MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE TESTOVÁNÍ SMĚSNÝCH NEBO SEKVENČNĚ APLIKOVANÝCH FUNGICIDŮ NA RŮST ORCHIDEOIDNÍCH MYKORHIZNÍCH HUB IN VITRO Diplomová práce Michaela Šteslová Vedoucí práce: RNDr. Milan Baláž, Ph.D. Brno 2012

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Bc. Michaela Šteslová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie Testování směsných nebo sekvenčně aplikovaných fungicidů na růst orchideoidních mykorhizních hub in vitro Biologie Učitelství biologie pro střední školy, Učitelství matematiky pro střední školy RNDr. Milan Baláž, Ph.D. Akademický rok: 2011/2012 Počet stran: 46 Klíčová slova: orchideoidní mykorhiza; Epulorhiza; Ceratobasidium; Coprinus; karbendazim; propokonazol

3 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Bc. Michaela Šteslová Faculty of Science, Masaryk University Department of Botany and Zoology Testing of mixed or sequentially applied fungicides on the growth of orchid mycorrhizal fungi in vitro Biology Upper Secondary School Teacher Training in Biology, Upper Secondary School Teacher Training in Mathematics RNDr. Milan Baláž, Ph.D. Academic Year: 2011/2012 Number of Pages: 46 Keywords: orchid mykorhiza; Epulorhiza; Ceratobasidium; Coprinus; carbendazim; propiconazole

4 Abstrakt Studium funkcí orchideoidní mykorhizy (OM) je v současné době velmi limitováno absencí vhodné metody přípravy orchidejí s potlačenou mykorhizou. Vzhledem k časové náročnosti testování využití fungicidů k potlačení OM jejich aplikací přímo k hostitelským rostlinám znamená využití in vitro testování výrazné usnadnění. Ve své bakalářské práci jsem pozorovala četný vznik kmenů rezistentních ke karbendazimu (karb) a propikonazolu (prop), které v počátečních fázích byly velmi účinné. Studium vlastností těchto kmenů, stejně tak jako možnosti zamezení vzniku rezistence sekvenční nebo simultánní aplikací karb a prop byly cíli mé diplomové práce. Ověřila jsem rezistenci OM houby z rodu Epulorhiza jak vůči karb, tak i prop. Zjistila jsem, že při kultivaci kmene rezistentního ke karb na médiu bez tohoto fungicidu dochází po několika týdnech k nárůstu mycelia, které tuto rezistenci ztratilo. Potvrdila jsem synergistický efekt sekvenční i simultánní aplikace karb a prop. Oba tyto postupy tedy lze doporučit pro další testování vedoucí k přípravě orchidejí s potlačenou mykorhizou. Abstract The study of orchid mycorrhiza (OM) functioning is very limited by a lack of a method suitable for creation of orchid plants with restricted OM development. With respect to a time consuming testing of fungicides effect using plants, in vitro system represents a highly effective way to quantify effect of fungicides on OM fungi. In my bachelor thesis I observed emergence of many strains resistant either to carbendazim (carb) or propiconazole (prop), despite both these fungicides were highly effective in preventing growth of OM fungi. The aims of my diploma work were i) to assess properties of these resistant strains and ii) to study sequential application of carb and prop or their application as mixture (simultaneous application). I confirmed the resistance of specific strains of the OM fungus from the genus Epulorhiza to carb and prop. I observed growth of mycelia lacking resistance to carb when resistant strain was cultivated for several weeks on media without this fungicide. I confirmed synergisms of both sequential and simultaneous application of carb and prop. Both these approaches I can thus recommend for further testing, leading to creation orchids with restricted mycorrhiza.

5

6

7 Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucímu své bakalářské práce RNDr. Milanu Balážovi, Ph.D. za odborné rady, konzultace a trpělivost při zpracování mé diplomové práce.

8 Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a použila jen prameny a literaturu uvedenou na seznamu. Souhlasím s uložením práce v knihovně Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity a s jejím využitím ke studijním účelům. V Brně dne 10. května 2012

9 Obsah 1 Literární přehled Orchideoidní mykorhizní symbióza Houby tvořící OM Příprava rostlin s omezenou mykorhizou Fungicidy Působení fungicidů na orchideoidní mykorhizu Rezistence hub vůči fungicidům Materiál a metody Houbové izoláty Testované fungicidy Kultivační postup Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Hodnocení růstu kolonií Statistická analýza dat Výsledky Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Diskuse Citovaná literatura

10 LITERÁRNÍ PŘEHLED 1 Literární přehled 1.1 Orchideoidní mykorhizní symbióza Orchideoidní mykorhiza (OM) je endotrofním typem mykorhizy a vytvářejí ji zástupci čeledě vstavačovitých, Orchidaceae. Tuto čeleď s počtem druhů od do lze považovat za jednu z největších a nejrozmanitějších v rostlinné říši (Cribb et al. 2003). V České republice roste přibližně 24 rodů a asi 60 druhů s početnými mezirodovými kříženci. Nejznámější lokality v České a Slovenské republice jsou například Belanské Tatry, Strážovské vrchy, Bílé Karpaty, Beskydy, Vsetinská pahorkatina a České středohoří (Průša 2005). Tato čeleď je nejohroženější nejen u nás, ale v celém světě. Hlavními důvody jsou například znečištění životního prostředí eutrofizací nebo přímá destrukce a zánik stanovišť. Dalším důvodem je přeměna luk či pastvin na ornou půdu, tedy devastace stanovišť (Wotavová et al. 2003). Orchideje můžeme nalézt v nejrůznějších prostředích, některé rostou terestricky, epifyticky, jiné lithofyticky. Mohou být také liánovitého charakteru, např. Vanilla. Za nejmenší orchidej je považována Rhizanthella spp., která je řazena mezi podzemní druhy (Smith et Read 1997). Spojení s houbovými symbionty - OM je známé již od 19. stolení (Smith et Douglas 1987). Životní cyklus hostitelských rostlin je na této symbióze závislý, protože rostliny bez ní v reálých podmínkách nedokáží vyklíčit. Hyfy specifické houby prorůstají do klíčícího semene a poskytují rostlině vitaminy, aminokyseliny, uhlíkaté látky a další živiny (Arditti et al. 1990). To potvrzuje i fakt, že všechny orchideje mají plody s velkým množstvím prachových semen o malé hmotnosti (0,3-14 µg) obsahující minimální množství lipidů, proteinů a škrobových zrn (Taylor et al. 2004; Arditti et Ghani 2000; Smith et Read 2008). Značnou roli hraje i v následném růstu semenáčů a pravděbodobně i u dospělých orchidejí. V dospělosti nepochybně vytvářejí OM nezelené druhy orchidejí, např. Neottia nidus-avis, Corallorhiza trifida, protože kvůli potlačené listové ploše jsou fotosynteticky nesoběstačné (Hudák et al 1997). Symbióza těmto orchidejím zabezpečuje přísun uhlíkatých látek, které jsou nezbytné pro jejich život. Na Zemi se vyskytuje přibližně 160 druhů nezelených orchidejí (Leake 1994). Nicméně pro většinu orchidejí platí, že v dospělosti mají dobře rozvinutou a fotosynteticky aktivní listovou plochu, dochází tedy ke změně způsobu výživy. Výhradní role OM je později částečně nebo úplně nahrazena fotosyntetickou asimilací CO 2. Přesto většina fotoasimilujících druhů orchidejí bývá mykorhizními houbami kolonizována. 10

11 LITERÁRNÍ PŘEHLED Na základě pozorování bylo zjištěno, že kořeny terestrických druhů mají oproti epifytickým druhům více kolonizované kořeny (Hadley et Williamson 1972). Stejně jako u jiných typů mykorhiz, i u OM symbiózy rozlišujeme kořenové a mimokořenové mycelium. Zatím je lépe probádáno mycelium kořenové s cílem objasnit mechanismus přenosu uhlíkatých látek uvnitř kořene. Mimokořenové mycelium je však pro funkci této symbiózy určující, jako u ostatních typů mykorhiz. OM houby produkují lytické enzymy (Hadley et Perombelon 1963, Hadley 1966, Smith 1966, Marchisio et al 1985), díky kterým uvolňují z půdy rozpustné látky. Ty se pak společně s minerálními látkami vstřebávají a transportují do kořene. U OM byly popsány dvě formy mykorhizní kolonizace kořenů orchidejí, tolypofágní a ptyofágní (Bernard 1909, Burgeff 1932, 1936). Tolypofágní forma je rozšířenější a běžnější typ a vyskytuje se jak u protokormů, tak u dospělých rostlin. K primárnímu průniku do pletiv kořene dochází z vnějšího půdního prostředí. Kořeny dospělých rostlin jsou kolonizovány přes kořenovou pokožku včetně kořenových vlásků (Peterson et Farquahar 1994). Houba se šíří pouze parenchymatickými buňkami primární kůry kořene. Nejblíže u povrchu kořene se nachází vrstvy průchozích buněk, kterými houba prorůsta bez většího větvení. Prorůstání hyf se děje výhradně symplastickou cestou, pravděpodobně přes plazmodezmy. Blíže ke středu kořene vytváří houba v hostitelských buňkách klubíčkovitě stočené hyfy, chatakteristické struktury zvané pelotony. Peloton je typická struktura pro mykorhizu, u volně žijících OM hub se nevyskytuje. Pozorování elektronovým mikroskope ukázalo, že buňky kořenové kůry nejsou nikdy v přímém kontaktu s rostlinnou cytoplazmou, ale jsou obklopeny vchlípenou cytoplazmatickou membránou hostitelských buněk, perifungální membránou (Hadley et al 1971, Nieuwdorp 1972, Peterson et al 1998). Mezi buněčnou stěnou houby a perifungální membránou se nachází mezilehlý prostor, který hraje důležitou roli v přenosech látek mezi rostlinou a houbou. Postupem času dochází k degeneraci pelotonů, tento proces nastává v rozmezí od dvou dnů (Purves et Hadley 1975) až po přibližně jeden měsíc od vzniku pelotonu (Burges 1939). Po pelotonu zůstane uvnitř buněk hostitele hmota houbového původu a velmi často dochází ke tvorbě pelotonu nového. Druhým typem OM je ptyofágní forma, která je známa pouze u několika druhů nezelených tropických orchidejí a dosud je velmi málo probádána. Žádný z českých zástupců ji zřejmě nevytváří. Od tolypofágní formy se liší destrukcí pelotonů. V případě ptyofágní formy dochází k lyzi jednotlivých hyf protůstajících do buněk primární kůry z rhizomorfy (svazek houbových vláken), narozdíl u tolypofágní formy podléhají lyzi celé pelotony. 11

12 LITERÁRNÍ PŘEHLED 1.2 Houby tvořící OM Houby, které nejčastěji tvoří mykorhizní symbiózu s orchidejemi řadíme do rodu Rhizoctonia. Bernard byl první, kterému se v roce 1904 podařila izolace tohoto druhu z kořene orchideje. V roce 1909 společně s Burgeffem poprvé popsaly pelotony a pokusili se o klasifikaci hub, které vyizolovali z kořenů orchidejí. Klasifikovali tři druhy rodu Rhizoctonia R. repens, R. mucoroides a R. lanuginosa (Bernard 1909). Dříve byly za OM houby považovány také některé Ascomycota, dnes je za OM houby nepovažujeme, protože nejsou schopny vytvářet vnitrobuněčné hyfové smotky (Currah et al. 1997). Na základě morfologických znaků vegetativního mycelia byl rod Rhizoctonia rozdělen do několika anamorfních (anamorfní stádia rozmnožují se pouze nepohlavně) rodů, například Moniliopsis, Ceratorhiza a Epulorhiza. Pozdějí se podařilo u některých izolátů indukovat teleomorfní stádia (pohlavní) (Warcup et Talbot 1967). Rod Rhizoctonia se podle těchto stádií dělí do tří hlavních kládů Ceratobasidiales, Tulasnellales a Sebacinales, které řadíme do oddělení Basidiomycota. Podle pravidel v mykologii mají anamorfní a teleomorfní stadia téhož organismu dvě různá platná jména. Například anamorfnímu stadiu Ceratorhiza goodyerae repentis odpovídá teleomorfní stadium Ceratobasidium cornigerum (Smith et Read 2008). Všechny houby vytvářející OM patří mezi stopkovýtrusné houby (Rasmussen 2002). Za univerzálního orchideoidního symbionta je považována Rhizoctonia repens, která byla izolována například z orchideje Dactylorhiza purpurella (Harvais et Hadley, 1967). Rozlišování jednotlivých druhů Rhizoctonia je obtížný úkol. Častěji se izoláty určují na základě anamorfních stádií, protože teleomorfními stádii se těžko získávají a rozdíly mezi nimi jsou u některých druhů velmi malé. Mycelium anamorfních stádií je tvořeno dvěma typy hyf, lineárních a tzv. moniliodních buněk. Lineární typ hyf je na povrchu hladký, výrazně přehrádkovaný, často se větvící a posléze se spájí. Moniliodní buňky jsou kratší, septované, vytvářejí řetízky a také mají schopnost se spájet. Pro druhové určení se využívají znaky jako počet jader v buňkách, rychlost růstu, barva kolonie, tvorba vzdušného mycelia a rozměry lineárních a monilioidních buněk. Jestliže jsou k dispozici teleomorfní stadia, tak se zjišťuje tvar a rozměry bazidií a bazidiospor. Charakteristickým znakem OM hub, schopnost saprofytního růstu, jsou hydrolytické enzymové aktivity těchto hub, zejména aktivita celulolytická, pektinolytická a fenolosidázová (Hadley et Perombelon 1963, Marchisio et al. 1985). Díky těmto aktivitám mohou OM houby využívat jako zdroj uhlíku a energie širokou paletu organických látek. Jako OM houby se 12

13 LITERÁRNÍ PŘEHLED mohou uplatňovat i některé izoláty Rhizoctonia izolované z kořenů jiných rostlin než orchidejí, izoláty rostoucí volně v půdě jako saprotrofní organizmy, nebo dokonce parazité jiných druhů rostlin. Například v kořenech Dactylorhiza purpurella byla zjištěna houba Rhizoctonia solani, která je častým patogenem rostlin čeledí Solanaceae a Cucurbitaceae (Downie 1957). Mezi OM houbami tedy najdeme parazitické houby, pudní saprofyty i houby, které tvoří ektomykorhizy. Orchideoidní mykorhizy nezelených druhů se vždy vyskytují v blízkosti ektomykorhiz a oby typy mykorhiz mohou být spojeny stejnou houbou, která zajišťuje transport energeticky bohatých látek z ektomykorhizní rostliny do orchideje (McKendrick et al. 2000). Při dlouhodobém soužití OM houby s orchidejí může dojít ke ztrátě schopnosti symbiotického soužití s jinými hostitely, s nimiž tvoří ektomykorhizy. Izoláty Sebacina vermifera získané z kořenů nebo z rhizosféry orchidejí Phyllanthus calycinus, vytvářejicí běžně arbuskulární mykorhizy, tvořily OM s orchidejemi Microtis, ale nebyly schopny tvořit ektomykorhizy s několika různými hostiteli (Warcup 1988). 1.3 Příprava rostlin s omezenou mykorhizou Pro experimentální studium mykorhizy je třeba získat kontrolní rostliny, u kterých je zcela potlačena mykorhiza (nemykorhizní rostliny), nebo alespoň částečně (semimykorhizní rostliny). Tyto rostliny mají nezastupitelný význam pro kvantifikaci růstové odezvy rostlin na vytvoření mykorhizní asociace, pro studium role OM v kompetičních vztazích s okolní vegetací. Jsou nutné pro experimenty, které se týkají zvýšeného příjmu minerálních látek, především fosforu. Pro studium fungování mykorhizních symbióz je vhodnější používat semimykorhizní rostliny, protože se fyziologicky více podobají rostlinám s rozvinutou mykorhizou. Možnosti přípravy rostlin s omezenou mykorhizou jsou nejvíce prostudovány u mykorhizy arbuskulární. Jako nejsnadnější se jeví metoda nezaočkování, to znamená, že rostliny se kultivují v substrátu či kultivačním médiu, které samo nesmí obsahovat žádné mykorhizní houby. Rostliny bez mykorhizy lze získat různými způsoby, mohou být vypěstovány z povrchově sterilních semen či získané některou z technik mikropropagace, např. somatickou embryogenezí. Neprobíhá-li experimentální práce v in vitro podmínkách, tak nelze jednoduše udržovat sterilitu kultivačního prostředí. Proto musí být rostliny kultivovány v substrátu, který je prostý kompatibilních mykorhizních hub. Toho se může docílit např. fumigací půdy, tedy aplikací par formaldehydu, chloropikrinu, metylbromidu či vapamu. Při terénních studiích je tato metoda nevhodná, protože takto ošetřená půda může být pro rostliny toxická (Menge 13

14 LITERÁRNÍ PŘEHLED 1982). Naopak často používanou metodou je tepelná sterilizace půdy. Výhodou je snadná příprava, např. autoklávováním. Půdu lze sterilizovat i γ-zářením, kdy se ovšem může z půdy uvolnit ve větší koncentraci toxický mangan nebo měď. Sterilizaci γ-zářením či fumigací lze používat pro laboratorní účely, nelze je však aplikovat při terénních studiích. Další alternativou je ošetření půdy fungicidem benomylem, který lze využít i při terénních studiích (Kahiluoto et al. 2000). Při použití fungicidů dochází zejména k redukci mimokořenového mycelia, zatímco vnitrokořenové mycelium nemůsí být výrazněji ovlivněno (Hutson et Miyamoto 1998). Kultivace rostlin bez mykorhizy je jedndušší v případě, že se spory dané kompatibilní mykorhizní houby nešíří anemochoricky na větší vzdálenosti. To je splněno například u arbuskulární mykorhizy, kdy není problém udržet nemykorhizní rostliny v běžném skleníku. Možná je i kultivace ve venkovním prostředí, když se zamezí vniknutí okolní půdy s autochtonními houbami do kultivačních nádob. U orchideoidní mykorhizy je situace odlišná, protože spory mykorhizních hub se snadno šíří vzduchem. Při kultivace ex vitro je možné zamezit přístupu spor například filtrací vzduchu, tato metoda se však z finančních důvodů nepoužívá. Nejvhodnější alternativou se tedy jeví požití fungicidů. Počátkem osmdesátých let minulého století byly jako první použity benzimidazoly, konkrétně thiabendazol (Alexander et al. 1984, Alexander et Hadley 1984, Alexander et Hadley 1985). Fungicidy jsou běžně používány i u jiných typů mykorhizních symbióz, k omezení růstu arbuskulárních hub byl v řadě terénních studií využit fungicid benomyl (West et al. 1993a, 1993b, Newsham et al. 1994, Kahiluoto et Vestberg 2000). Pro získání rostlin s potlačenou mykorhizou je vhodná aplikace fungicidů před vytvořením mykorhizní symbiózy. 1.4 Fungicidy Fungicidy se běžně používají především k ochraně zemědělských plodin. První fungicid byl pro tyto účely použit na začátku dvacátého století. Postupně vyvíjené fungicidy byly děleny na organické a anorganické. Jednou z nejdůležitějších skupin organických fungicidů jsou dithiokarbamáty, patří sem ferbam, ziram, thiriam, zineb a další. Tyto organické fungicidy jsou obvykle efektivnější než fungicidy anorganické. Organické molekuly fungicidů lépe pronikají do buněk houby a lépe inhibují její metabolické děje. Porušují fyziologické prosesy houbových buněk například reakcí s enzymy, které jsou důležité pro tvorbu proteinů. Tyto fungicidy ovlivňují více metabolických procesů v houbě. Nevýhodou fungicidů je, že 14

15 LITERÁRNÍ PŘEHLED nepůsobí pouze na houby, ale zároveň i na jiné organismy. Například deriváty dinitrofenolu narušují oxidativní fosforylaci při aerobním dýchání a tudíž jsou více méně toxické pro velké množství aerobních organismů. Toto neselektviní působení má někdy vliv na vznik nežádoucích efektů i u ošetřených rostlin a dalších organismů, například savců. Když se na začátku šedesátých let na tyto nepříznívé efekty přišlo, bylo snahou zvýšit efektivitu na cílové houby a snížit nežádoucí účinky na životní prostředí. Díky tomu se podařilo vyvinout nové typy fungicidů, které působí pouze na cílové organismy a nejsou toxické pro rostliny, savce a další organismy. Aktivita těchto fungicidů je omezená pouze na určitý počet inhibicí buněčné fyziologie. Většinou působí jen na určitý metabolický děj houby. Nejúčinnějšími fungicidy jsou ty, které inhibují biosyntézu životně důležitých struktur. Problémem těchto fungicidů je vysoké riziko vzniku rezistence. I přes širokou nabídku těchto fungicidů jsou stále houby, na které neúčinkují. Proto je nezbytné používat i fungicidy, které působí na více metabolických dějů (Hutson et Miyamoto 1998). Existuje mnoho kritérií, podle kterých je možné fungicidy třídit. Obecně jsou tříděny podle chemické povahy, způsobu účinku proti houbám a podle všeobecného použití (Nene et Thapliyal 1993). Třídění je možné i podle jejich účinku na stavbu a funkci houbových buněk. Podle tohoto třídění jsou fungicidy do více než deseti kategorií (Anonymous 2009). První kategorie je tvořena fungicidy, které inhibují syntézu nukleových kyselin. Do této skupiny patří fenylamidy, které inhibují tvorbu RNA polymerázy. Jsou účinné např. proti Peronosporales (Oomycota). V roce 1973 byla objevena nová třída fenylamidů, acylalaniny, s vysokou účinností in vitro. Patří sem např. metalaxyl, který inhibuje biosyntézu ribozomální RNA. Dalšímí zástupci jsou benalaxyl, furalaxyl. Acylalaniny jsou významné v boji proti Oomycota, kde je většina ostatních fungicidů méně účinná (Hutson et Miyamoto 1998). Do druhé kategorie patří fungicidy, které narušují mitózu a buněčné dělení. Ovlivňují biosyntézu ß-tubulinu a tím zabraňují vzniku dělícího vřeténka. V šedesátých letech byla představena jedna z nejdůležitějších skupin této kategorie fungicidů, benzimidazoly. Hlavní zástupci této skupiny jsou benomyl, karbendazim a thiabendazol. Karbendazim použitý ve formě zálivky při sázení rostlin do rašelinného substrátu potlačil úplně růst mimokořenového mycelia orchideoidní mykorhizní houby (Trojanová 2008). Byl-li karbendazim přidán k plně vytvořené OM, neměl již žádný účinek (Balážová 2009). Karbendazim je zpočátku při kultivaci in vitro velmi účinný v potlačení růstu izolátů OM hub, 15

16 LITERÁRNÍ PŘEHLED jeho účinnost je však časově omezena (Šteslová 2010). Benzimidazoly jsou účinné proti Ascomycota, Fungi Imperfecti jako je Botrytis, Fusarium a Verticillium (Hutson et Miyamoto 1998).. Tyto houby zahrnují rostlinné patogeny zeleniny, ovoce a okrasných květin. Tyto fungicidy jsou málo toxické pro Basidiomycota, proto je možné je použít k ochraně hub tohoto rodu, které napadla Trichoderma nebo Verticillium. Do třetí skupiny patří fungicidy, které zasahují do buněčného dýchání. Tato skupina je členěna na další, např. inhibitory oxidativní fosforylace ATP syntázy: fentin acetát, fentin chlorid. Dalšími zástupci jsou fluazinam, metominostrobin, ferimzon a další (Anonymous 2009). Fluazinam má široké užití proti rostlinným patogenům, užívá se k ochraně brambor, vinné révy. Fermizon se používá k ochraně rýže (Hutson et Miyamoto 1998). Do další kategorie patří fungicidy, které ihibují syntézu proteinů a aminokyselin. Syntézu methioninu inhibují AP fungicidy (anilin-pyrimidiny), patří sem cyprodinil a pyrimethanil. Syntézu proteinů inhibují i některá anibiotika (tetracykliny). AP fungicidy jsou účinné proti Ascomycota a Fungi Imperfecti (Hutson et Miyamoto 1998). Další kategorie zahrnuje fungicidy, které narušují biosyntézu ergosterolu v buněčných membránách. Zemědělsky nejvíce užívané se dělí do dvou podskupin DMI fungicidy (látky inhibující demetylaci) a skupina fungicidů odvozená od derivátů morfolinu. DMI fungicidy se dále dělí na triazoly, pyrimidiny, piridiny, piperaziny a imidazoly. Jedním ze zástupců DMI fungicidů je bitertanol, který je dostupný jako komerční přípravek Baycor 25 WP, který se používá především proti strupovitosti ovoce.( Dalšímí zástupci jsou např. propikonazol, etaconazol. Tato kategorie fungicidů je účinná proti Ascomycota, Basidiomycota a Fungi Imperfecti. Přenos signálů v buňce ovlivňují fenylpyroly, azanaftalény a dikarboxidy. Zástupci dikarboxidů jsou např. iprodion a vinklozolin. Tyto fungicidy jsou efektivní v boji proti Botrytis, Sclerotinia a dalším rostlinným patogenům. Způsobují poruchu buněčné struktury při růstu a dělení. Fenylpyroly jsou účinné proti Ascomycota, Basidiomycota. Do další kategorie patří fungicidy, které ovlivňují syntézu buněčných membrán a lipidů. Patří sem např. chloroneb, který je účinný proti Rhizoctonia, Typhula a Botrytis. Další zástupce quintozen se používá proti Plasmodiophora, Fusarium a Pythium. 16

17 LITERÁRNÍ PŘEHLED Syntézu melaninu v buněčných stěnách narušují MBI fungicidy (melanin biosyntesis inhibitors). Zástupci jsou např. tricyklazol, fenoxanil a diklocymet. Tricyklazol v in vitro podmínkách vykazuje velmi slabou toxicitu proti Pyricularia oryzae i proti jiným houbám (Nene et Thapliyal 1993). Do zbylých kategorií patří fungicidy, které indukují obranné reakce hostitele, narušují syntézu glukanu. Některé fungicidy mají vliv na více metabolických procesů buňky houby, tzv. multi site action fungicidy (např. mancozeb). U některých fungicidů je jejich mechanismus působení stále neznámý (např. triazoxid). 1.5 Působení fungicidů na orchideoidní mykorhizu Účinek fungicidů na orchideoidní mykorhizu je narozdíl od jiných typů mykorhiz velmi málo probádané téma. Ve světové literatuře je popsáno jen několik případů, které zkoumaly především benzimidazoly (thiabendazol a benomyl). Ve studiích z 80. let (Alexander et al. 1984, Alexander et Hadley 1984, 1985) byl popsán účinek thiabendazolu na rozvoj mykorhizní asociace oddenkaté stálezelené orchideje Goodyera repens s houbou Rhizoctonia goodyerae-repentis. Tento fungicid byl aplikován v in vitro i ex vitro podmínkách. Při kultivaci in vitro byl thiabendazol aplikován do agarem ztužených médií v koncentraci 1 mg l -1, v případě ex vitro kultivace byla použita 10x vyšší koncentrace a rostlina byla pěstována ve směsi perlitu s vermikulitem. Toto ošetření v případě agarových médií velmi účinně potlačilo růst mimokořenového mycelia a fungicid neprokazoval žádné známky fytotoxicity (Alexander et Hadley 1984). V případě ex vitro kultivace ani zvýšená koncentrace a aplikace před zasazením rostlin nedokázal fungicid zamezit růstu houby v pletivech orchideje, pouze růst snížil. Účinek thiabendazolu byl poté zkoumán v jedné terénní studii, která měla kvantifikovat roli OM v produkci semen a plodů druhu Dactylorhiza maculata (Vallius 2001). Fungicid byl ve formě 10 ml roztoku o koncentraci 250 g thiabendazolu na 1 litr acidifikované vody o ph 2,2 injekčně aplikován přímo do půdy kolem kořenů každé rostliny. Autorka uvádí, že pravidelně odebírala kořeny a zpracovala je metodou, kdy kořeny po projasnění barvila trypanovou modří (Phillips et Hayman 1970), přesto výsledky neposkytují žádné údaje o rozsahu mykorhizní kolonizace. Rozdíly mezi ošetřenými a neošetřenými rostlinami byly sice statisticky průkazné, ale je možné, že došlo k poškození kořenového systému rostlin injekční aplikací thiabendazolu. V úvahu přichází i možnost, že ošetřené rostliny reagovaly na acidifikaci mykorhizosféry. 17

18 LITERÁRNÍ PŘEHLED Vzhledem k účinnosti thiabendazolu byl dalším testovaným fungicidem benomyl, který patří také do skupiny benzimidazolů. V současné době je to nejpoužívanější fungicid vůbec. Benomyl byl aplikován ve směsi společně s propikonazolem pro ošetření tropické orchideje Lepanthes rupestris (Bayman et al. 2002). Směs byla aplikována na rostliny ve formě postřiku každé dva týdny, koncentrace benomylu činila 0,8 g l -1, propikonazol byl v koncentraci 0,1 g l -1. Bohužel, efekt směsi na mykorhizní symbiózu nebylo v tomto experimentu možné prokázat, protže daná orchidej je velmi málo mykorhizní. Benomyl byl pro redukci OM použit také ve studii Shimura a Koda (2005), kdy byl jeho efekt testován na střevíčník druhu Cypripedium macranthos var. Rebunense v umělých podmínkách. Protokormy byly přeneseny na médium obsahující 1,7 µmol, tj. přibližně 0,5 mg l -1 benomylu (Shimura et Koda 2005). V tomto případě byl růst mykorhizní houby potlačen, nebyla schopna prorůstat z kolonizovaných protokormů. V dalším experimentu byl testován efekt benomylu na růst OM hub u tří druhů orchidejí pěstovaných v zeolitu, Dactylorhiza fuchsii, D. Majalis a Platanthera bifolia (Čuříková et al. 2009). Rostliny byly ošetřovány fungicidem o koncentraci 25mg.kg -1 substrátu ve dvoutýdenních intervalech. Růst mimokořenového mycelia nebyl ovlivněn, v případě kolonizace kořenů druhu D. fuchsii nebyla po jedné dávce aplikace fungicidu statisticky průkazně nižší oproti kontrole. Vliv vybraných fungicidů (thiabendazol, karbendazim, iprodion, kaptan, fosetyl-al a propikonazol) byl také testován na oddělení fyziologie a anatomie rostlin v rámci bakalářských a diplomových prací (Kyjovská 2007, Trojanová 2008, Huĺuková 2009). Získané výsledky ve své disertační práci shrnula Balážová (2009). Některé z experimentů se zaměřily například na testování fungicidů s různými mechanismy působení, na srovnání účinnosti daných fungcidních látek při aplikaci do mykorhizosféry narozdíl od aplikace do bočního hyfového oddělení v rhizoboxovém systému. Dále se testoval vliv přídavku organické hmoty do pěstebního substrátu na účinnost fungicidů. Jako nejúčinnější se jeví aplikace fungicidů do rhizoboxového systému, do hyfosféry. Účinnost se snižovala se zvyšujícím se obsahem organické hmoty v substrátu. Fungicidy je nutné aplikovat před rozvojem mimokořenového mycelia a jejich účinek je závislý na užité koncentraci. 1.6 Rezistence hub vůči fungicidům Houby, na které se aplikují po delší dobu fungicidy si jsou schopny vyvinout proti těmto látkám určitou rezistenci. Metody jak předcházet vzniku rezistence hub k daným fungicidům jsou komplexní problém. Existuje několik postupů, jak tuto rezistenci oddálit nebo zamezit 18

19 LITERÁRNÍ PŘEHLED jejímu vzniku. Dva nejvhodnější způsoby, jak předejít vzniku rezistence hub na fungicidy s odlišným chemickým působením, jsou střídání fungicidů nebo simultánní aplikace více fungicidů zároveň ve směsi. Postupy pro oddálení vzniku rezistence mohou zahrnovat jednoduché střídání, kdy po jedné aplikaci fungicidu A použijeme fungicid B, potom A, opět B atd. Další variantou je aplikace jendoho fungicidu po delší dobu (série aplikací), pak použití jiného fungicidu jednorázově nebo opět v sérii aplikací. Bývá vhodné použít i třetí fungicid v této řadě. Množství aplikací v jedné sérii je obvykle limitováno (Anonymous 2010). Pro směsi je typické užití více fungicidů najednou. Množství jednotlivých fungicidů ve směsi je voleno tak, aby potlačilo růst houby i při samotném aplikování. Směsi ke komerčnímu použití je možné získat již smíchané nebo si je podle potřeby můžeme namíchat sami a tak dávky jednotlivých složek postupně regulovat. Množství fungicidů ve směsi můsí být pečlivě vyváženo s ohledem na délku, po kterou jsou schopny působit. Ve směsích se nejčastěji kombinuje tzv. single site fungicid s tzv. multi site fungicidem. Příkladem takovéto směsi je fungicidní přípravek Curzate Gold (účinné látky mancozeb multi site a cymoxanil single site)( Single site fungicidy působí pouze na určitý metabolický děj v buňce (mitóza buňky, biosyntéza sterolů). Houby si snáze vytvoří rezistenci na tento typ fungicidů, protože snadno vznikne mutace příslušného genu. Druhou složkou je multi site fungicid, který nepůsobí pouze na jeden metabolický děj, ale inhibuje více dílčích mechanismů. U takovýchto fungicidů je malá pravděpodobnost vzniku rezistence. Na trhu jsou k dostání i směsi dvou single site fungicidů např. ARTEA 330 EC (účinné látky cyprokonazol a propikonazol). Oba fungicidy řadíme do skupiny DMI fungicidů, které inhibují syntézu sterolu. Fungicidní přípravek ALTO COMBI 420 SC obsahuje účinné látky s různým mechanismem působení (cyprokonazol-dmi fungicid a karbandazim benzimidazol, brání vzniku dělícího vřeténka při mitóze)( Zatím nelze jednoznačně určit, která z metod, střídání fungicidů nebo užití směsi, je vhodnější pro potlačení vzniku rezistence. Volba metody je jednak závislá na druhu houby, dostupnosti vhodného fungicidu a dalších faktorech. Střídání fungicidů se například doporučuje v situaci, kdy během jedné vegetační sezóny rostliny musíme fungicid často aplikovat. Nicméně cílem je vybrat takovou metodu, která mininimalizuje riziko vzniku rezistence. 19

20 LITERÁRNÍ PŘEHLED Riziko vzniku rezistence je definováno jako kombinace chemické povahy fungicidu, jeho interakcí s houbou a podmínkami prostředí. Je obvyklé, že jeden fungicid působí odlišně na různé druhy hub. Riziko vzniku rezistence se dělí na nízké, střední a vysoké. Determinace středního rizika bývá nejobtížnější. Fungicid nebo kombinace fungicid konkrétní druh houby je řazen do kategorie nízkého rizika vzniku rezistence, jestliže se rezistence objevila pouze ve vzácných případech nebo vůbec. Jak již bylo zmíněno, řadí se sem především multi site fungicidy např. dithiokarbamáty, sulfamidy. Kombinace fungicid houba je klasifikováná do vysokého rizika vzniku rezistence na základě rychlého nárůstu mycelia, již během krátkého používání. Dochází zde ke vzniku monogenních mutací. Do této skupiny se řadí fenylamidy, MBC fungicidy (methyl benzimidazole carbamates), dikarboximidy. Riziko vzniku rezistence je samozřejmě závislé na kombinaci fungicid druh houby. Je možné že kombinace téhož fungicidu na dva různé druhy hub může být jednou řazena do vysokého a v druhém případě do nízkého rizika vzniku rezistence. Ve směsích je možné kombinovat fungicidy s různou mírou rizika vzniku rezistence. Směs dvou fungicidů sice nedokáže zabránit eventuálnímu vzniku rezistence vůči jednotlivým složkám, ale při správném používání může nástup rezistence významně oddálit. První typ směsi je kombinace dvou funcidů s nízkým rizikem vzniku rezistence. Užívání této směsi dvou fungicidů nemění riziko vzniku rezistence při používání jednotlivých složek samostatně. Další typ směsi kombinuje fungicid A s vysokým rizikem (single site) a fungicid B s nízkým rizikem (multi site) v případě, že není známá rezistence vůči fungicidu A. V tomthle případě se používá nižší dávka fungicidu A než při jeho samotné aplikaci. Tato dávka je dána kritickou hranicí, při které by musela mít viditelný účinek i při samostatném užití. Obvyklá dávka ve směsi nemůže být nižší než 50% dávka doporučená pro samostatnou aplikaci fungicidu. Pro docílení dlouhodobé ochrany se doporučuje 75% dávky. Dalším typem směsi je kombinace dvou single site fungicidů s odlišným mechanismem působení a neznámou rezistencí ani k jednomu fungicidu. Používání směsi může oddálit vznik rezistence k jednotlivým fungicidům. Proto je možné tuto směs používat účinně déle, než samotné fungicidy. Koncentrace fungicidů ve směsi by měla být stejná jako při jejich samostatné aplikaci. V případě, že je známá rezistence k jedné nebo oběma složkám směsi, nelze používat složky samostatně. Je-li známá rezistence na nějaký fungicid A, není vhodné ho kombinovat s fungicidem B s vysokým rizikem vzniku rezistence. Takováto směs může urychlit vznik rezistence vůči fungicidu B (Anonymous 2010). 20

21 LITERÁRNÍ PŘEHLED Vznik rezistence obecně ovlivňuje 1) počet aplikací téhož fungicidu, rychlost vzniku mutace je přímoúměrná frekvenci aplikace; 2) uniformita, střídání nebo aplikace fungicidů s odlišnými mechanismy snižuje vznik rezistence; 3) množství, dávka fungicidu použitá při jednotlivé aplikaci, 4) množství již narostlé houby před aplikací fungicidu (Brent et Hollomon 2007). 21

22 MATERIÁL A METODY 2 Materiál a metody 2.1 Houbové izoláty Ve svých experimentech jsem použila tři izoláty orchideoidních mykorhizních hub, izolovaných do čistých kultur a dále kultivovaných v Mykorhizní laboratoři Ústavu experimentální biologie PřF MU v Brně. Izolát 2006/7 byl získán izolací z druhu Serapias strictiflora a podle analýzy jeho ITS oblasti rdna se jedná o blíže neurčený druh rodu Epulorhiza; v GenBank je izolát veden pod číslem EU (Látalová a Baláž 2010). Izolát 2007/4 byl získán z kořenů Ophrys speculum (syn. O. vernixia). Podle sekvenování ITS oblasti ribozomální DNA se jedná o zástupce rodu Ceratobasidium. Izolát 2010/26 byl izolován z druhu Ophrys sicula (syn. O. lutea ssp. galilea) a dle sekvenování ITS oblasti ribozomální DNA se jedná o zástupce rodu Coprinus nebo Coprinellus. Případné využití specifických kmenů izolátu 2006/7 rezistentních k danému fungicidu, získaných v rámci mé bakalářské práce (Šteslová 2010) je indikováno v popisu příslušného experimentu. 2.2 Testované fungicidy Ve svých experimentech jsem použila dva fungicidy: komerční fungicidní přípravek Tilt 250 EC obsahuje jako aktivní fungicidní látku propikonazol (v dalším textu označován zkratkou prop; 1-[ [2-(2,4-dichlorophenyl)-4-propyl-1,3-dioxolan-2-yl]methyl]-1,2,4-triazol; 250 g l -1 ). Druhá fungicidní látka, karbendazim (v dalším textu označován zkratkou karb; methyl-n-/2-benzimidazolyl/-karbamát), byl aplikován jako čistá chemikálie (Sigma, kat. č ). 2.3 Kultivační postup Veškerá kultivace hub probíhala na živném médiu na nedělených Petriho miskách o průměru 9 cm. Jako médium pro kultivaci jsem použila médium PDA (bramborovoglukózový agar, na 1 litr média je třeba extrakt z 200 g rozmixovaných brambor, 10 g agaru a 10 g glukózy) (Gryndler et al. 2004). Fungicidní látky byly do PDA média přidávány před jeho autoklávováním (20 min při 120 C). Každý fungicid byl testován ve čtyřech koncentracích. Výchozí koncentrace byla volena jako doporučená dávka výrobce pro foliární aplikaci (c 1 ), dálší tři koncentrace byly dekadická ředění výchozí koncentrace (dále v textu značeny c 1/10, c 1/100 a c 1/1000 ). Jako konrtolní varianta (k) bylo použito vždy PDA médium pouze s přídavkem rozpouštědla, které bylo použito ke vnesení fungicidu do médií (96% ethanol v případě karb, 22

23 MATERIÁL A METODY čistý aceton u prop). Kultivace probíhala ve tmě při teplotě 20 ± 2 C. Každá Petriho miska byla zaočkována agarovým bločkem 0,5 0,5 cm, který byl odebrán z okraje aktivně rostoucí kolonie daného houbového izolátu na PDA médiu. 2.4 Experiment 1 V experimentu 1 jsem testovala vliv karb na růst izolátu 2006/7 bez získané rezistence (značen jako wt) a čtyř kmenů téhož izolátu, rezistentních vůči karb, odvozených v rámci v mé bakalářské práce (Šteslová 2010). Tyto kmeny jsou dále v textu značeny karb c 1 res, karb c 1/10 res, karb c 1/100 res a karb c 1/1000 res, tyto zkratky označují koncentraci karb, na které byla rezistence odvozena. Izoláty karb c 1 res a karb c 1/10 res se lišily oproti wt změněnou morfologií (obr. 1). Výchozí koncentrace c 1 činila 1 g l -1 PDA média, toto množství karb bylo do média vneseno rozpuštěné v 10 ml roztoku s 96% ethanolem. Pro další koncentrace byl ethanolový roztok s karb postupně dekadicky ředěn tak, aby do všech médií byl vnášen vždy stejný objem (10 ml l -1 ) roztoku karb v ethanolu. Stejný objem ethanolu byl přidán i do kontrolní varianty. Experiment byl založen 18. listopadu 2010, kdy jednotlivé Petriho misky byly zaočkovány příslušnými kmeny izolátu 2006/7. K zaočkování byly použity kolonie narostlé v rámci 1. experimentu mé bakalářské práce, tedy 273 dny staré. Uspořádání experimentu 1 bylo faktoriální (5 kmenů OM houby 5 variant PDA média dle koncentrace karb). Jednotlivé varianty byly připraveny ve čtyřech opakováních a hodnoceny ve 14denním intervalu po dobu 98 dní. Cílem tohoto experimentu bylo (1) ověřit, zda postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s karb v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem karb; (2) zjistit, zda kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace karb v PDA, je či není rezistentní i vůči vyšším koncentracím karb. 2.5 Experiment 2 V tomto experimentu jsem testovala efekt různé koncentrace karb v PDA médiu na růst 4 typů kmenů izolátu 2006/7 (obr. 2), získaných v rámci experimentu 1 této diplomové práce. Prvním kmenem byl izolát karb c 1 res, přepasážovaný v rámci experimentu 1 mé diplomové práce na kontrolní PDA médium bez karb (ovšem s přídavkem 10 ml 96% etanolu na litr média), přičemž po 106 dnech růstu na tomto médiu měla narostlá kolonie morfotyp karb c 1 res; v dalším textu je tento kmen značen jako karb c 1 res (PDA) karb c 1 res (zkratka 23

24 MATERIÁL A METODY v závorce udává použitý typ média). Tři zbylé kmeny použité v tomto experimentu lze analogicky označit jako karb c 1 res (PDA) wt karb c 1 res (karb c 1 ) karb c 1 res wt (PDA) wt (obr. 2). Výchozí koncentrace karb byla 1 g l -1 PDA média, toto množství bylo do média vneseno v 10 ml 96% ethanolu; nižší koncentrace byly opět získány postupnými dekadickými ředěními. Experiment 2 byl založen 4. března 2011, jeho uspořádání bylo faktoriální (4 kmeny OM houby 5 variant PDA média dle koncentrace karb). Jednotlivé varianty byly připraveny ve čtyřech opakováních a hodnoceny byly ve 14denním intervalu po dobu 56 dní. Cílem tohoto experimentu bylo ověřit, že nárůst izolátu 2006/7 morfotypu wt na médiu PDA bez karb z původního karb c 1 res kmene, tedy scénář karb c 1 res (PDA) wt, odpovídá znovuzískané citlivosti na karb. Obrázek 1: Morfologie tří kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.), původního (a) a dvou rezistentních vůči karbendazimu (a,b), odvozených v rámci v mé bakalářské práce (Šteslová 2010) na PDA médiu s karbendazimem o koncentraci 100 mg l -1 (b) nebo 1 g l -1 (c) a použité k zaočkování experimentu 1. 24

25 MATERIÁL A METODY Obrázek 2: Morfologie mycelia kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.), použité k zaočkování experimentu 2. Kmen rezistentní vůči karbendazimu (karb) o koncentraci 1 g l-1 po 105 dnech od přeočkování na PDA médium bez karb v rámci experimentu 1 částečně (a) nebo téměř úplně (b) přerostl morfotypem téže houby bez získané rezistence. K zaočkování 1. a 2. varianty experimentu 2 byly použity pouze oblasti označené symbolem * (a,b). K zaočkovaní třetí varianty bylo použito mycelium kmene rezistentního ke karb o koncentraci 1 g l-1 a udržované na PDA médiu s týmž obsahem karb (c), k zaočkování čtvrté varianty bylo využito mycelium kmene bez získané rezistence, udržované pouze na PDA médiu bez karb (d). 2.6 Experiment 3 V experimentu 3 jsem testovala efekt prop na růst izolátu 2006/7 wt a dvou kmenů téhož izolátu, rezistentních vůči prop, odvozených v rámci v mé bakalářské práce (Šteslová 2010). Kmeny jsou dále vedeny pod označením prop c1/100 res a prop c1/1000 res, tyto zkratky označují koncentraci prop, na které byla rezistence odvozena.výchozí koncentrace fungicidu Tilt byla 0,5 ml l-1 PDA média, což odpovídá 0,125 g prop na litr PDA média. Toto množství bylo vneseno do média jako roztok s čistým acetonem v poměru 1:1 (vol/vol). Nižší koncentrace prop byly ředěny pomocí acetonu a vnášeny do jednoho litru PDA média v množství 1 ml dané směsi. Kontrolní varianta obsahovala 1 ml acetonu na 1 litr PDA média. K přípravě 25

26 MATERIÁL A METODY inokula byly použity kolonie z 2. experimentu mé bakalářské práce, které byly dne , tj. po 278 dnech, přepasážovány na čerstvé médium s příslušným obsahem prop. Po 49 dnech růstu byly tyto aktivně rostoucí kolonie dne 10. února 2011 využity k zaočkování tohoto experimentu. Uspořádání experimentu 3 bylo faktoriální (3 kmeny OM houby 5 variant PDA média dle koncentrace prop). Jednotlivé varianty byly připraveny ve čtyřech opakováních a hodnoceny byly poprvé po 7 dnech od zaočkování, následně ve 14denním intervalu po dobu celkově 77 dní. Cílem tohoto experimentu bylo (1) ověřit, zda postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s prop v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem prop; (2) zjistit, zda kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace prop v PDA, je či není rezistentní i vůči vyšším koncentracím prop. 2.7 Experiment 4 V experimentu 4 jsem sledovala růst kmenů karb c 1 res a wt izolátu 2006/7 na médiích s koncentrační řadou prop. Výchozí koncentrace přípravku Tilt byla 0,5 ml l -1 PDA média. Toto množství bylo do média vneseno s čistým acetonem v poměru 1:1 (vol/vol). Dekadická ředění byla připravena stejně jako v experimentu 3. Kontrolní varianta obsahovala 1 ml acetonu na 1 litr PDA média. K zaočkování experimentu byly použity aktivně rostoucí kolonie na příslušných PDA médiích. Experiment byl založen 10. února Jednotlivé varianty byly připraveny v pěti opakováních a hodnoceny ve 14denním intervalu po dobu 70 dnů. Cílem tohoto experimentu bylo ověřit, zda kmeny karb c 1 res a wt izolátu 2006/7 se navzájem liší svojí senzitivitou vůči prop. Tento experiment simuluje sekvenční aplikaci fungicidů. 2.8 Experiment 5 V tomto experimentu jsem testovala simultánní aplikaci karb a prop. Oba fungcicidy byly použity v c 1/100 koncentraci. Byly připraveny čtyři varianty média, první varianta obsahovala karb i prop (K+P+), druhá varianta obsahovala pouze karb (K+P ), třetí pouze prop (K P+) a čtvrtá byla bez fungicidů (K P ). Všechny varianty byly připraveny tak, aby obsahovaly stejné množství rozpouštědel (1 ml acetonu a 10 ml 96% ethanolu na jeden litr média). Jednotlivé Petriho misky byly zaočkovány izoláty houby 2006/7, 2007/4 a 2010/26. 26

27 MATERIÁL A METODY Experiment byl založen 30. ledna Jednotlivé varianty byly připraveny v deseti opakováních a hodnoceny byly poprvé po 7 dnech od zaočkování, následně ve 14denním intervalu po dobu celkově 77 dní. Cílem experimentu bylo ověřit možný synergistický efekt simultánní aplikace karb a prop na dané izoláty hub. 2.9 Experiment 6 Tento experiment měl stejný design, použité organismy i cíle jako experiment 5. Na rozdíl od něj byly karb i prop použity v koncentraci c 1/1000. Experiment byl založen 29. března 2012, jednotlivé varianty byly hodnoceny ve dvou 14denních intervalech Hodnocení růstu kolonií V týdenním nebo 14denním intervalu jsem jednotlivé Petriho misky fotografovala digitálním fotoaparátem Olympus C-5050 v rozlišení 5 Mpx. Pořízené fotografie jsem podrobila analýze obrazu: nejprve jsem pomocí programu Corel Paint Shop Pro X2 (Corel Corporation, Ottawa, Kanada) provedla prahování jednotlivých fotografií na základě lokálních maxim RGB hodnot. Plochu mycelia jsem v takto připraveném binárním obrazu analyzovala v programu Image Tool verze 3 (University of Texas, USA) Statistická analýza dat Rozdíly v účinnosti jednotlivých fungicidních ošetření na testované kmeny/izoláty byly hodnoceny dvoucestnou analýzou rozptylu. Homogenita rozptylů byla testována kombinovaným Hartley-Cochran-Bartlettovým testem, normalita reziduí byla hodnocena vizuálně pomocí grafu shody s normálním rozložením. V případě potřeby byla data před vlastní analýzou rozptylu transformována odmocninnou transformací. Rozdíly mezi jednotlivými průměry byly testovány Scheffeho 0,05 testem. Data jsou prezentována ve formě průměr ± směrodatná odchylka. Pro výpočty byl použit software Statistica 9 (StatSoft, Tulsa, USA). 27

28 VÝSLEDKY 3 Výsledky 3.1 Experiment 1 V tomto experimentu jsem chtěla (1) ověřit, zda postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s karb v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem karb; (2) zjistit, zda kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace karb v PDA, je či není rezistentní i vůči vyšším koncentracím karb. Růst jednotlivých kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) se získanou rezistencí ke karb, odvozenou v rámci mé bakalářské práce na PDA médiích s karb o koncentraci 1 g l -1 (karb c 1 res), 100 mg l -1 (karb c 1/10 res), 10 mg l -1 (karb c 1/100 res) a 1 mg l -1 (karb c 1/1000 res), popřípadě izolátu původního bez získané rezistence (wt), na nových PDA médiích s karb o koncentracích 0 (k) až 1 g l -1 (c 1 ), se nápadně lišil (obr. 4). Růst kmenů karb c 1 res a karb c 1/10 res (obr. 4 a,b) byl velmi podobný, po 98 dnech růstu činila velikost kolonie kmene karb c 1 res rostoucího na c 1 médiu 65 % velikosti kolonie na k médiu, případě karb c /10 res kmene činila tatáž hodnota 72 %. Velikost mycelií kmene karb c /10 res na c 1/10 médiu se po 98 dnech statisticky průkazně nelišila od velikosti na c 1 médiu (post-hoc Scheffého 0,05 test, tab. 1). Tentýž závěr lze učinit i pro růst kmene karb c /100 res, u nějž rozdíly v růstu na médiích c 1, c 1/10 a c 1/100 nebyly statisticky průkazné, přestože na médiu c 1 byla velikost mycelií přibližně dvoutřetinová oproti velikosti na c 1/100 médiu (tab. 1, obr. 4 c); vzhledem ke malému počtu opakování (n = 4) je však možné, že s větším rozsahem experimentu by tyto rozdíly byly průkazné. Obecně lze ovšem na základě mých dat konstatovat, že kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace karb v PDA, je rezistentní i vůči vyšším koncentracím karb, které navíc ani neinhibují rychlost jeho růstu. Zvýšený růst kmenů karb c 1 res a karb c 1/10 res na k médiu od přibližně 56 dne kultivace (obr. 4 a,b) byl způsoben postupným nárůstem mycelia morfotypu wt, který postupně začal přerůstat původní morfotyp rezistentních kmenů a jehož rychlost růstu byla vyšší (obr. 3). Rovněž růst kmenů karb c 1/1000 res a wt byl velmi podobný (obr. 4 d,e). Oba tyto kmeny byly schopny velmi dobrého růstu na k médiu, kdy jimi vytvářená mycelia byla přibližně o polovinu větší než mycelia vytvářená na k médiu kmeny karb c 1 res, karb c 1/10 res a karb c 1/100 res. Na všech Petriho miskách s PDA obsahujícím jakékoli množství přidaného karb nebyly oba tyto izoláty schopny růstu, s výjimkou jediného opakování (z celkového počtu 32), kdy u wt kmene na médiu c 1/10 se odvodil nový rezistentní kmen. Lze tedy 28

29 VÝSLEDKY konstatovat, že postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s karb v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem karb, ale že došlo ke vzniku rezistence vůči danému fungicidu. Tabulka 1: Plocha mycelia izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) s rezistencí ke karbendazimu odvozenou na médiích o koncentraci 1 g l-1 (karb c1 res), 100 mg l-1 (karb c1/10 res), 10 mg l-1 (karb c1/100 res) a 1 mg karbendazimu na 1 litr média (karb c1/1000 res), popřípadě izolátu původního bez získané rezistence (wt), na PDA médiu s karbendazimem o koncentracích 0 (k, kontrola) až 1 g l-1 (c1). Hodnoceno po 98 dnech růstu. Data představují průměry ze 4 opakování ± SD, průměry označené v rámci jednotlivých sloupců stejným písmenem se statisticky průkazně neliší (Scheffé0,05 test). 2 Plocha mycelia kmene izolátu 2006/7 (mm ) Médium karb c1/10 res 1810 ± 231 b 1461 ± 153 ab karb c1/100 res 2027 ± 214 b c1/1 000 karb c1 res 1906 ± 446 b 1317 ± 122 ab 1600 ± 252 b 0± 0a 0± 0a c1/ ± 81 ab 1404 ± 133 a 1027 ± 97 a 0± 0a 0± 0a c1/ ± 108 a 1474 ± 89 ab 961 ± 102 a 0± 0a 0± 0a c ± 188 a 1298 ± 48 a 710 ± 261 a k karb c1/1000 res 2794 ± 213 b 15 ± 30 a wt 3228 ± 256 b 15 ± 30 a Obrázek 3: Mycelium karb c1 res kmene houby Epulorhiza sp. (izolát 2006/7) po 98 dnech růstu na PDA médiu bez přidaného karbendazimu. Původní morfotyp karb c1 res kmene (#) byl od přibližně 56 dne kultivace postupně přerůstán wt morfotypem (*). 29

30 VÝSLEDKY Obrázek 4: Časový průběh růstu čtyř kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) s rezistencí ke karbendazimu odvozenou na médiích o koncentraci 1 g l -1 (a), 100 mg l -1 (b), 10 mg l -1 (c) a 1 mg karbendazimu na 1 litr média (d), popřípadě izolátu původního bez získané rezistence (e), po přeočkování na nová PDA média s karbendazimem o koncentracích 0 (k, kontrola) až 1 g l -1 (c 1 ). n = Experiment 2 V experimentu 2 jsem chtěla ověřit, jestli nárůst izolátu 2006/7 morfotypu wt na médiu PDA bez karb z původního karb c 1 res kmene, tedy scénář karb c 1 res (PDA) wt, odpovídá znovuzískané citlivosti na karb. Růst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.), kmenů karb c 1 res (PDA) karb c 1 res a karb c 1 res (c 1 ) karb c 1 res (obr. 5a,c) byl s výjimkou zvýšeného růstu kmene karb c 1 res (PDA) karb c 1 res na k médiu velmi podobný. Tento výsledek potvrzují výsledky 30