12. Zhášení fluorescence

Transkript

1 12. Zhášení fluorescence

2 Dynamické zhášení fluorescence (collisional quenching) Jeli molekula fluoroforu v excitovaném stavu, srážka s jinou molekulou (např. I, O 2, akrylamid) může způsobit nezářivý přechod do základního stavu S 1 S 0 k A k E k N k Q.[Q] Pravděpodobnost srážky je přímo úměrná koncentraci zhášedla Bez zhášedla V přítomnosti zhášedla Kvantový výtěžek (intenzita) fluorescence F 0 QY = N N E A = k E ke + k N F QY = N N E A = k E + ke k + N k Q [ Q] τ 0 = 1 k + E k N Střední doba života τ = 1 ke + kn + k Q [ Q]

3 Dynamické zhášení fluorescence SternVolmerova rovnice F0 τ 0 = = 1+ K [ Q] = 1+ k τ [ Q] Q q 0 F τ K Q SternVolmerova zhášecí konstanta k q bimolekulární zhášecí konstanta (typické hodnoty M 1 s 1 ) k 0 = 4πN A (R f +R q ) (D f +D q ) k q = f Q.k 0 k 0... difúzní bimolekulární rychlostní konstanta f Q... účinnost zhášení (pro standardně používaná zhášedla bývá f Q 1) Smoluchowského rovnice N A... Avogadrova konstanta POZOR NA JEDNOTKY! R f,r q... kolizní poloměr (účinný průřez) molekul fluoroforu a zhášedla D f,d q... difúzní koeficienty fluoroforu a zhášedla Nízké hodnoty k q zpravidla značí nepřístupnost fluoroforu, vysoké hodnoty zpravidla ukazují na vazebnou interakci

4 Statické zhášení (static quenching) Fluorofor vytvoří komplex s jinou molekulou komplex již neemituje fluorescenci (např. fluorescein + antifluorescein). [ FQ] [ F][ Q] K = D. Celková koncentrace fluoroforu [F] T je dána [F] T = [F] + [FQ] Dosazením dostáváme [ F] T [ F] 1 = [ F][ Q] [ Q] [ F] T [ ] F* FQ* hν A hν E hν A F + Q FQ K D = 1. F a prostou úpravou s uvážením, že intenzita fluorescence F je přímo úměrná koncentraci volného fluoroforu [F] dostáváme F F 0 = 1+ K [ Q] (14.35) SternVolmerova rovnice (srovnej s dyn. zhášením) D Statické zhášení mění intenzitu fluorescence (množství emitujících molekul) ale ne střední dobu života! Statické zhášení taktéž poskytuje informace o přístupnosti fluoroforu

5 Rozlišení statického a dynamického zhášení Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, ) Změnou teploty 2) Změřením τ

6 Současné statické a dynamické zhášení Díky statickému zhášení je schopná emitovat pouze nezkomplexovaná frakce fluoroforů f = I/I 0 = 1/(1 + K S [Q]) Pokud navíc dochází ke koliznímu zhášení, pak je část těchto molekul zhasnuta díky kolizím, takže f 0 /f = 1 + K D [Q] Takže pro výslednou intenzitu fluorescence můžeme psát F 0 /F = (1 + K S [Q]) (1 + K D [Q]) = 1 + (K D +K S ) [Q] + K D K S [Q] 2 SternVolmerův graf je tedy zakřiven nahoru, což je indikací současného statického a dynamického zhášení. k Lineární je potom graf (F 0 /F 1) / [Q] vs. [Q] F* q [Q] FQ* k (F 0 /F 1) / [Q] = (K D +K S ) + K D K S [Q] N +k E F + Q K S FQ 1 F 0 /F τ 0 /τ (F 0 /F1) / [Q] K D +K S směrnice = K D K S 0 [Q] 0 [Q]

7 Sféra akce I pro zhášedlo, které zháší fluorescenci kolizně můžeme při vysokých koncentracích pozorovat zakřivení SternVolmerova grafu nahoru. Při vysokých koncentracích roste pravděpodobnost, že se nějaké zhášedlo nachází v momentě excitace dostatečně blízko fluoroforu (v tzv. sféře akce V Q ) a neumožní mu emitovat fluorescenci (podobně jako při statickém zhášení), lze spočítat z Poissonovské distribuce a je rovna exp ([Q]N A V Q ) Pro vysoké koncentrace zhášedla je tedy i při dynamickém mechanismu zhášení přesnější psát F0/F = (1 + K Q [Q]) exp([q]n A V Q ) Typické hodnoty N A V Q jsou 13 M 1, což odpovídá sféře akce o poloměru zhruba 1 nm.

8 Heterogenní populace fluoroforů Předpokládejme, že fluorescence je tvořena dvěma populacemi fluoroforů, takže v nepřítomnosti zhášedla F 0 = F 0a + F 0b = f a F 0 + (1f a ) F 0 kde f a je frakční příspěvek komponenty a ke steadystate intenzitě. V přítomnosti zhášedla je intenzita fluorescence rovna f af F = 1+ K a 0 [ Q] + ( 1 f a ) F0 1+ K [ Q] b Graf F 0 /F vs. [Q] je pak zakřiven směrem dolů. Pokud je jedna z frakcí zcela nepřístupná, tj. K b = 0, pak se dá rovnice upravit na F0 1 1 = + F F f K Q f 0 a a [ ] a a lineární je tedy graf F 0 /(F 0 F) vs. 1/[Q]. F 0 /F F 0 / (F 0 F) K A =5 M 1, f A =1 K A =5 M 1, K B = 0.5 M 1, f A =0.5 K A =5 M 1, K B = 0, f A = /f A [Q] (M 1 ) K A =5 M 1, f A =1 K A =5 M 1, K B = 0, f A = /[Q]

9 Quenchingresolved spektra F F 0 ( λ) ( λ) = 1 + i f i ( λ) [ Q] K i

10 Mechanismy způsobující zhášení 1) Intersystémová konverze Zhášedlo při srážce s fluoroforem v excitovaném singletním stavu způsobí jeho přechod do excitovaného tripletního stavu. Tripletníčas má dlouhou dobu života, takže může být velmi účinně zhášen celou řadou dalších mechanismů, a také pravděpodobnost zářivého přechodu z T 1 do S 0 je malá. k ISC F* + Q F T * Q k N teplo teplo Zhášedla způsobující intersystémovou konverzi molekulární kyslík O 2 jodid

11 Mechanismy způsobující zhášení 2) Přenos elektronu indukovaný světlem (photoinduced electron transfer, PET) Tyto mechanismy se uplatňují např. ve fotosyntéze nebo v solárních článcích Valeur B. Molecular Fluorescence, Wiley, 2002

12 Mechanismy způsobující zhášení 3) Tvorba excimerů a exciplexů Excimer = excitovaný dimer jsou tvořeny při srážce excitované molekuly se stejnou neexcitovanou molekulou M* + M (MM)* Exciplex = excitovaný komplex jsou tvořeny při srážce excitované molekuly s jinou molekulou v základním stavu M* + Q (MQ)* Tvorba excimerů a exciplexů je proces řízený difúzí a závisí tedy na koncentraci látek, na viskozitě prostředí a na teplotě. Excimer nebo exciplex může relaxovat do základního stavu nezářivě, nebo emitovat na jiných vlnových délkách. monomer dimer References/MolecularProbesThe Handbook/TechnicalNotesandProduct Highlights/LipidMixingAssaysof MembraneFusion.html

13 Mechanismy způsobující zhášení 4) Přenos protonu indukovaný světlem (photoinduced proton transfer) Acidobazické vlastnosti molekuly nejsou stejné v základním a excitovaném stavu. Nejzajímavější jsou případy, kdy kyseliny nebo báze jsou silnější v excitovaném stavu než v základním. V těchto případech může excitace způsobit přenos protonu. Ar = aromatický systém Valeur B. Molecular Fluorescence, Wiley, 2002

14 APLIKACE

15 Senzory Senzory mohou být založeny jak na dynamickém tak na statickém zhášení Senzor TNT Senzor ph Steadystate fluorescence quenching of CALIXPET in chloroform solution ( M) with TNT ( M to M; top to bottom); excited at 325 nm in the right angle geometry. Insets A and B refer to uncorrected and corrected Stern Volmer plots, respectively. Costa et al., Sensors and Actuators B: Chemical 161: ,

16 Intramolekulární Senzory zhášení Detekce kyslíku Zhášení tryptofanové fosforescence Strambini et al., Photochem. Photobiol. 80(3):

17 Prostorová přístupnost Porovnáváme fluorescenci v přítomnosti zhášedla s fluorescenci bez zhášedla F0 F =1+ K Q [ Q] SternVolmerova zhášecí konstanta závisí na přístupnosti fluoroforu. k q = K Q /τ Bimolekulární zhášecí konstanta Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999

18 Konformační změny Mg 2+ MgATP Na 2 ATP F404 W411 F571 W385 F404 A W411 F571 W385 F404 W411 F571 W385 F683 ATP F426 F683 ATP F426 F683 ATP F426 S732 S732 S732 I627 I627 I627 V648 V648 V648

19 Vliv náboje Absorpční (excitační) spektrum fluoresceinu Zhášení fluoresceinu pomocí I 10 K SV (M 1 ) Fluo Fluo excitation wavelength (nm)

20 Elektrostatický potenciál na Quenching by iodide povrchu proteinů + + Quenching of W683 K Q (M 1 ) KI K Q (M 1 ) acrylamide K Q (KI)/ K Q (AA) no substrate 10,3 ± 1,2 5,7 ± 0,4 1,8 Na 2 ATP 12,2 ± 1,4 4,0 ± 0,4 3,1

21 Změny po navázání ligandu geometrie F404 W411 F571 W385 ATP F683 F426 S732 F404 A W411 F571 W385 F683 ATP F426 S732 F404 W411 F571 W385 ATP F683 F426 S732 I627 I627 I627 V648 V648 V648 Mg 2+ MgATP Na 2 ATP ESP

22 Geometrie vs. ESP

23 Změny po navázání ATP + 0

24 Shrnutí Dynamické zhášení srážka fluoroforu v excitovaném stavu s molekulou zhášedla způsobí přechod fluoroforu do základního stavu bez vyzáření fotonu. Statické zhášení fluorofor vytvoří se zhášedlem komplex, který není schopen emitovat fluorescenci. V nejjednodušším případě je pro oba typy zhášení závislost intenzity fluorescence na koncentraci zhášedla popsaná SternVolmerovou rovnicí. Rozlišení typu zhášení změřením doby života fluorescence, změnou teploty Mechanismy zhášení intersystémová konverze, přenos elektronu nebo protonu indukovaný světlem, tvorba excimerů a exciplexů. Aplikace senzory, analýza terciální struktury biomolekul.