Masarykova univerzita

Transkript

1 Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů Změny v transdukci signálu zprostředkované receptorem gp130 u embryonálních kmenových buněk za modifikovaných oxidačně-redukčních podmínek Diplomová práce 2009 Bc. Jan Kučera Vedoucí práce: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.

2 Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatně na základě rad a pokynů vedoucího s využitím zázemí Ústavu experimentální biologie. Všechny použité zdroje informací jsou v práci řádně citovány. V Brně, dne _

3 Na tomto místě bych rád poděkoval vedoucímu práce Mgr. Jiřímu Pacherníkovi, Ph.D. za příkladné vedení, čas, cenné rady a připomínky, které mi laskavě poskytl. Dále děkuji laborantce Bc. Haně Kotasové za seznámení s chodem laboratoře a asistenci při řešení mnoha drobných problémů. Rád bych také poděkoval Mgr. Jiřině Procházkové, Ph.D. za pomoc při měření na průtokovém cytometru. Všem kolegům z pracoviště děkuji za vytvoření přátelské atmosféry. V neposlední řadě patří mé díky rodině a přátelům, kteří mě podporovali v průběhu celého studia.

4 Obsah Abstract... 6 Abstrakt ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Signalizace gp Cytokiny rodiny IL Receptory signální dráhy gp Funkční struktura receptoru gp Složky signální dráhy gp130 a přenos signálu JAK STAT SHP-2/ERK SHP-2/PI3K/Akt Regulátory gp130 signalizace Supresory cytokinové signalizace (Suppressor of cytokine signalling, SOCS) Proteiny inhibující aktivovaný STAT (Protein inhibitor of activated STAT, PIAS) Tyrosinové fosfatázy Phosphatase and tensin homolog (PTEN) Kmenové buňky Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cells, ES buňky) Embryonální karcinomové buňky (Embryonic carcinoma cells, EC buňky) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cells, EG buňky) Somatické kmenové buňky (Somatic stem cells, SS buňky) Gp130 signalizace v kmenových buňkách Embryonální diapauza Hypoxie a redoxní stav buňky Mitochondriální dýchací řetězec NADPH oxidáza Faktory indukované hypoxií (Hypoxia inducible factor, HIF) ROS a signální dráhy Antioxidační mechanismy... 29

5 Vybrané látky modifikující redoxní rovnováhu v buňkách (redoxní modulátory) Apocynin (APO) Diphenyleneiodonium (DPI) N-aceteyl cystein (NAC) CÍLE PRÁCE MATERIÁL A METODY Buňky a jejich kultivace Média a doplňkové složky Vybrané látky ovlivňující redoxní rovnováhu v buňce (redoxní modulátory) Inhibitory signálních drah Určení fenotypu/morfologie buněk Příprava vzorků pro stanovení koncentrace proteinů a Western blot Stanovení koncentrace proteinů Denaturační polyakrylamidová elektroforéza (SDS-PAGE) a Westren blot Charakterizace distribuce fází buněčného cyklu metodou průtokové cytometrie Přechodná transfekce buněk a detekce chemiluminiscence VÝSLEDKY Vliv redoxních modulátorů na fenotyp mes buněk Vliv různých koncentrací redoxních modulátorů na růst mes buněk Vliv redoxních modulátorů na růst mes buněk v průběhu 72 hodin Vliv redoxních modulátorů na distribuci buněčného cyklu mes buněk Vliv redoxních modulátorů na luminiscenci přechodně transfekovaných mes buněk Vliv redoxních modulátorů na luminiscenci S4 a S12 buněk Účinky inhibitorů signálních drah a redoxních modulátorů na fosforylaci proteinů signální dráhy gp130 u mes buněk Vliv redoxních modulátorů na fosforylaci proteinů po indukci LIF nebo FCS u mes buněk Vliv redoxních modulátorů na fosforylaci STAT3 a expresi Oct3/4 a Nanog u mes buněk DISKUZE ZÁVĚR Seznam použitých zkratek Seznam literatury... 69

6 Abstract The gp130 system is a set of ligands and receptors that elicits multiple biological responses by the formation of oligomeric signalling complexes that contain one or more copies of a common transmembrane transducing receptor gp130. Gp130 signalling is implicated in a large nubmer of diseases including neoplastic disorders and is also crucial for maintaining undifferentiated state of stem cells. During embryonic development or by occupying specialized microenvironment called niche, stem cells are exposed to lower O 2 concentrations. Hypoxia increases reactive oxygen species (ROS) generation. ROS have been considered important intracellular signaling molecules, which may act as mediators or second messengers. They also affect intracelullar redox balance (the ratio between oxidizing and reducing species within the cell) that plays significant role in the regulation of celullar processes. The aim of this diploma thesis was to investigate overall impact of induced intracellular redox imbalance on gp130 signalling with emphasis on the stem cell regulation. We used mouse embryonic stem cells and mouse embryonic carcinoma cells as the model. To modify their intracelullar redox balance we used apocynin (NADPH oxidase inhibitor and possible ROS scavenger), diphenyleneiodonium (flavoprotein inhibitor) and N-acetylcysteine (ROS scavenger, glutathione precursor). Treated cells were analysed using numerous methods including Western blot, flow cytometry, luciferase reporter assay and protein assay. Redox imbalance resulted in decreased rate of proliferation, different cell cycle distribution and altered fosforylation and activation of gp130 signalling pathways. Therefore we speculate, that gp130 system is redox-sensitive. 6

7 Abstrakt Gp130 je ústřední součástí transmembránového receptorového komplexu, který je využíván řadou cytokinů, jejichž pleiotropní účinky významně ovlivňují fyziologii celého organismu. Signalizace gp130 je také zahrnuta v mnoha patologických stavech včetně nádorových onemocnění. Klíčovou roli hraje v udržování nediferencovaného stavu kmenových buněk. Ty jsou v průběhu embryogeneze nebo okupováním specifických mikroprostředí označovaných jako niche vystaveny sníženému množství O 2. Hypoxie přispívá ke zvýšené tvorbě reaktivních metabolitů kyslíku. Ty jsou považovány za významné signální molekuly. Podílejí se na intracelulární redukčně oxidační (redoxní) rovnováze. Ta je dána množstvím a aktivitou redukčních a oxidačních látek v buňce a představuje významný faktor ovlivňující buněčné pochody. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, jakým způsobem se narušení intracelulární redoxní rovnováhy odráží na signalizaci gp130, s důrazem na regulaci specifických vlastností kmenových buněk. Jako model byly zvoleny myší embryonální kmenové buňky a jim podobné embryonální karcinomové buňky. K narušení redoxní rovnováhy byl použit apocynin (inhibitor NADPH oxidázy a možný vychytávací antioxidant), difenyleneiodonium (flavoproteinový inhibitor) a N-acetyl cystein (vychytávací antioxidant, prekurzor glutathionu). K vyhodnocení vlivu těchto látek na buňky bylo využito mnoho metod. Mezi jinými Western blot, průtoková cytometrie, luciferázový reportérový test a stanovení koncentrace proteinu. Přídavek redoxních činidel měl za následek omezení růstu buněk, změny v rozložení fází buněčného cyklu a významně ovlivněna byla i fosforylace a aktivace komponent signální dráhy gp130. Na základě dosažených výsledků je možné tvrdit, že dráha gp130 je citlivá k narušení intracelulární redoxní rovnováhy. 7

8 1 ÚVOD Komunikace s okolním prostředím je jedním z nezbytných předpokladů ke správné funkci buňky a potažmo i regulace homeostázy celého organismu. Výměna informací pomocí signálních molekul a jejich specifických interakcí s odpovídajícími receptory představuje klíčový mechanismus, který rozhoduje o dalším osudu buňky. Vazba ligandu na receptor spouští signální kaskádu, na jejímž konci se exprimují vybrané geny, dochází ke změnám v metabolismu, enzymatické aktivitě, či v proliferaci, diferenciaci a apoptóze. Škála nitrobuněčných odpovědí je nesmírně rozmanitá, stejně jako množství signálních drah, které buňku ovlivňují. Jednou z nejvýznamnějších je signální dráha, jejíž ústřední komponentou je receptorový glykoprotein 130 (gp130). V závislosti na ligandu, typu buňky, stupni diferenciace a ontogenetickém vývoji, ovlivňuje systém imunitní, krvetvorný, kardiovaskulární, opěrný, pohlavní, nervový a endokrinní. Signální dráha gp30 je nepostradatelná především v průběhu časné embryogeneze a je intenzivně zkoumána u embryonálních kmenových buněk. Tyto in vitro kultivované buňky jsou odvozené z vnitřní buněčné masy preimplantační blastocysty a mají schopnost diferencovat v jakýkoli jiný typ buněk (jsou tzv. pluripotentní). To z nich činí slibné kandidáty pro boj s celou řadou chorob a poúrazových stavů, stejně jako výborný model pro studium embryogeneze a karcinogeneze. Kyslík představuje životně důležitý prvek pro všechny organismy. Jeho extracelulární hladina se podílí na regulaci oxidačně redukčních (redoxních) podmínek uvnitř buňky a významně ovlivňuje všechny její funkce. Zvláště citlivé na jeho působení jsou kmenové a progenitorové buňky, které se in vivo nacházejí v hypoxických podmínkách. Hypoxie přispívá ke zvýšené hladině reaktivních metabolitů kyslíku. Ty v současné době nejsou považovány za pouhý toxický produkt metabolismu, ale je jim přisuzována důležitá úloha v buněčné signalizaci. Cílem této práce je zjistit jakým způsobem reaguje signální dráha gp130 na změny redoxních podmínek. Jako model byly zvoleny myší embryonální kmenové buněk a jim blízké embryonální karcinomové buňky, které byly ovlivněny látkami narušujícími přirozenou redukčně oxidační rovnováhu. Důraz bude kladen především na změny v proliferaci a diferenciaci. 8

9 2 TEORETICKÁ ČÁST 2. 1 Signalizace gp130 Zformování specifického proteinového komplexu ligand-receptor je jedním z hlavních biologických mechanismů přenosu signálu a regulace buněčných pochodů. Funkci ligandu, signální molekuly umožňující mezibuněčnou komunikaci, často zastávají cytokiny. Jsou definovány jako skupina malých rozpustných proteinů a glykoproteinů, které regulují růst, diferenciaci a funkce somatických buněk. Gp130 je základní součástí proteinového komplexu tvořícího receptor, který je využíván cytokiny z rodiny interleukinu 6 (IL-6, cytokiny gp130) Cytokiny rodiny IL-6 Cytokiny IL-6 sdílejí strukturu skládající se ze 4 alfa-helixů označovaných A, B, C a D spojených třemi polypeptidickými smyčkami (obrázek 1). Patří do podkategorie cytokinů s dlouhými řetězci (Bravo & Heath, 2000). Jejich účinky jsou pleiotropní a do určité míry se jednotlivé cytokiny z této rodiny mohou zastupovat (působí redundantně). V současné době jsou známi tito zástupci: interleukin 6 (IL-6), interleukin 11 (IL-11), leukemii inhibující faktor (leukemia inhibitory factor, LIF), onkostatin M (oncostatin M, OSM), kardiotrofin-1 (cardiotrophin-1, CT-1), kardiotrofinu podobný cytokin (cardiotrophin-like cytokine, CLC), ciliární neurotrofický faktor (ciliary neurotrophic factor, CNTF) a neuropoietin (NP) (Heinrich et al., 2003) Kromě toho je signální dráha gp130 pravděpodobně využívána i cytokiny, které formálně patří do jiných rodin, například interleukinem 27 (Pflanz et al., 2004) a virovým interleukinem 6, který je produkován Kaposiho sarkomem (Chow et al., 2002). Obrázek 1: Struktura cytokinů z rodiny IL-6 (upraveno dle Heinrich et al., 2003). 9

10 Receptory signální dráhy gp130 Gp130 je součástí receptorového komplexu. Ten je tvořen dalšími specifickými receptory, které je možné rozdělit do dvou skupin. Do první skupiny tzv. transmembránových β receptorů patří kromě vlastního gp130 i receptor pro LIF (LIF-R) a OSM (OSM-R). Tyto receptory se kromě specifické vazby s ligandem přímo účastní i transdukce signálu (Mosley et al., 1996). Druhou skupinu tvoří tzv. nízkoafinitní α receptory, které se účastní pouze vazby ligandu, ale na vlastní intracelulární přenos signálu nemají vliv. Jedná se o receptor pro IL-6 (IL-6R), IL-11 (IL-11R) a CNTF (CNTF-R). Podobnou podjednotku patrně obsahuje i receptor pro CT-1, její výskyt však ještě nebyl zcela potvrzen. Receptorový komplex vzniká homodimerizací molekul gp130 nebo tvorbou hetorodimeru gp130/lif-r případně gp130/osm-r. Homodimer molekul gp130 využívají k signalizaci cytokiny IL-6 a IL-11, které zároveň vyžadují přítomnost svého specifického nízkoafinitního receptoru (IL-6R, IL- 11R). Komplex gp130/gp130 + IL-6R (potažmo IL-11R) tvoří vysokoafinitní receptor, který po kontaktu s ligandy dále zprostředkovává přenos signálu. Heterodimer LIF-R/gp130 využívají LIF, CT-1, CNTF, CLC a OSM (Heinrich et al., 2003). OSM může využívat i vlastní receptorovou podjednotku a signál přenášet přes heterodimer OSM-R/gp130 (Mosley et al., 1996). Možné kombinace vazeb receptorových podjednotek s ligandy jsou znázorněny na obrázku 2. Kromě membránově vázaných receptorů se vyskytují i jejich volné (solubilní) formy, které regulují působení cytokinů. Vznikají částečnou proteolýzou membránových receptorů (tzv. shedding ) nebo alternativním sestřihem mrna. S výjimkou solubilního receptoru pro IL-6 a CNTF působí především antagonisticky (Rose John & Heinrich, 1994). Obrázek 2: Cytokiny rodiny IL-6 a jejich receptory (upraveno dle Heinrich et al., 2003). 10

11 Funkční struktura receptoru gp130 Gp130 se na základě strukturní a sekvenční homologie extracelulárních částí řadí mezi cytokinové receptory 1. třídy. Extracelulární doména gp130 se skládá z cytokiny vázající domény (cytokine binding module, CBM), imunoglobulinu-podobné domény (Imunoglobuline-like domain, IgD) a řady domén podobných fibronektinu III (fibronectin type III-like domain, FB-III). CBM je tvořena dvěma jednotkami FB-III a obsahuje typickou sekvenci tryptofan-serin-x tryptofan-serin (WSXWS, WS motif) na C konci a konzervativní uspořádání čtyř cysteinových zbytků na N konci (obrázek 3). Transmembránová doména nejen ukotvuje receptor, ale aktivně se podílí na přenosu signálu (Kim & Baumann, 1997). Intracelulární doména obsahuje Box 1 a Box 2 motiv, vyskytující se v blízkosti membrány, který je asociován s tyrosin kinázami Janusovy rodiny (Janus kinase, JAK). Intracelulární doména dále obsahuje 6 tyrosinových zbytků (u myši 7). 4 z nich formují YXXQ motiv, kde je tyrosin (Y) po fosforlylaci JAK zodpovědný za aktivaci proteinu přenašeče a aktivátoru transkripce (Signal transducer and activator of transcription, STAT) (Stahl et al., 1995; Kamimura et al., 2003). Fosforylace dalšího konzervativního motivu YXXV na tyorsinu Y759 (Y757 u myši), spouští signální kaskádu tyrosinové fosfatázy obsahující homologní doménu 2 proteinu src (Src homology domain-containing 2 tyrosine phosphatase 2, SHP-2). SHP-2 dále aktivuje kinázu regulovanou extracelulárními signály (Extracellular signalregulated kinase, ERK) z rodiny serin/threoninových protein kináz aktivovaných mitogenem (mitogen activated protein kinase, MAPK) (Stahl et al., 1995) a fosfatidil inositol 3 kinázu (Phosphatidylinositol- 3-kinase, PI3K) (Ernst & Jenkins, 2004). Na motiv YXXV se také váže negativně působící zpětnovazebný regulátor potlačující signalizaci cytokinů (Suppressor of cytokine signallig, SOCS) (Starr et al., 1997). Schematické znázornění signální dráhy gp130 je znázorněno na obrázku 4. Obrázek 3: Struktura receptoru gp130 (upraveno dle Kamimura et al., 2003). 11

12 Obrázek 4: Signální dráha gp130 (upraveno dle Ernst & Jenkins, 2004) Složky signální dráhy gp130 a přenos signálu Na povrchu cytokinů IL-6 rodiny se nacházejí konzervovaná místa ( sites ) s označením I, II a III, které specificky reagují s receptory. Studie provedené na IL-6 naznačují možný model oligomerizace (obrázek 5). IL-6 se přes site I nejdřív naváže na nízkoafinitní IL-6R. Vzniklý heterodimer se připojí IL-6 na CBM gp130 prostřednictvím site II. Dojde i k propojení gp130 a C konce IL-6R. Tento třímolekulový komplex však stále ještě není schopen spustit signální kaskádu (Chow et al., 2002). Dva takovéto komplexy (IL-6/IL- 6R/gp130) spojené přes site III IL-6 a IgD gp130 v jeden hexamerický receptor, tvoří jednotku schopnou generovat a přenášet intracelulární signál. Ta může být stabilizována vzájemnou interakcí IL-6 v místě, které bývá označováno i jako site IV (Somers et al., 1997). Pravděpodobně tedy platí, že site I slouží k navázání ligandu na nízkoafinitní receptor (pokud je to nezbytné), site II připojuje vzniklý heterodimer k gp130 a site III spojuje 2 takovéto komplexy ve funkční celek. Stejně tomu tak je i v případě přenoau signálu přes LIF-R a OSM-R, které vykazují strukturní podobnost s gp130 (Bravo & Heath, 2000). V nedávné 12

13 době provedené studie poukazují i na jiný model, kde jsou oligomery receptorového komplexu zformovány ještě před připojením ligandu. I zde je však klíčovým krokem vlastní interakce receptoru a ligandu, která předem vzniklý komplex stabilizuje, aktivuje a spouští signální kaskádu (Tenhumberg et al., 2006). Obrázek 5: Modelové schéma oligomerizace s vyznačenými místy kontaktu IL-6 s receptory (upraveno dle Heinrich et al., 2003) JAK Konformační změny aktivují tyrosinové protein kinázy JAK asociované s intracelulárními doménami receptoru. V současné době jsou u savců známi 4 zástupci tyrosin kináza 2 (Tyrosine kinase 2, TYK2), JAK1, JAK2 a JAK3. Vyskytují se v celém organismu, s výjimkou JAK3, jejíž exprese je omezena na hematopoetické buňky (Musso et al., 1995). Zdá se, že pro interakci s gp130 je nejvýznamnější JAK1, která po vyřazení JAK2 a TYK2 byla schopna dále přenášet signál s nezměněnou intenzitou (Guschin et al., 1995). JAK se skládají ze sedmi homologních domén (JH1-JH7), kde JH1 na C konci představuje doménu kinázovou. JH2 tvoří doménu pseudokinázovou, která nemá katalytickou aktivitu, ale plní hlavní regulační funkci (Chen et al., 2000). Další domény tvoří homologní doménu 2 src (SH-2) s ne zcela objasněnou funkcí a doménu prostřednictví níž se JAK váže na intracelulární část cytokinového receptoru (4.1 protein, ezrin, radixin, moesin FERM), nacházející se na N konci molekuly (obrázek 6) (Yamaoka et al., 2004). Přesný mechanismus jakým dochází k aktivaci JAK není v současné době znám. Předpokládá se ale, že se JAK ukotvená doménou FERM váže na receptorový box 1/2 a konformační změna vzniklá tvorbou heterodimerického komplexu ji přibližuje do těsné blízkosti jiné JAK čímž dochází k jejich auto/trans-fosforylaci. Takto aktivovaná JAK dále fosforyluje tyrosinové zbytky na cytoplazmatické doméně receptoru (Rane & Reddy, 2000; Kamimura et al., 2003). Kromě funkce přenašeče signálu má JAK i vliv na expresi gp130 receptorů na membráně. Zatím byl tento fakt prokázán u OSM-R (Radtke et al., 2002). 13

14 Obrázek 6: Struktura JAK (upraveno dle Heinrich et al., 2003) STAT Proteiny z rodiny STAT patří mezi důležité transkripční faktory účastnící se buněčné signalizace. V současné době je u savců známo 7 členů této rodiny. Jedná se o STAT1, 2, 3, 4, 5a, 5b a 6. První zástupci byli objeveni v souvislosti s výzkumem interferonové signální dráhy (Fu et al., 1990; Darnell et al., 1994) a dnes je známa celá plejáda cytokinů, růstových faktorů a hormonů, které modulují jejich funkce (Kiselleva et al., 2002). Pro přenos signálu zprostředkovaný cytokiny IL-6 je nejpodstatnější funkce STAT3 a v menší míře i STAT1 (Heinrich et al., 1998). STAT se skládá z několika domén. N-koncová doména je zodpovědná za oligomerizaci, tvz. coiled coil doména napomáhá transportu do jádra a interakcím s dalšími proteiny, další doména umožňuje vazbu na DNA, v čemž jí asistuje doména spojovací. Za vazbu na cytosolový receptor odpovídá doména SH-2. Na C konci proteinu se nachází doména transaktivační (obrázek 7) (Lim & Cao, 2006). Aktivovaná JAK fosforyluje cytoplazmatickou část receptorů gp130. Fosforylace YXXQ motivu vytváří vazebné místo pro STAT. Ten se prostřednictvím SH-2 váže na receptor a je fosforylován (STAT3 na Tyr 705, STAT1 na Tyr 701). Fosforylovaný STAT se vyvazuje z receptoru a dimerizuje. Vznikají homodimery STAT3, STAT1 nebo jejich heterodimery. Ty mohou být ještě dodatečně fosforylovány na Ser 727 (Abe et al., 2000). Dimery STAT poté putují cytoplazmou a za spotřeby energie a s pomocí proteinů importinů pronikají do jádra, kde se vážou na DNA a spouští transkripci vybraných genů (Kisseleve et al., 2002). Tento klasický model je v současné době doplňován o poznatky, že se STAT může vyskytovat ve formě oligomeru (jako tzv. statosom ) i bez fosforylace a že je dokonce transkripčně aktivní, i když je zodpovědný za expresi jiných genů. Stále více otázek vyvolává i problematika nitrobuněčného transportu (Sehgal, 2008; Brown & Zeidler, 2008). Obrázek 7: Struktura STAT (upraveno dle Heinrich et al., 2003). 14

15 SHP-2/ERK SHP-2 patří do rodiny protein tyrosin fosfatáz. Na svém N-konci má dvě SH2 domény, které v nefosforylovaném stavu blokují aktivní místa na vlastní fosfatázové doméně (obrázek 8). Fosforylace JAK vede k odhalení vazebného místa (Tyr 759 na gp130, Tyr 974 na LIF-R) a navázání SHP-2, čímž se spouští její fosfatázová aktivita (Hof et al., 1998). Následně JAK fosforyluje SHP-2, která se odděluje od receptoru a váže se na adaptérový protein pro receptory růstových hormonů 2 (growth factor receptor binding protein 2, Grb2). Grb2 je asociován s proteinem Son of Sevenless (SOS) s GTPázovou aktivitou. Tento komplex spouští fosforylační kaskádu po ose Ras-Raf-MAPK/ERK kináza (MEK)-ERK1/2 (Margolis & Skolnik, 1994). Aktivovaná ERK se translokuje do jádra, kde fosforyluje vybrané transkripční faktory, regulující expresi genů. Výše popsaná kaskáda představuje pouze zjednodušený model. Existuje mnoho dalších proteinů, které pomáhají úspěšnému předání signálu tím, že upravují afinitu jednotlivých složek, či pomáhají stabilizovat dočasně vznikající komplexy. Obrázek 8: Struktura ERK (upraveno dle Heinrich et al., 2003) SHP-2/PI3K/Akt SHP-2 se kromě spouštění dráhy ERK podílí i na aktivaci dráhy, jejíž další ústřední komponentou je PI3K. SHP-2 je fosforylována výše popsaným způsobem a váže se na protein asociovaný s Grb (Grb-associated binding protein 1, Gab1). Tento komplex poté přes regulační podjednotku aktivuje PI3K. PI3K napomáhá přenosu signálu po ose Ras-Raf-MEK- ERK (Takahashi-Tezuka et al., 1998) a navíc fosforyluje membránově vázaný fosfatidylinositol-3,4-bisfosfát (PIP2) na fosfatidyl-inositol-3, 4, 5-trifosfát (PIP3). Zvýšená koncentrace této signální molekuly vede ke spuštění kinázy 1 závislé na fosfatydil fosfátu (PDK1), která dále modifikuje minimálně 24 dalších protein kináz z rodiny AGC (campdependent, cgmpdependent, protein kinase C {PKC} (Komander et al., 2004). K nejvýznamnějším patří serinová protein kináza Akt, též známá jako protein kináza B. Mezi její substráty patří řada transkripčních faktorů zahrnutých především v regulaci apoptózy. Většina efektů této signální dráhy má antiapoptický a přežití buňky podporující charakter (Song et al., 2005). 15

16 Regulátory gp130 signalizace Buněčná signalizace je nesmírně složitý proces, který vyžaduje přítomnost mnoha regulátorů, které udržují celý systém v rovnováze. Obzvláště to platí pro cytokiny, které účinkují již v nepatrném množství. V průběhu evoluce se vyvinula celá řada mechanismů, které nadbytečnou stimulaci tlumí a zajišťují adekvátní buněčnou odpověď Supresory cytokinové signalizace (Suppressor of cytokine signalling, SOCS) V současné době je známo 8 členů této rodiny přičemž v odpověď na působení cytokinů rodiny IL-6 jsou zpětnovazebnou smyčkou exprimovány především CIS (cytokine inducible SH2-containing protein) a SOCS1,2 a 3 (Starr et al., 1997). Mechanismus účinku se mezi jednotlivými zástupci liší, obecně však mohou regulovat signalizaci několika způsoby. Přímo se váží na JAK a zabraňují její fosforylaci, kompetitují se STAT o fosforylovaná vazebná místa a napomáhají ubiquitin ligázovým systémem degradaci STAT v proteasomu (Crocker et al., 2008). K jejich optimálnímu působení přispívá i fakt, že jsou exprimovány velice rychle a mají krátký poločas rozpadu Proteiny inhibující aktivovaný STAT (Protein inhibitor of activated STAT, PIAS) Na základě strukturní podobnosti rozlišujeme 5 proteinů spadajících do této rodiny. PIAS1 (inhibující STAT1), PIAS3 (inhibující STAT3), PIASx, a PIASy. PIAS se váží na dimerizované STAT a zabraňují jim v navázání na DNA (Liu et al., 1998). Podobně jako SOCS vykazují PIAS i ubiquitin ligázovou aktivitu, čímž přispívají ke zvýšení degradace STAT v proteasomu (obrázek 9) (Rogers et al., 2003). Přesné mechanismy výše uvedených inhibičních schopností PIAS nejsou v současné době uspokojivě vysvětleny. Oproti SOCS jsou PIAS v buňce exprimovány konstitutivně a působí jako pufr hladiny aktivovaných proteinů STAT (Greenhalg & Hilton, 2001). 16

17 Obrázek 9: Vybrané negativní regulátory signální dráhy gp130 (upraveno dle Ernst & Jenkins, 2004) Tyrosinové fosfatázy Přenos informací v buňce je realizován sledem fosforylací proteinů náležících do signální kaskády. Fosfatázy, které fungují jako antagonisti ke kinázám (tj. zajišťují proces defosforylace), jsou tedy logickým regulátorem buněčné signalizace. V systému gp130 se uplatňuje SHP-2, která však nepůsobí jako typický negativní regulátor. Zdá se, že funguje jako adaptérový protein, který vyvažuje odpověď JAK/STAT dráhy, kterou tlumí a dráhy ERK, jejíž odpověď posiluje (Lehmann et al., 2003) Phosphatase and tensin homolog (PTEN) Doposud zmíněné regulátory ovlivňovaly především signální kaskádu zprostředkovanou JAK/STAT. Nejvýznamnějším antagonistou dráhy PI3K je PTEN, který zajišťuje defosforylaci molekuly PIP3 na její signálně neaktivní prekurzor PIP2 (Li et al., 1997). Nezávisle na své fosfatázové aktivitě ovlivňuje PTEN i buněčnou migraci 17

18 (Raftopoulou et al., 2004) a hladinu i transrkipční aktivitu dalšího z tumor supresorových proteinů p53 (Freeman et al., 2003). Kromě PTEN vyskytujícího se v cytoplazmě existuje i jeho jaderná forma, která přispívá k regulaci buněčného cyklu snížením hladiny cyklinu D1 (Chung & Eng, 2005). Deregulace PTEN vede ke zvýšené proliferaci, růstu a migraci buněk, a patří mezi klasické a univerzální znaky kancerogeneze a mnoha dalších chorob (Tamguney & Stokoe, 2007) Kmenové buňky Pro své unikátní vlastnosti stojí kmenové buňky v popředí zájmu mnoha vědeckých skupin. Představují potenciální prostředek k léčbě mnoha onemocnění, který ale není možné plně využít, dokud nebudou plně pochopeny mechanismy, které osud těchto buněk řídí. Podle jejich původu můžeme rozlišovat buňky na embryonální a somatické (dospělé) Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cells, ES buňky) ES buňky jsou odvozeny z vnitřní buněčné masy (Inner cell mass, ICM) preimplantační blastocysty. V závislosti na druhu dochází k zformování blastocysty několik dnů po oplození. Skládá se z dvou funkčních typů buněk trofoblastu později vytvářejícímu placentu a buněk ICM, které zformují vlastní organismus. Buňky ICM jsou pluripotentní, jsou schopny diferencovat ve všechny zárodečné listy ektoderm, mesoderm a entoderm a dávají tak vzniknout jakémukoli buněčnému typu (s výjimkou vnějších obalů, u myši). Po jejich přenesení do in vitro kultury (již jako ES buňky) je jejich další charakteristikou teoreticky neomezené sebeobnovování (tzv. self-renewal ) v nediferencované formě beze změny fenotypu. Buňky ICM si oproti tomu uchovávají tuto schopnost jen velice omezenou dobu, a poté dále diferencují. Nelze je tedy chápat jako ekvivalent ES buněk. Po injikaci do blastocysty jsou ES buňky schopny vytvářet kompletně chimérický organismus (Bradley et al., 1984) a jejich vnesení do imunodeficientního jedince vede k vytvoření teratomu (nádor skládající se ze všech zárodečných listů, včetně nediferencovaných buněk, obvykle se vyskytující v ovariích nebo varlatech). In vitro je lze 18

19 kultivovat ve formě tzv. embryonálních tělísek, trojrozměrných struktur obsahujících buňky všech zárodečných listů. Tyto metody jsou používány pro důkaz pluripotence. Poprvé byly ES izolovány u myši (mouse ES, mes) v roce 1981 dvěma na sobě nezávislými vědeckými skupinami. (Martin, 1981; Evans & Kaufman 1981). ES buňky z blastocysty lidské (human ES, hes) byly izolovány o 17 let později (Thomson et al., 1998). Pro ES buňky je typická vysoká hladina enzymů alkalické fosfatázy a aktivita telomerázy. Dalšími charakteristickými znaky je výskyt několika jaderných transkripčních faktorů a typických povrchových antigenů. Mezi nejvýznamnější patří Octamer-binding protein 3/4 (Oct3/4), Nanog, Sex determining region Y-box 2 (SOX2) a Stage specific embryonic antigen (SSEA) (Boiani & Scholer, 2005). ES jsou většinou kultivovány na podpůrné vrstvě mitoticky inaktivovaných myších fibroblastů (tzv. feeder ), který jim dodává potřebné růstové faktory, cytokiny a řadu dalších dosud nespecifikovaných látek. Jejich přísun je zajištěn i přídavkem séra (nejčastěji fetálního bovinního) nebo jeho náhražek. Ty bývají přesněji definovány, neposkytují ale kultuře celou šíři potřebných faktorů, které je nutné dále dodávat, proto je práce s nimi obtížnější. Všechny tyto látky přispívají k optimálnímu dlouhodobému udržení ES v nediferencovaném stavu beze ztráty pluripotence. U mes byl jako klíčový faktor, který zabraňuje spontánní diferenciaci a zodpovídá za sebeobnovování, identifikován LIF (Smith et al., 1988) Embryonální karcinomové buňky (Embryonic carcinoma cells, EC buňky) Základ ke studiu pluripotentních kmenových buněk byl položen již v 50. letech 20. století pokusy s buňkami formujícími teratom. U myši není jejich spontánní výskyt příliš častý, s výjimkou inbredního kmene 129, který umožnil získat první ucelené poznatky o tomto fenoménu (Stevens & Little, 1954). Následně bylo prokázáno, že i jediná buňka z disociovaného teratomu dává in vivo vzniknout teratomu novému (Kleinsmith & Pierce, 1964). Úspěšné izolace EC buněk z teratomu a jejich udržení v in vitro kultuře bylo dosaženo na konci 60. let (Finch & Ephrussi, 1967), v následujících letech byla technika zdokonalena a došlo k vytvoření několika myších mec linií (Kahan & Ephrussi, 1970; Martin & Evans, 1975) i EC linií lidských (Hogan et al., 1977). mec buňky sdílejí s mes některé charakteristické znaky jako je exprese Oct3/4, či SSEA1. Oproti ES však mají snížený diferenciační potenciál, u některých linií dokonce nulový (Andrews et al., 2005). Po injikaci 19

20 do blastocysty jsou EC buňky schopny vytvářet chimérický organismus, ale s menší úspěšností i životností, ve srovnání s ES. Typická je pro ně kumulace mutací vedoucí často k aneuploidii. Nestabilita genetické informace jim mnohdy poskytuje selektivní výhodu a přispívá k jejich snadnější kultivaci, zároveň ale snižuje hodnotu výsledků z experimentů na nich prováděných. Jsou však vhodným modelem pro studium genetické nestability a vzniku teratomů. Některé dlouho kultivované ES linie vykazují karyotypové abnormality na stejných chromosomech jako buňky EC (Andrews et al., 2005) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cells, EG buňky) Primordiální zárodečné buňky (Primordial germ cells, PG buňky), představují prekurzor, ze kterého později vznikají samčí a samičí pohlavní buňky. Jejich schopnost přenést genetickou informaci a vytvořit nového jedince z nich činí předmět intenzivního zájmu nejen vývojových biologů. PG buňky jsou u myši detekovatelné v průběhu gastrulace (7 den po oplození, day post coitum, dpc), kdy se objevují v extraembryonálním mesodermu, odkud dále migrují do mesodermu primitivního proužku a endodermu žloutkového váčku a zadního střeva. Odtud se dále přesouvají do zárodečné rýhy, kde kolem 12,5 dpc agregují a začíná jejich diferenciace (De Felici, 2000). Izolace PG buněk a jejich in vitro kultivace (EG buňky) se zdařila již počátkem 80. let (Da Felici & McLaren, 1982; 1983), ale jejich dlouhodobé udržení nebylo možné až do přesného definování faktorů, které je potřeba do kultur dodávat (LIF, základní fibroblastový růstový faktor {basic fibroblast growth factor, bfgf}, Steel factor) (Resnick et al., 1992). Lidské EG byly úspěšně izolovány v roce 1998 (Shamblott et al., 1998). EG jsou vzhledem, velikostí, mírou proliferace a některými antigenními markery podobné buňkám, ze kterých jsou odvozeny (PG), ale na rozdíl od nich jsou pluripotentní. In vitro jsou schopny utvořit embryonální tělíska, po injikaci do blastocysty dávají vzniknout chiméře a jejich vnesením do imunodeficientní myši dochází k tvorbě teratomu. EG mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy a dále exprimují transkripční faktory a povrchové antigeny typické pro mes. Jedná se především o Oct3/4 a SSEA1. Oproti ES, ale EG vykazují znaky odvozené od PG buněk mají výrazně demethylovaný genom, bez imprintovaných genů a s reaktivovaným chromosomem X (Laborsky et al. 1994). 20

21 Somatické kmenové buňky (Somatic stem cells, SS buňky) V průběhu života jedince dochází k opotřebování buněk, tkání a orgánů. O jejich regeneraci se starají SS buňky, někdy též nazývané dospělé (adult) kmenové buňky. Jedná se o tkáňově specifické nediferencované buňky, které mohou dát vzniknout dalším buněčným liniím. Ve srovnání s embryonálními buňkami je ale jejich diferenciační potenciál omezený, jsou maximálně multipotentní. SS buňky se pravděpodobně vyskytují ve všech tkáních, kde přispívají k obnovování vyčerpaných buněk. Jejich aktivita může být také spuštěna poškozením dané tkáně a to i v orgánech, u kterých je regenerační schopnost tradičně vnímána jako značně omezená (srdce, mozek). Hlavní roli hrají především v náhradě krátkodobě žijících buněk krve, kůže, střevní výstelky a podobně, kde je jejich deregulace často spojena se vznikem a rozvojem nádorového onemocnění. Jejich množství je tedy logicky omezeno a obvykle představují pouze zlomek z celkového množství buněk dané tkáně. SS buňky se vyskytují ve speciálním mikroprostředí zvaném niche. Ta je definována jako suma všech buněčných a molekulárních faktorů, které buňku ovlivňují. Jedná se především o přímý buněčný kontakt (význam adhezních molekul), interakce s extracelulární matrix, cytokiny, růstové faktory, ph, dostupnost O 2 a další (Dellatore et al., 2008). Všechny tyto faktory rozhodují o dalším osudu SS buňky. Ta se pod vlivem niche nachází v klidové nediferencované formě, s velmi malou mírou proliferace, kterou je však schopna uchovat si po celý život. Preferovaným je asymetrické dělení. V opačném případě by docházelo k nežádoucímu nárůstu SS buněk, nebo naopak k jejich vyčerpání. S přihlédnutím k nejlépe prozkoumanému modelovému organizmu drosophile je asymetrické dělení pravděpodobně zajištěno tím, že dělící se buňka je pomocí adhezních molekul zachycena ve své niche a posun v orientaci mitotického aparátu vede k setrvání jedné dceřiné buňky v dosahu specifických signálů, na rozdíl od druhé která je od niche vzdálena a aktivují se u ní geny předurčující jí k diferenciaci (Yamashita et al., 2003). Takto dochází ke vzniku jedné buňky SS (ta získává chromatidu s původním templátem DNA) a buňky progenitorové (Transiently amplyfiing progenitor, přechodně se dělící progenitor, TA buňka), která obsahuje templát nově utvořený (Conboy et al., 2007). Toto je další z opatření, které zabraňuje hromadění mutací v dlouhožijících SS buňkách. TA buňky mají vysokou proliferační aktivitu, která ale s každým mitotickým rozdělením klesá. Zároveň však roste stupeň jejich diferenciace. Nakonec z nich vzniká dále se nedělící terminálně diferencovaná buňka. Takto je zajištěno, že jediná SS buňka dává vzniknout velkému množství plně funkčních terminálně 21

22 diferencovaných buněk, aniž by byla vystavena opakovanému dělení, které by mohlo ohrozit integritu jejího genomu Gp130 signalizace v kmenových buňkách Regulace buněčných pochodů je složitý a komplexní proces, v jehož poznání zůstává řada nezodpovězených otázek. Obzvláště to platí pro buňky kmenové s unikátními schopnostmi sebeobnovy a zároveň diferenciace do více funkčních typů buněk. Signální dráhy rozhodující o tom, zda li se buňka bude dělit, diferencovat, nebo setrvávat v relativním klidu a bránit se apoptóze, se často doplňují a kříží. Často také jediná signální molekula může spouštět odlišné signální kaskády v závislosti na koncentraci, typu buňky, jejím stáří a mnoha dalších faktorech. Rovnováha mezi sebeobnovováním, diferenciací a mechanismy zabraňujícími apoptóze je u kmenových buněk významnou měrou zprostředkována signální dráhou gp130 a to u ES, EC i EG buněk. Regulace SS buněk zůstává stále do značné míry neobjasněna, ale je pravděpodobné, že významnou roli bude gp130 hrát i u nich. Jeden z nejlépe prozkoumaných modelů fyziologie kmenových buněk představují mes buňky, u kterých byla gp130 signalizace popsána v největší míře. Hlavní roli v jednom z rysů kmenových buněk, sebeobnovování, hraje u mes cytokin LIF identifikovaný ve fibroblastech, na kterých jsou buňky kultivovány a především dráha JAK/STAT, kterou spouští. V systému mes je nejvýznamnějším STAT3, neboť kultura s chybějícím genem pro stat1 (-/- STAT1, možný heterodimerizační partner STAT3) nevykazovala známky zvýšené diferenciace ve srovnání s kulturou intaktní (Durbin et al., 1996). Kultura s pozměněnou intracelulární doménou gp130 neumožňující vazbu STAT3 nebyla schopná sebeobnovování a diferencovala a stejný efekt byl pozorován po transfekci vedoucí k vysoké expresi dominantního negativního mutanta kompetitujícího se STAT3 (Niwa et al., 1998). Fúzní protein skládající se z celého kódujícího regionu STAT3 a ligand vázající domény estrogenního receptoru (STAT3-ER) byl po přídavku 4-hydroxytamoxifenu (4-OHT derivát estrogenu), který vedl k aktivaci fúzního STAT3-ER, schopen udržet nediferencovaný stav u mes i bez přítomnosti LIF (Matsuda et al., 1999). Pravděpodobným konečným efektorem dráhy JAK/STAT3 je protoonkogen c-myc, který patří do rodiny transkripčních faktorů obsahujících bhlh/lz (basic Helix-loop-Helix Leucine zipper) doménu. c-myc je aktivován STAT3, jeho exprese ale klesá během 22

23 diferenciace. Fúzní protein c-myc-er připravený dle výše uvedeného modelu zabraňoval v přítomnosti 4-OHT diferenciaci i bez LIF. Fosforylace threoninu 58 představuje signál, vedoucí k degradaci c-myc. Proteinový konstrukt c-myc-er u kterého byla navíc znemožněna fosforylace threoninu 58, blokoval diferenciaci a podporoval sebeobnovování mes ještě efektivněji. Po injikaci do myší blastocysty dávaly takto kultivované mes buňky vzniknout kompletní životaschopné chiméře (Cartwright et al., 2005). K sebeobnovování a udržení nediferencovaného fenotypu u mes podstatnou měrou přispívá i signální dráha zprostředkovaná PI3K. Přídavek specifického inhibitoru PI3K vede k diferenciaci buněk i za přítomnosti LIF a k poklesu jejich schopnosti sebeobnovování. Posílena naopak byla signální dráha ERK, což naznačuje její význam v buněčné diferenciaci (Paling et al., 2004). PI3K je zahrnuta i v regulaci podpory buněčného přežití, především aktivací kinázy Akt, která zabraňuje apoptóze. Pozitivní efekt má i na proliferaci (Sun et al., 1999). Signální dráha ERK nepodporuje sebeobnovování, jejím hlavním efektem je regulace diferenciace. Použitím specifického inhibitoru MEK byla blokována diferenciace a podpořen růst buněk nediferencovaných. Exprese katalyticky neaktivní SHP-2 také podporuje nediferencovaný fenotyp (Burdon et al., 1999). Aktivita SHP-2 je nezbytná i v in vivo podmínkách. Nefunkční (null) mutant SHP-2 je u myši embryonálně letální, v důsledku selhání gastrulace a poruch vzniku mesodermu (Saxton et al., 1997). Dalším faktorem ovlivňujícím buněčnou signalizaci je SOCS3. Ten je schopen modulovat buněčnou odpověď interakcemi jak s dráhou STAT tak s SHP-2 (Schmitz et al., 2000). Signalizace v mes zprostředkovaná dráhou gp130 se tedy může odehrávat podle následujícího zjednodušeného modelu. Pokud převažují signály vedoucí k aktivaci STAT buňka si uchovává svůj nediferencovaný fenotyp. Ten je navíc podporován PI3K která aktivuje přežití podporující kinázu Akt, která u těchto buněk zabraňuje apoptóze. Jakmile je rovnováha posunuta směrem k signalizaci ERK, buňka se vydává na cestu diferenciace. Signální dráha gp130 nepůsobí v regulaci ES osamoceně, doplňuje se s mnoha dalšími kaskádami. Nejdůležitějšími se zdají být dráhy Wnt, FGF a BMP-4 (Bone morphogenic protein-4) (Boiani & Scholer, 2005). Pro udržení nediferencovaného fenotypu u hes není LIF aktivovaná dráha gp130 dostačující (Thomson et al., 1998). Větší citlivost myších kmenových buněk ke gp130 signalizaci může být vysvětlena jejím podílem na regulaci průběhu embryonální diapauzy. 23

24 Embryonální diapauza Embryonální diapauza (delayed implantation, utajená březost) představuje reprodukční strategii, která umožňuje pozastavení vývoje zárodku v těle samice a tím optimalizaci délky březosti. Nový vrh tak může být přiveden na svět do nejvhodnějších podmínek. U myší se setkáváme s fakultativní embryonální diapauzou. Ta se vyskytuje u druhů, které mají říji a páří se již několik hodin po vrhnutí mláďat. Po zabřeznutí je vývoj zárodku pod vlivem laktace pozastaven. Jakmile dojde k odstavení narozeného potomstva, nebo k jejich úhynu, vývoj zárodku je obnoven. Samice se tedy nemusí znovu pářit a je připravena k vrhnutí dalších mláďat (Mead, 1993). Tímto způsobem se maximalizuje produkce potomstva v nejkratším možném čase. K zastavení vývoje nového jedince dochází ve stádiu blastocysty, která se neimplantuje do děložní sliznice a inhibuje se u ní embryonální vývoj. Dormantní blastocysta setrvává volně v děloze vyživována jejími sekrety. Po obdržení odpovídajícího aktivačního signálu obnovuje blastocysta svůj vývoj, dochází k její implantaci a březost dále pokračuje. Regulace tohoto fenoménu je pravděpodobně závislá na signalizaci gp130. Gp130, LIF-R i LIF je exprimován již na úrovni blastocysty. Místa jejich syntézy jsou ale rozdílná. Zatímco LIF je detekovatelný v buňkách trofoblastu, receptorové podjednotky jsou exprimovány v buňkách ICM. Jejich aktivita je nejvyšší během formování blastocysty a v průběhu časného vývoje, dokud jsou přítomny pluripotentní buňky, rapidně ale klesá počátkem gastrulace (Nichols et al., 1996). Samice myši s null mutací pro LIF, je fertilní, ale embryo se u ní vyvíjí pouze do stádia blastocysty, ale není schopné implantace do stěny děložní sliznice. Pokud je poté blastocysta přenesena do pseudopregnantní wild-type samice, zdárně dokončuje svůj vývoj (Stewart et al., 1992). Uměle podaný LIF může implantaci navodit i u LIF null mutantní samice (Chen et al., 2000). Null mutace gp130 je embryonálně letální především z důvodu poruch srdce a krvetvorby (Yoshida et al., 1996). Pozorován byl i signifikantní úbytek ICM a neschopnost obnovit vývoj po nastolení diapauzy. Bez signalizace gp130 patrně buňky ICM a později epiblastu nebyly schopné uchovat svůj pluripotentní potenciál ani správně diferencovat, což vedlo k apoptóze (Nichols et al., 2001). Tato zjištění spolu s faktem, že nejefektivnějším se jeví získání mes z buněk dormantní blastocysty v diapauze (Brooke & Gardner, 1997) poukazují na důležitost signální dráhy gp130 na udržení klidového stavu pluripotentních buněk v blastocystě in vivo i v mes in vitro. 24

25 2. 3 Hypoxie a redoxní stav buňky Molekulární kyslík (O 2 ) představuje jeden z nejdůležitějších faktorů, které ovlivnily vznik a vývoj života na Zemi. Původně toxický prvek, jehož koncentrace se v atmosféře průběhem let zvyšovala, nutil organismy vyvíjet adaptační mechanismy, které by jim umožnily přežít. Selekčním tlakem vzniklí živočichové s nejefektivnějším detoxifikačním systémem se na dostatku O 2 a aerobním metabolismu stali závislými. V současné éře se hladina atmosférického O 2 pohybuje okolo 21%, v závislosti na nadmořské výšce. Tento stav bývá označován jako normoxie. Z hlediska fyziologie živočichů je toto označení zavádějící, protože hladina O 2 v těle je nižší. Liší se v závislosti na druhu, typu tkáně, stáří atd., ale obecně pro většinu savčích buněk představuje fyziologickou normoxii hladina O 2 blížící se 2 9%. Podmínky, ve kterých je hladina O 2 ještě nižší lze označit za hypoxické. Hypoxie je často spojena s patofyziologickými stavy, jako je tkáňová ischemie, chronický zánět nebo karcinogeneze (Simon & Keith, 2008). Pro kmenové buňky je hypoxické prostředí přirozené. Ať už v průběhu embryogeneze, nebo okupováním specifických niche v dospělosti, kmenové buňky jsou in vivo vystaveny hypoxii, která pravděpodobně přispívá k jejich charakteristickým vlastnostem a zabraňuje jejich předčasné diferenciaci (Ivanovic, 2009). Tento fenomén byl pozorován i in vitro, kdy kultivace hematopoetických progenitorů probíhala efektivněji za snížení parciálního tlaku O 2 (Ivanovic et al., 2000). Významnou měrou je za hypoxických podmínek modifikována i účinnost a efekt IL-6, přispívající k lepší propagaci progenitorů (Kovacevic-Filipovic et al., 2007). V hypoxických podmínkách dochází uvnitř buňky k tvorbě reaktivních metabolitů kyslíku (reactive oxygen species, ROS) (Chandel et al., 2000). ROS je souhrnným názvem pro více látek. Jde o volné radikály vysoce reaktivní molekuly obsahující ve vnější valenční orbitalové vrstvě nespárovaný elektron, ale i o reaktivní látky neradikálové povahy. Jejich nadprodukce vede k oxidativnímu poškození makromolekul a zapříčiňuje či provází řadu patologických stavů. Kontrolovaná produkce ROS je však žádoucí, neboť plní významné signalizační a regulační funkce. Jako druzí poslové zprostředkovávají přenos procesem souhrnně označovaným jako redoxní signalizace. Hlavními endogenními zdroji ROS jsou mitochondriální dýchací řetězec, NADPH (nikotin amid adenin dinukleotid fosfát) oxidázy, xanthin oxidáza, enzymy podílející se na detoxifikaci xenobiotik či endogenních sloučenin (např. cytochromy P450), oxidační pochody probíhající v peroxisomech či ROS vznikající při 25

26 syntéze prostaglandinů a další (Boonstra & Post, 2004). Množství ROS a kapacita antioxidačních mechanismů určuje redoxní prostředí buňky Mitochondriální dýchací řetězec Mitochondriální dýchací řetězec je tvořen čtyřmi enzymovými komplexy s postupně se zvyšujícím redoxním potenciálem, které jsou lokalizovány na vnitřní straně membrány. Jedná se o systém oxidoreduktáz a mobilních přenašečů, které přenášejí elektrony odebrané substrátům na finální akceptor, kterým je v případě aerobních organismů O 2. S přenosem elektronů vnitřní mitochondriální membránou je spřažen transfer protonů přes tuto membránu a vznik elektrochemického potenciálu. Ten je poté využit k tvorbě ATP v procesu oxidativní fosforylace. Za hypoxických podmínek dochází z tohoto systému k zvýšenému úniku ROS. Na vině je pravděpodobně komplex III (ubiquinol-cytochrom c reduktáza), ze kterého za přispění reaktivního meziproduktu ubisemiquinonu, uniká do mezimebránového prostoru volný radikál superoxid (Chandel et al., 2000). Ten slouží jako prekurzor dalších ROS, které mohou dál pronikat do cytoplazmatického prostoru, kde mohou fungovat jako signální molekuly ovlivňující širokou škálu buněčných funkcí. Mechanismus, kterým se tak děje není v současné době zcela vysvětlen, stejně jako role kterou hraje hypoxie (obrázek 10) (Klimova & Chandel, 2008) Obrázek 10: Mitochondriální dýchací řetězec za hypoxických podmínek (upraveno dle Klimova & Chandel, 2008). 26

27 NADPH oxidáza NADPH oxidáza je membránově vázaný komplex enzymu, jehož funkce byla poprvé popsána v souvislosti s oxidativním vzplanutím profesionálních fagocytů. Postupným přenosem elektronu z NADPH přes systém přenašečů až na molekulární kyslík je generován superoxid, který přímo participuje na zneškodňování pohlcených mikroorganismů, nebo vyvolává změny v polarizaci fagosomální membrány doprovázené influxem dalších proteolytických enzymů. H 2 O 2 vzniklý dismutací superoxidu je využíván dalším baktericidním enzymem - myeloperoxidázou. Ta produkuje vysoce reaktivní kyselinu chlornou (Cross & Segal, 2004). NADPH oxidáza byla na základě homologie katalytických podjednotek objevena i mimo buňky profesionálních fagocytů. Předpokládá se, že kromě funkce obranné hraje významnou roli v transdukci signálu spojených s proliferací, diferenciací a apoptózou, metabolismem tyroidních hormonů a regulací vazokonstrikce (Geiszt & Leto, 2004) Faktory indukované hypoxií (Hypoxia inducible factor, HIF) HIF patří do rodiny transkripčních faktorů bhlh/pas (Per-Arnt-Sim), která v současné době čítá 3 členy, HIF-1, 2 a 3. HIF je tvořen heterodimerem skládajícím se ze dvou podjednotek. Jednou z nich je stabilní HIFβ (též označovaná jako aryl hydrocarbon translocator, ARNT) a druhou HIFα jejíž stabilita je ovlivněna dostatkem O 2. Obě podjednotky sdílejí podobnou strukturu skládající se z bhlh/pas a transaktivační domény (TAD). HIFα navíc obsahuje doménu ODD (Oxygen dependent degradation domain), která je z hlediska funkce tohoto proteinu klíčová (Huang et al., 1998). Obě podjednotky jsou exprimovány konstitutivně. Za normoxických podmínek ale dochází u HIFα k hydroxylaci dvou konzervativních prolinových zbytků uvnitř ODD domény rodinou HIF specifických prolyl hydroxyláz (PHD1, 2, 3) (Bruick & McKnight, 2001). Hydroxylovaný HIFα je rozeznáván Von Hippel-Lindau tumor supresorovým proteinem (pvhl) s ubiquitin ligázovou aktivitou. Ubiquitinovaný HIFα je následně degradován v proteasomu (Maxwell et al., 1999). Dalším regulátorem HIFα je hydroxylázový enzym faktor inhibující HIF (Factor inhibiting HIF, FIH), který hydroxyluje asparaginové zbytky v TAD, čímž se snižuje jeho transaktivační schopnosti (Lando et al., 2002). V normoxických podmínkách má tedy HIFα velice krátký 27

28 poločas rozpadu (Huang et al., 1998). V hypoxických podmínkách je hydroxylázová aktivita enzymů PHD a FIH inhibována, HIFα tudíž není rozpoznáván pvhl a degradován. Tím dochází k jeho hromadění v buňce. Poté se translokuje do jádra, kde přes PAS domény dimerizuje s podjednotkou HIFβ. Dimer HIFα/β nasedá na promotor obsahující HIF responsivní elementy (HRE) čímž dochází ke spuštění transkripce vybraných genů zprostředkovávajících změny v metabolismu, angiogenezi, hladině růstových faktorů, proliferaci, diferenciaci a apoptóze. Deregulace komponent systému HIF často provází nádorová onemocnění a hraje důležitou roli především při vzniku metastáz (Rankin & Giaccia, 2008). Role HIF v regulaci proliferace a diferenciace u kmenových či progenitorových buněk je v současné době intenzivně studována. Zvýšená hladina ROS mitochondriálního původu přispívá ke stabilizaci HIFα. Možným mechanismem je oxidace kofaktorů PHD a FIH a snížení jejich aktivity (obrázek 11) (Pan et al., 2007). Recentní studie poukazují na další možné látky a signální dráhy (včetně dráhy MAPK, PI3K a dalších) zahrnuté v regulaci HIF (Yee Koh et al., 2008). Obrázek 11: Vliv ROS na aktivaci HIF (upraveno dle Klimova & Chandel, 2008). 28

29 ROS a signální dráhy Reakce na zvýšenou hladinu ROS, tedy posun v redoxním stavu buňky směrem k oxidativnímu stresu, vede ke změnám v signalizačních kaskádách a k transkripci genů (nebo aktivuje transkripci přímo), jejichž konečný efekt má vést k opětovnému nastolení redoxní rovnováhy. Typicky se jedná o změny v signálních drahách JNK (Jun kináza), p38 a ERK (z rodiny MAPK), které jsou obecně aktivovány v odpovědi na stres, PKC, PI3/Akt a mnoho dalších (Martindale & Holbrook, 2002). Oxidace cysteinového motivu, který je typický pro všechny tyrosinové fosfatázy (včetně SHP-2) a nezbytný k jejich katalytické funkci, může vést k jejich inaktivaci (Meng et al., 2002; Tabet et al., 2008). Inertní vůči působení ROS není ani JAK/STAT dráha. Působení oxidačního činidla vedlo k její aktivaci, kterou bylo možné inhibovat přídavkem antioxidantů (Simon et al., 1998) Antioxidační mechanismy Antioxidanty jsou definovány jako látky, které zabraňující oxidativnímu poškození molekul snížením pravděpodobnosti vzniku ROS nebo jejich převedením do méně reaktivních forem. V průběhu evoluce se u živočichů vyvinula řada antioxidačních mechanismů, které se vzájemně doplňují a dohromady tvoří funkční systém. Ten antagonizuje působení ROS a nastoluje v buňce, potažmo celém organismu, redoxní rovnováhu. Podle způsobu jejich účinku můžeme antioxidanty dělit do několika kategorií. Jedná se o antioxidanty s preventivní funkcí, které zabraňují vzniku ROS. Do této kategorie lze zahrnout především proteiny vázající redoxně aktivní ionty přechodných kovů (především železa a mědi) jako je např. albumin, transferin, lactoferrin, ceruloplasmin. Další kategorie je tvořena antioxidačními enzymy, které především v intracelulárním prostředí, katalyzují reakce vedoucí k degradaci ROS či k jejich přeměně na méně reaktivní látky. Mezi nejvýznamnější patří superoxid dismutáza, kataláza, glutathion peroxidáza a glutathion reduktáza. Do další kategorie spadají vychytávací ( scavengerové ) antioxidanty. Ty reagují s ROS za vzniku produktu, který je méně reaktivní než ROS do reakce vstupující. Jedná se o heterogenní skupinu látek obsahující např. vitaminy A, C, E, melatonin, bilirubin, kyselinou močovou, lipoovou a thiolové sloučeniny (obsahující sulfanylovou skupinu SH). Výsadní postavení má mezi vychytávacími antioxidanty glutathion (GSH). Vyskytuje se ve všech buňkách a to ve vysoké koncentraci. Zabraňuje oxidaci SH skupin proteinů, která je často klíčová pro jejich 29

30 funkci. Mimo to se podílí na regeneraci vitaminu E a C. Slouží jako substrát pro glutathion peroxidázu, která odstraňuje potenciálně nebezpečný peroxid vodíku. Glutathion reduktázou je poté GSSH redukován do své aktivní (redukované) formy. Poměr jeho redukované (GSH) a oxidované (disulfidické) formy (GSSH) odráží intracelulární redoxní stav (obrázek 12). Svébytnou kategorii v obranné antioxidační linii tvoří látky, které přispívají k reparaci poškozených makromolekul nebo k jejich odstranění v případě nezvratných změn neslučitelných s jejich další funkcí (Valko et al., 2007; Pryor et al., 2006) Vybrané látky modifikující redoxní rovnováhu v buňkách (redoxní modulátory) Apocynin (APO) APO (4-hydroxy-3-methixyacetophenone, acetovanillone) je derivát rostlinného původu, který byl poprvé popsán u Apocynum cannabinum. Extrahován byl i z kořenů Picrorhiza kurroa tradičně používané ve východní medicíně. APO snižuje hladinu ROS pravděpodobně několika odlišnými mechanismy (Stefanska & Pawliczak, 2008). Funguje jako inhibitior NADPH oxidázy, kdy v aktivní dimerické podobě zabraňuje zformování jejich podjednotek do aktivního komplexu produkujícího superoxid (Johnson et al., 2002). Recentní studie poukazují na to, že minimálně v některých buňkách plní funkci jako vychytávací antioxidant nezávisle na inhibici NADPH oxidázy (Heümuller et al., 2008) Diphenyleneiodonium (DPI) DPI je flavoproteinový inhibitor, který je nejčastěji používán k blokaci funkce NADPH oxidázy. Kromě toho také ovlivňuje produkci ROS mitochondriálním komplexem I (Li & Trush, 1998), cytochrom P450 oxidázy, xanthin oxidázy a dalších (Riganti et al., 2004). Mechanismus účinku patrně zahrnuje přechod DPI do radikálového stavu a vytvoření kovalentních aduktů na flavoproteinech (O Donnell et al., 1993). 30

31 N-aceteyl cystein (NAC) NAC je prekurzorem GSH, poskytuje cystein nezbytný pro jeho syntézu. Zamezuje vzniku disulfudických můstků v proteinech, chelatuje ionty přechodných kovů a působí jako vychytávací antioxidant ROS. Vlastnostmi je srovnatelný s cysteinem, oproti němu je ale méně toxický a méně náchylný k oxidaci a dimerizaci. Lepší rozpustnost NAC umožňuje buňce jeho efektivnější využití (Atkuri et al., 2007). NADPH oxidáza DPI APO O 2 O 2 - superoxid dismutáza H 2 O 2 kataláza H 2 O NAC GSH peroxidáza GSH GSSG GSH reduktáza Dýchací řetězec mitochondrií NADP + NADPH Obrázek 12: Schematické znázornění produkce a odstranění ROS (upraveno dle Dröge, 2002). 31

32 3 CÍLE PRÁCE Objasnění mechanismů ovlivňujících proliferaci a diferenciaci buněk a přesné popsání signálních drah, které je zprostředkují, patří mezi klíčové otázky živočišné fyziologie. Cílem této práce je zjistit, jak narušení intracelulární redukčně oxidační rovnováhy vybranými redoxními modulátory ovlivňuje signální dráhu gp130 a potažmo embryonální kmenové buňky. Jako model byly zvoleny mes, jejichž fenotyp je na signální dráze gp130 závislý. Specificky se jedná o tyto cíle: Zjistit, zda mes buňky reagují na narušení intracelulární redoxní rovnováhy. Jak se mění jejich fenotyp a vybrané ES markery. Zjistit, zda narušení intracelulární redoxní rovnováhy ovlivňuje růst mes buněk. Zjistit, zda narušení intracelulární redoxní rovnováhy ovlivňuje buněčný cyklus mes buněk. Zjistit, zda a jak se změny intracelulární redoxní rovnováhy odrážejí na signální dráze gp130. Jakým způsobem jsou ovlivněny dráhy JAK/STAT, ERK a Akt. 32

33 4 MATERIÁL A METODY 4. 1 Buňky a jejich kultivace Experimenty byly prováděny na mes D3 z inbrední linie 129/Sv/+/+, získaných z European collection of cell culture, Wiltshear, UK. K experimentům byly dále využity S4 a S12 buňky. Tyto buněčné linie jsou odvozené od EC buněk P19 a nesou reportérový konstrukt citlivý k aktivovanému STAT3 s luciferázovou koncovkou (Pacherník et al., 2007). Nediferencované D3 mes adaptované na kultivaci bez výživové podkladové vrstvy ( feeder free ) byly kultivovány, na miskách a 12 či 24 jamkových deskách pro tkáňové kultury (TPP), potažených 0,1% roztokem želatiny v přítomnosti Dulbecco s Modified Eagle s média (D-MEM), v termostatu v podmínkách 95% vlhkosti, 37 C a 5% atmosféře CO 2. Pasážování probíhalo každé 2 dny, enzymaticky, při ředění 1:6 (přibližně buněk/cm 2 ). S4 a S12 byly kultivovány za stejných podmínek Média a doplňkové složky D-MEM se zvýšeným obsahem glukózy (4,5 g/l) bez L-Glutaminu, bez pyruvátu sodného, s 3,7 g/l NaHCO 3 (PAN, P ) doplněno o: 1 x neesenciální aminokyseliny (PAN, P ) (pouze pro mes) L-glutamin (2 mm, PAN P ) streptomycin (100 g/ml, Sigma-Aldrich), penicilin (100 U/ml, PAN, P ) β-merkaptoethanol (100 mm, Sigma-Aldrich) 15% fetální bovinní sérum (PAA, A15-105) (10% pro S4 a S12) => kompletní médium pro udržení nediferencovaných buněk přídavek: LIF (5 ng/ml, Chemicon) Bezsérová média: DMEM/F12 1:1 bez L-Glutaminu, s 1,2 g/l NaHCO 3 (PAN, P ) 33

34 Opti-MEM (Reduced serum medium, modification of Eagle s MEM) (Gibco-Invitrogene, 31985) k enzymatickému pasážování byl využit: 0,25% trypsin; 0,02% EDTA v PBS bez Ca + 2 a Mg + 2 (PAN, P ) k oplachu použito: PBS (Phosphate buffered saline, pufrovaný fyziologický roztok, ph 7,4) NaCl KCl KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 * 12 H 2 O destilovaná H 2 O (doplnit do) 8 g 0,2 g 0,2 g 2,31 g 1l 4. 3 Vybrané látky ovlivňující redoxní rovnováhu v buňce (redoxní modulátory) Redoxní rovnováha byla narušena přídavkem činidel ke kultivovaným buňkám. Množství i délka působení činidel byla specifická pro jednotlivé experimenty a detailněji popsána bude u vyhodnocení pokusů. Apocynin (APO; {Sigma-Aldrich} 0,2 M zásobní roztok vzniklý rozpuštěním 0,0332 g apocyninu v 1 ml ethanolu, na požadovanou koncentraci ředěn v PBS) Difenyleneiodonium (DPI; {Sigma-Aldrich}; 5 mm zásobní roztok v PBS) N-aceteyl cystein (NAC; {Sigma-Aldrich}; 0,25 M zásobní roztok v D-MEM bez doplňkových složek) 4. 4 Inhibitory signálních drah UO 126 (UO, Calbiochem) MEK inhibitor (inaktivace ERK1/2, zabránění konformačním aktivačním změnám) LY (LY, Calbiochem) PI3K inhibitor (inaktivace Akt, blokace vazebného místo pro ATP) STAT3 inhibitor V, Stattic (S V, Calbiochem) STAT3 inhibitor (blokace SH2 domény a fosforylace Tyr 705) 34

35 4. 5 Určení fenotypu/morfologie buněk Buňky byly vysety v kompletním médiu s LIF v denzitě ~10 000/cm 2. Po 12 hodinách byly přidány redoxní modulátory. Po 36 hodinách byly pořízeny digitální fotografie s využitím inverzního mikroskopu CKX 41 (Olympus) a digitálního fotoaparátu (Canon) Příprava vzorků pro stanovení koncentrace proteinů a Western blot Pro stanovení posttranslačních modifikací studovaných proteinů (zde fosforylací) bylo postupováno následovně. Před vlastní lyzací byly buňky 2x opláchnuty PBS. Poté k nim bylo přidáno 200 l Laemmliho pufru. Buněčný lyzát převedený do mikrozkumavek byl poté sonikován ultrazvukovou sondou (Brandson) a 5 minut povařen. Takto připravené vzorky lze uchovávat při teplotě -20 C. Rozmrazování probíhá při pokojové teplotě. Pro studování kvantitativních změn v hladinách studovaných proteinů bylo využito lyzace SDS lyzačním pufrem. Koncentrace proteinů byla stanovena níže popsaným způsobem. Stejné koncentrace proteinů (typicky 0,5mg/ml) bylo dosaženo naředěním vzorků s SDS lyzačním pufrem. Ke vzorku byl poté přidán β-merkaptoethanol (1%) a bromfenolová modř (0,01%). Následně byly vzorky sonikovány ultrazvukovou sondou (Brandson) a 5 minut vařeny. Takto připravené vzorky lze uchovávat při teplotě -20 C. Rozmrazování probíhá při pokojové teplotě. 2x Laemmli pufr 0,5 M Tris-HCl (ph 6,8) 2,5 ml glycerol 2 ml 10% dodecyl sulfát sodný (SDS) 4 ml 0,1% bromfenolová modř 0,5 ml 0,01% -merkaptoethanol 0,5 ml destilovaná H 2 O (doplnit do) 10 ml SDS lyzační pufr 1% SDS 0,1% glycerol 100 mm Tris ph 7,4 35

36 4. 7 Stanovení koncentrace proteinů K určení koncentrace proteinů bylo využito činidel ze soupravy Bio-Rad Protein assay. K 5 μl vzorku bylo na mikrotitrační destičce přidáno 25 μl roztoku činidel A a S (v poměru 50:1) a 200 μl činidla B. Po 15 minutách inkubace při pokojové teplotě byla absorbance odečtena při vlnové délce 700 nm na Sunrise ELISA readeru (Tecan). K vyhodnocení byla použita kalibrace standardy hovězího sérového albuminu v koncentraci 0,1 až 2 mg/ml Denaturační polyakrylamidová elektroforéza (SDS-PAGE) a Westren blot Metoda sloužící k detekci proteinů rozdělených v elektrickém poli na základě jejich molekulové hmotnosti s využitím specifických protilátek rozpoznávajících antigenní struktury denaturovaných proteinů. V soupravě od firmy Bio-Rad byly vzorky elektroforeticky rozděleny pomocí SDS- PAGE v 10% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti elektroforetického pufru při napětí 130V. Přenos na polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu (Millipore) se uskutečnil v elektrickém poli (100V/70 min.) v přítomnosti transferového pufru. Po přenosu byla membrána opláchnuta v promývacím pufru. K zamezení nespecifických reakcí byla následovně membrána při pokojové teplotě inkubována 60 minut v 5% roztoku odtučněného sušeného mléka a promývacího pufru. Poté byla membrána přes noc inkubována s primárními protilátkami, při teplotě 4 C. Druhý den byla membrána opláchnuta promývacím pufrem (5x 10 min.) a za pokojové teploty 60 minut inkubována se specifickou sekundární protilátkou, konjugovanou s křenovou peroxidázou. Poté byla membrána opět opláchnuta promývacím pufrem (5x 10 min.). K vizualizaci proteinů byl použit chemiluminiscenční substrát pro křenovou peroxidázu (Millipore) a radiografický film (Agfa). Stejná kvantita proteinu byla ověřena obarvením membrány 0,1% amidovou černí. Separační gel (10 ml, 10%) destilovaná H 2 O 4 ml 30% akrylamid mix (29,2% akrylamid + 0,8% N,N`-methylen-bis-akrylamid) 3,3 ml 1,5 M Tris HCl (ph 8,8) 2,5 ml 10% amonium persulfát (APS) 0,1 ml N,N,N',N -Tetra-methylethylene-diamin (TEMED) 0,004 ml 36

37 Zaostřovací gel (3ml) destilovaná H 2 O 2,1 ml 30% akrylamid mix 0,5 ml 1 M Tris (ph 6,8) 0,38 ml 10% APS 0,03 ml TEMED 0,003 ml Elektroforetický pufr 1x, 1l Tris baze glycin dodecylsulfát sodný (SDS) destilovaná H 2 O (doplnit do) 14,42 g 3,03 g 1 g 1 l Transferový pufr 1x, 1l Tris baze glycin methanol destilovaná H 2 O (doplnit do) 14,42 g 3,03 g 200 ml 1 l Promývací pufr, 2l 2 M Tris HCl (ph 7,4-7,6) 10 ml Tween 20 1 ml NaCl 13 g destilovaná H 2 O (doplnit do) 2 l Protilátky primární protilátka výrobce a číslo zdroj ředění sekundární protilákta výrobce a číslo ředění STAT3 Santa Cruz 8019 M 1:500 anti mouse IgG s HP Sigma-Aldrich A9044 1:2000 P-STAT3 (Tyr 705) Cell Signalling 9131 R 1:500 anti rabbit IgG s HP Sigma-Aldrich A6154 1:4000 Akt Cell Signalling 9272 R 1:1000 anti rabbit IgG s HP Sigma-Aldrich A6154 1:4000 P-Akt (Ser 473) Cell Signalling 193H12 R 1:1000 anti rabbit IgG s HP Sigma-Aldrich A6154 1:4000 Erk1/2 Santa Cruz 93 R 1:1000 anti rabbit IgG s HP Sigma-Aldrich A6154 1:4000 P-Erk1 (Thr 202,Tyr 204) Cell Signalling 9101 R 1:1000 anti rabbit IgG s HP Sigma-Aldrich A6154 1:4000 Oct3/4 Santa Cruz 9081 R 1:1000 anti rabbit IgG s HP Sigma-Aldrich A6154 1:4000 Nanog Abcam R 1:1000 anti rabbit IgG s HP Sigma-Aldrich A6154 1:4000 K ředění protilátek byl použit 5% roztok odtučněného sušeného mléka s promývacím pufrem. S výjimkou protilátek proti Akt, a P-Akt, které byly naředěny s 0,1% bovinním sérovým albuminem. M = mouse, R = rabbit, HP = křenová peroxidáza 37

38 4. 9 Charakterizace distribuce fází buněčného cyklu metodou průtokové cytometrie Této metody bylo využito ke stanovení distribuce jednotlivých fází buněčného cyklu. Principem je obarvení celkové DNA fixovaných buněk. V průběhu buněčného cyklu se množství DNA mění. Buňky v G0/G1 fázi obsahují dané množství DNA, které se replikací během S fáze zdvojnásobuje. Buňky ve fázi G2 tedy obsahují dvojnásobné množství DNA než buňky ve fázi G0/G1. Na základě intenzity fluorescence a následné softwarové analýzy lze tedy určit procento zastoupení buněk v různých fázích cyklu. Charakteristicky má tvar histogramu (obrázek 13) Obrázek 13: Ilustrační histogram výstupu dat z průtokového cytometru. Buňky byly kultivovány v kompletním médiu s přídavkem LIF v 12 jamkové misce v denzitě ~10 000/cm 2 z důvodu zamezení nežádoucího přerůstání. 24 hodin po vysetí byly přidány redoxní modulátory, které byly přítomny v kultuře dalších 24 hodin. Poté byly buňky 2x opláchnuty PBS, trypsinizovány (100 l/jamku) a bylo k nim přidáno 50% FCS v PBS (200 l/jamku). Takto ošetřené buňky byly fixovány 80% nedenaturovaným ethanolem (4ml/jamku) a skladovány při 4 C. Rozsuspendované buňky byly z jamek převedeny do polystyrenových zkumavek a centrifugovány (4 C/300 g/5 min.). Supernatant byl odsán. Následoval oplach PBS a centrifugace (4 C/300 g/5 min.). Tento proces se 2x opakoval. Po finálním odsátí supernatantu bylo ke každému vzorku přidáno 200 l Vindelov roztoku a následovala inkubace při 37 C po dobu 30 minut. Intenzita fluorescence byla stanovena na 38

39 průtokovém cytometru FACSCalibur (Becton Dickinson). Analýza výsledných dat byla provedena s využitím softwaru ModFit 2.0 (Verity Software House). Vindelov roztok 10 mm Tris-HCl, ph 8 RNAáza (0,7 mg/ml, Sigma-Aldrich ) propidium jodid (50 g/ml, Sigma-Aldrich) 0,1 % Triton X mm NaCl Přechodná transfekce buněk a detekce chemiluminiscence Vnesení plasmidu s reportérovým genem kódujícím luciferázu umožňuje detekovat a kvantifikovat genovou expresi. Chemiluminiscenční stanovení intracelulárního ATP poté umožňuje vztáhnout aktivitu reportérového genu na skutečné množství živých buněk. Buňky byly vysety na 12 jamkovou desku v denzitě ~70 000/cm 2 a kultivovány byly v 700 l/jamku kompletního média s přídavkem LIF. Po 24 hodinách byla do kultury přidána transfekční směs. Polyethylen imin (PEI) transfekční směs (1 jamka) Opti-MEM 100 l plasmidová DNA s reportérem 0,5 g PEI 2 l Použité plasmidy pluctks3, STAT3 reportér (Turkson et al., 2001; gift from Richard Jove) 6xOCT-luc, Oct3/4 reportér (Tolkunova et al., 2007; gift from Alexey Tomilin) Před přídavkem byla směs promíchána a 20 minut inkubována při pokojové teplotě. Po 3 hodinách od přídavku směsi, kdy buňky začaly vykazovat apoptické změny, bylo vyměněno médium obsahující transfekční směs za kompletní nové médium. Za dalších 5 hodin byly přidány redoxní modulátory. Po 16 hodinách byly buňky 2x opláchnuty PBS a lyzovány směsí Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega) a Somatic Cell ATP Releasing Reagent (Sigma-Alrdich) v poměru 1:1, 400 l/jamku. Toto uspořádání umožňuje měřit úspěšnost transfekce i viabilitu buněk v každém ze vzorků, což přispívá k větší 39

40 efektivitě práce a poskytuje přesnější výsledky (vlastní modifikace na základě předběžných/přípravných testů). Po promíchání bylo 50 l takto připraveného vzorku pipetováno na mikrotitrační destičku. Aktivita reportérového genu byla stanovena pomocí soupravy Luciferase Assay System (Promega, E1500). Lyofilizovaný Luciferease Assay Substrate byl rozpuštěn v 10 ml Luciferase Assay Bufferu a v 1 ml aliquotech uchováván při -20 C. Po rozmrazení při pokojové teplotě ho bylo k vzorku na mikrotitrační destičce přidáno 50 l. Bez prodlevy byla poté luminiscence detekována na mikrodestičkovém luminometru (Dynex). Ke stanovení množství intracelulárního ATP bylo využito lyofilizovaného ATP reagent Stable Light (Biothema, ) rozpuštěného v 10 ml Diluent C (Biothema, ). 1 ml aliquoty byly uchovávány v -20 C. Po rozmrazení při pokojové teplotě ho bylo k vzorku na mikrotitrační destičce přidáno 50 l. Bez prodlevy byla poté luminiscence detekována na mikrodestičkovém luminometru (Dynex). Stabilně transfekované S4 a S12 buňky byly vysety v denzitě ~10 000/cm 2 na 24 jamkovou desku. Po 24 hodinách kultivace byl do vybraných jamek přidán LIF a 30 minut poté následoval přídavek redoxních modulátorů. Po dalších 24 hodinách byly buňky 2x opláchnuty PBS a lyzovány směsí Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega) a Somatic Cell ATP Releasing Reagent (Sigma-Alrdich) v poměru 1:1, 400 l/jamku. Aktivita reportérového genu a množství intracelulárního ATP bylo stanoveno stejným způsobem jako u výše popsaných přechodně transfekovaných buněk. 40

41 5 VÝSLEDKY 5. 1 Vliv redoxních modulátorů na fenotyp mes buněk Pozorování změn v morfologii buněk v závislosti na přídavku vybraných činidel, představuje jednoduchý, ale účinný přístup, který nám poskytuje zevrubný obraz o proliferaci a diferenciaci buněk i bez využití moderních molekulárně biologických metod. Buňky mes v kompletním médiu s LIF byly po 12 hodinách od vysetí ovlivněny přídavkem 1 mm APO, 100 nm DPI a 15 mm NAC. Po 24 hodinovém působení modulátorů byly s pomocí digitálního fotoaparátu a inverzního mikroskopu při 200x zvětšení zhotoveny snímky. Obrázek 14 srovnává morfologii kolonií, obrázky 15, 16, 17, 18 představují vybraný detail ctr 1 mm APO 100 nm DPI 15 mm NAC Obrázek 14: Vliv redoxních modulátorů na morfologii mes. 24h působení 1 mm APO, 100 nm DPI, 15 mm NAC. 200x zvětšení. 41

42 Obrázek 15: ctr (měřítko = 50 m) Obrázek 16: 1 mm APO (měřítko = 50 m) 42

43 Obrázek 17: 100 nm DPI (měřítko = 50 m) Obrázek 18: 15 mm NAC (měřítko = 50 m) 43