -Herlesovo činidlo) 2

3 Důkazy cukrů becnéreakce (kyselina jodistás hydroxyskupinami) Barevnéreakce (konc. kyselinasírová deriváty furalu kondenzačníproduktys 1-naftolem) Chromatografické metody (jednotlivé-tlc) 1. FYZIKÁLN LNÍ METDY A. Refraktometrie index lomu závisí na hustotě roztoku předpoklad: konstantníteplota a fixní vlnová délka zdroje - (běžně 20 C, sodíkovád čára) kalibrace refraktometrů: *index lomu potřeba přepočtu koncentrace z tabulek * Brix-přímokonc. roztoků čistésacharózy(hm. %) Důležité: konstantní teplota Abbého refrektometr 3

4 B. Polarimetrie sloučeniny s chirálním centremjakojsou cukrystáčí rovinupolarizovanéhosvětla úhelotočení (rotace) závisí nakoncentraciroztoku Chirálnícentrum zrcadlo specifická rotace: [a] T D = 100 a / l.c T... teplota ve C D...vlnovádélkasodíkové lampy (λ=589) a......pozorovaná optická rotace l...optická dráha(délka kyvety) v dm c...koncentrace (g/100ml nebo %w/v) stanovení sacharózy v přítomnost jiných cukrů fi dvojí polarizace (před a po inverzi) C. Hydrometrie měření hustot roztoků cukrů - BrixneboBaumé faktory ovlivňuj ující odečet et: teplota povrchovénapětí přítomnost povrchovýchfilmů dřívedensitometrickéměření pyknometrem (při 20/20 C nebo20/4 C aodečet obsahucukru ztabulek) 4

5 D. CHRMATGRAFICKÉ METDY Chromatografie v plošnémuspořádání - TLC detekce -využití redukčních schopností -barevné reakce derivátů 2-furaldehydu * kvalitativní analýza -hodnoty R f -barevné reakce *(semi) kvantitativní analýza -"in situ" - podetekcidensitometrem - po eluci, nejčastějispektrofotometrické metody KAPALINVÁ CHRMATGRAFIE (HPLC) Stanovení jednotlivých cukrů v připravených extraktech či přímý nástrřik vzorků (nápoje) u stacionárn rní fáze - nejčastěji měniče iontů (anexy, katexy) u mobilní fáze - voda, směs voda -CH 3 CN, pufry u detektor tor - refraktometrický elektrochemický spektrofotomertrický (derivatizace) 1 Glukosa, 2 Fruktosa, 3 Sacharosa HPLC stanovení sacharidů v pomerančovém džusu Kolona: CarboPacPA-1 (anex, 4 x 250 mm) Mobilní fáze: 0,1M hydroxid sodný Pulsníamperometrický detektor 5

6 305 x 7.8 mm HC-75 Calcium Form (P/N 79436) 1. Sucrose 2. Glucose 3. Fructose 4. Mannitol 5. Sorbitol Conditions: Deionized Water. Isocratic. 90 C. Flow: 1.2 ml/min. Injection: 20 µl Detection: Refractive Index FIA: flow injection analysis (průtoková analýza) Automatizované stanovení redukujících cukrů Princip: 1. zavedení vzorku do proudu reagenčního činidla 2. reakce analytů 3 detekce

7 PLYNVÁ CHRMATGRAFIE Vysoký obsah polárních skupin, netěkavé převedení cukrů na těkavéderiváty: derivatizace estery-hlavně acetáty ethery-hlavně methyletheryatrimethylsilylethery cukrů, jejich alditolů nebo oximů separace: silikonové stacionární fáze, detekce: FID * redukce, oximace: R CH H2 (NaBH4) R CH2H R CH NH2H R CH NH H2 * převedení na acetáty ty: CH (CH H) n-2 CH2H aldosa redukce CH2H (CH H) n-2 CH2H alditol n(ch 3C) 2 -nch 3 CH CH 2 (CH C CH 2 C CH 3 C CH 3 ) CH 3 n-2 alditolhexaacetát 7

8 * převedení na trimethylsilylethery CH 2H H H H H, H 5 (CH 3) 3SiCl 5 HCl CH 2 Si(CH 3) 3 H Si(CH 3) 3 Si(CH 3 ) 3 (CH 3) 3Si Si(CH 3) 3 1,2,3,4,6- penta(trimethylsilyl) ether glukózy Silylační činidla -různésloučeninyajejich směsi, např.: H 3C CH 3 Si Cl CH 3 H 3 C CH 3 Si NH CH 3 CH 3 Si CH 3 CH 3 trimethylchlorsilan (TMCS) hexamethyldisilazan (HMDS) Srovnání předností HPLC and GC HPLC vhodná i pro výšemolekulárnísacharidy (polysacharidy) kratší časanalýzy GC vhodnázvláště pro monosacharidy větší citlivost detekce vyšší výtěžnost, lepší správnost jednoduššípříprava vzorkupřímáanalýza je možné separovat α- a β- anomery nutnáderivatizace, větší pracnost 2. CHEMICKÉ METDY metodyzaloženéna redukčníchschopnostech cukrů metody založené na barevnýchkondenzačních reakcích degradačníchproduktů cukrů G destruktivní časově náročné postupy 8

9 Stanovení redukujícíchcukrů 1. Metody založen ené na nestechiometrických reakcích ch reakce se solemikovů -hlavně Cu 2 v alkalickém prostředí cukr redukuje alkalický roztokcu 2 soli na Cu 2 množství nezreagované Cu 2 soli nebomnožství vyloučeného Cu 2 jezávislé na množstvípřítomného redukujícíhocukru redukující cukr Cu 2 fi Cu 2 oxidované degradační produktycukru alkalickýroztokměďnatésoli: Fehlingův(Soxhletův) roztok I: CuS 4, II: vínansodno-draselný, NaH Pozn. stanovení sacharózy poinverzi(hcl, záhřev) Složen ení alkalických roztoků měďnatých solí Metoda CuS 4 vínan NaH Na-K Laneho Eynonova (Soxhletův roztok) fnerova Luffova Schoorlova Potteratova Eschman Rotscheho Somogyiho citronová kyselina Na 2 C 3 Na 2 HP 4 octan Na 9

10 1.1 Metody založen ené na stanovení oxidu měďm ěďnatého VÁŽKVÉ METDY Přímé vážkové stanovení Cu 2, případně stanovení obsahu Cu po redukci -v parách methanolu -elektrolytickypo oxidacihn 3 na Cu(N 3 ) 2 TITRAČNÍ METDY Přímé stanovení Cu 2 se rozpustí - v HCl (ffner) - v octové kyselině - šťavelanu draselném (Somogyi), Cu se stanoví jodometricky : Cu 2 2 HC1 Cu 2 Cl 2 H 2 Cu 2 Cl 2 I 2 CuCl 2 CuI 2 I 2 2 Na 2 S 2 3 fi 2 NaI Na 2 S Nepřímé stanovení a) Cu 2 se rozpustí - vroztoku Fe 2 (S 4 ) 3 (Munson) -vnh 4 Fe(S 4 ) 2 (Quinsumbing,Thomas, Rotshaj.) Fe 2 se se stanoví manganometricky Cu 2 Fe 2 (S 4 ) 3 H 2 S 4 fi 2 CuS 4 2FeS 4 H 2 10 FeS 4 2 KMn 4 8 H 2 S 4 fi 5Fe 2 (S 4 ) 3 2 MnS 4 K 2 S 4 8 H 2 Cu 2 2 (NH 4 )Fe(S 4 ) 2 H 2 S 4 fi 2CuS 4 2 FeS 4 (NH 4 ) 2 S 4 H 2 10

11 b) Cu 2 se rozpustí - vhn 3, 2 Cu 2 10 HN 3 4 Cu(N 3 ) 2 N N 2 5 H 2 2 Cu 2 4 I - CuI 2 I 2 I 2 2 Na 2 S NaI Na 2 S 4 6 Cu 2 se stanoví komplexometricky (Potterat-Eschmann) Cu 2 Ind - Cu Ind Cu 2 H 2 Y 2- CuY 2-2 H Cu Ind H 2 Y 2- Ind - CuY 2-2 H Ind HY 2- = indikátor(murexid) = komplexon II (dvojsodnásůlethylendiamintetraoctovékyseliny) 1.2 Titračnístanovení založené naúplné spotřebě měďnatého činidla Roztok měďnatésoli se titrujecukernýmroztokemdo odbarvení (Soxhlet); -Případně zapřítomnostimethylenové modřijako indikátoru(lane-eynn) 1.3 Metodyzaložené na stanovení nespotřebovaných měďnatých iontů Často používaná Přebytek Cu 2 se stanovíjodometricky (Luff-Schoorl) 2 Cu 2 4 I - CuI 2 I 2 I 2 2 Na 2 S NaI Na 2 S

12 Stanovení redukujících cukrů metodou podle Luffa-Schoorla Spotřeba 0,1 N thiosíranu sodného (ml) Glukosa, fruktosa, invertní cukr (mg) 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 Laktosa bezvodá (mg) 3,6 7,0 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 Maltosa bezvodá (mg) 3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 2. Metody založen ené na stechiometrických reakcích ch Aldosy se oxidují na příslušné aldonové kyseliny R CH= oxidační činidlo R CH redukované činidlo Jodometrické stanovení R CH= I 2 3 NaH R CNa 2NaI 2H 2 I 2 2 Na 2 S NaI Na 2 S 4 6 Stanovení oxidací hexakyanoželezitanemdraselným R CH= 2 K 3 ] 3 KH R CK 2 K 4 ] 2 H 2 následuje * stanovení jodometrické 2 K 4 ] I 2 2 K 3 ] 2 KI I 2 2 Na 2 S NaI Na 2 S 4 6 * stanovení bichromatometrické 6 K 4 ] K 2 Cr H 2 S 4 K 3 ] 4 K 2 S 4 Cr 2 (S 4 ) 3 7 H 2 12

13 3. Stanovení spektrofotometrické 1.. XIDACE ALDÓZY ZY: * hexakyanoželezitanem elezitanem, vzniklý hexakyanoželeznatan reaguje sfe 3 na berlínskoumodř R CH= 2 K 3 ] 3 KH R CK 2 H 2 2 K 4 ] 3 K 4 ] 4 Fe 3 Fe 4 ] 12 K * tetrazoliovými solemi vzniká barevný formazan * 3,5-dinitrosalicylovou kyselinou vzniká barevná 3-amino-5-nitrosalicylová kyselina CH R CH H NaH 2N N 2 R CNa CH H 2 N NH 2 3-amino-5-nitrosalicylová kyselina 2. DEGRADACE CUKRU V KYSELÉM M PRSTŘED EDÍ Ł tvorbabarevných kondenzačníchproduktů chromogenů s různými činidly chromogeny pentosy: 2-furaldehyd methylpentosy: 5-methyl-2-furaldehyd hexosy: 5-hydroxymethyl-2-furaldehyd činidla 1-naftol anthron orcinol karbazol difenylamin indolaj. H H CH 3 orcinol anthron N H karbazol 13

14 Některé spektrofotometrické metodyzaložené na kondenzačních reakcích kyselina (%) H 2 S 4 (80) činidlo 1-naftol doba reakce (min) 3 teplota ( C) 100 cukr všechny cukry zbarvení purpurové HC1 (18) orcinol (Cu 2, Fe 3 ) pentosy >hexosy zelené H 2 S 4 (67) anthron hexosy> pentosy modré Absorpční spektrum ribosy, fruktosy a glukosy po reakci s orcinolem Křivka 1: ribosa, 2: fruktosa, 3: glukosa (1.2 µg/ml) BICHEMICKÉ METDY dříve hlavně mikrobiologické, dnes enzymové (specifické) ENZYMVÉ METDY kvantifikace reakčních produktů enzymové reakce - spektrofotometricky, elektrochem., enzymové elektrody rozklad substrátu enzymy-stanovení produktů konvenčně (fyzikální čichemické metody 14

15 Enzym č. I II III IV V VI VII hexokinasa triviální glukoso-6-fosfátdehydrogenasa glukosofosát-isomerasa invertasa, b-fruktosidasa, b-fruktofuranosidasa b-galaktosidasa galaktosodehydrogenasa melibiasa, a-galaktosidasa Název systematický ATP:D-hexosa-6-fosfát transferasa glukoso-6-fosfát:nadp oxidoreduktasa D-glukoso-6-fosfát ketol isomerasa β-d-fruktofuranoid fruktohydrolasa β-d-galaktosid galaktohydrolasa D-galaktosa: NAD oxidoreduktasa α-d-galaktosid galaktohydrolasa System č. EC EC EC EC EC EC EC D-glukosa ATP enzym I D-glukoso-6-fosfát ADP D-glukoso-6-fosfát NADP enzym II D-glukoso-6-fosfát NADPH H D-fruktosa ATP D-fruktoso-6-fosfát enzym I enzym III D-fruktoso-6-fosfát ADP D-glukoso-6-fosfát sacharosa H 2 enzym IV D-glukosa, D-fruktosa (lze stanovit i polarimetricky) laktosa H 2 enzym V D-glukosa D-galaktosa D-galaktosa NAD enzym VI D-galaktanová kyselina NADH H rafinosa H 2 enzym VII D-galaktosa sacharosa D-galaktosa NAD enzym VI D-galaktonovákyselina NADH H rafinosa H 2 melibiosa H 2 enzym IV enzym VII D-fruktosa melibiosa D-glukosa D-galaktosa 15

16 NH CH NH - H 2 Reakce využívané k detekci NH CH C NH 2 e 2 H CH CH2H NH2H CH - H2 CH NH 4 e 4 H H 2 CH 2 NH 2 16