Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Molekulární biologie a biochemie organismů

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Molekulární biologie a biochemie organismů Petra Schiebertová Nukleace aktinu v rostlinných buňkách Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Kateřina Schwarzerová Ph.D. Praha,

2 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracoval/a samostatně a že jsem uvedl/a všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, Podpis 2

3 Poděkování Ráda bych na úvod poděkovala svojí školitelce RNDr. Kateřině Schwarzerové Ph.D. za cenné rady při hledání studijních materiálů, trpělivost a přátelský přístup. 3

4 Abstrakt Schopnost rostlinných buněk nukleovat aktin je důležitá hlavně pro dynamiku vnitrobuněčných pohybů organel a váčků, organizaci buněčné stavby a růstu a koordinaci endo- a exocytosy. Nukelace aktinu znamená vytváření nového aktinového vlákna z G-aktinu. K tomu slouží rostlinné buňce proteiny asociované s aktinem - Arp2/3 proteinový komplex a proteiny z rodiny forminů. Arp2/3 komplex polymeruje nové dceřiné vlákno z boku vlákna mateřského v úhlu 70 stupňů a po nukleaci zůstává na mínus konci filamenta, tedy rozvětvuje již stávájící vlákna. Nukleace aktinu pomocí Arp2/3 komplexu je regulována proteiny podporující nukleaci NPFs. Delece podjednotek Arp2/3 komplexu je pro živočišné buňky často letální, u rostlin delece podjednotek vyvolává spíše mírné fenotypové projevy. Forminy katalyzují vznik přímých aktinových vláken a zůstávají na plus konci vlákna i po nukleaci. U rostlin existuje více isoforem pro formin než u živočichů, což naznačuje jejich významnou roli v rostlinných buňkách. Cobl, Lmod, Spire, JMY a APC jsou nové nukleátory aktinu objevené u živočichů využívající WH2 (WASP homology 2) doménu, avšak u rostlin tento typ nukleace není popsán. Klíčová slova: Aktin, Arp2/3 komplex, forminy, Scar/WAVE, Cobl, Lmod, Spire 4

5 Abstract The ability of plant cells to nucleate actin is important especially for dynamic of intracellular movements of organelles and vesicles, cell structure and growth organization and coordination of endo- and exocytosis. Actin nucleation means the development of new actin filaments from G-actin. Actin associated proteins - Arp2/3 complex and formins serve for this purpose. Arp2/3 complex polymerizes new "daughter " filament from the side of the "parent" filament at an angle of 70 degrees and after the nucleation remains at minus end of filaments, thus inducing branching of filaments. Nucleation by Arp2/3 complex further requires nucleation promoting factors - NPFs. Deletion of subunits of Arp2/3 complex is often lethal in animal cells. On the other hand, deletion results in rather mild phenotype in plants. Formins catalyze the formation of direct actin fibers and remain on the plus end of the fiber after nucleation. There are multiple isoforms of formins in plants than in animals, which suggest an important role of formins in plants. New actin nucleators Cobl, Lmod, Spire, JMY and APC containing WH2 (WASP homology 2) domain were identified in non-plant cells. This type of actin nucleation was not described in plants. Kew words: Actin, Arp2/3 complex, formins, Scar/WAVE, Cobl, Lmod, Spire 5

6 OBSAH 1. Úvod Aktin Proteiny asociované s aktinem Arp2/3 komplex 4.1. stavba Arp2/3 komplexu nukleace aktinu Arp2/3 komplexem regulace nukleace aktinu Arp2/3 komplexem Forminy 5.1. stavba a rozdělení forminů forminy a jejich funkce Nové typy nukleace u živočichů 6.1. Spire Cobl Lmod JMY APC Závěrečné shrnutí Literatura

7 Seznam zkratek MFs mikrofilamenta G-aktin globulární aktin, aktinový monomer F-aktin aktin ve vláknech ARPs aktin-asociované proteiny ADF aktin depolymerizační factor CAP s cyklázou spojený protein AIP1 aktin interagující protein 1 NPFs proteiny podporující nukleaci ROPs Rho proteiny rostlin SCAR supresor receptoru cyklického adenosin mono fosfátu SHD SCAR homologní doména WASP Wiskott Aldrich syndrome protein WAVE WASP family verprolin homologní protein WH2 doména WASP homologní doména 2 VCA verprolin homologní-centrální-kyselá doména HSPC300 hematopoetický kmenový/progenitorový buněčný protein BRICK1 rostlinná HSPC300, remodulace cytoskeletu přes SCAR SRA1 steroidní receptor RNA aktivátor 1 NAP1 nucleosom spojovací protein-1 ABI abelson interagující protein GEF guanine nucleotide exchange factor FH1 formin homologní 1 doména FH2 formin homologní 2 doména DID autoinhibiční doména mdia1 DAD autoregulační doména mdia1 Sp signální polypeptid Arabidopsis TM transmembránová doména CC coiled-coil doména JMY multifunkční aktin nukleující faktor Cobl Cordon bleu Lmod Leiomodin APC adenomatous polyposis coli 7

8 1. Úvod Ačkoliv rostliny jsou samy o sobě nepohyblivé, mnoho procesů, které provádějí, jsou velmi dynamické. Buněčné dělení, morfogeneze, buněčné odpovědi na fytohormony, nebo na útok patogenů indukují kaskády reakcí, které jsou často spojeny s činností cytoskeletu. Cytoskeletální složky - mikrotubuly a mikrofilamenta jsou dlouho známé jako hráči hlavní role v přeměně chemické energie na mechanickou sílu. Pro mnoho buněčných funkcí je cytoskelet využíván jako pasivní lešení pro molekulární motory myosin nebo rodinu kinesin/dynein, ale pro mnoho dalších dějů je sám výkonnou jednotkou. U eukaryot hraje aktinový cytoskelet stěžejní roli v mnoha procesech, hlavně v buněčném růstu, morfogenezi a u živočišných buněk a některých prvoků v jejich pohybu. Aktinová filamenta v rostlinách se podílejí hlavně na dynamice vnitrobuněčných pohybů organel a váčků, koordinují endo- a exocytósu a organisují buněčnou stavbu a růst. Reorganizace aktinového cytoskeletu reaguje přímo na širokou škálu interních i externích stimulů, je to velmi rychlý a dynamický proces, umožňující buňce okamžitou odpověď na podměty. Porozumění aktinové dynamice v rostlinných buňkách vyžaduje znalost signalizace, aktinové depolymerizace, spojování aktinových vláken do sítí, svazků a neposlední řadě znalost mechanismů, kterými vznikají nová aktinová filamenta (Vantard a Blanchoin 2002). Buňky potřebují nukleátory aktinu, aby mohly zprostředkovat de novo uspořádání aktinových filament a elongační faktory, aby mohly kontrolovat poměr a rozsah polymerace. Nukleační faktory, které byly do tohoto data objeveny u rostlin, zahrnují Arp2/3 komplex a forminy. Nově objevené nukleátory, které jsou zatím známé jen u živočichů, jsou Spire, Cobl, Lmod, JMY a APC. Předchozí modely předjímaly, že rozdílné nukleátory pracují nezávisle na sobě ve vytváření aktinové sítě. Předpokládalo se, že sedm podjednotek Arp2/3 komplexu spolu s forminy představují dva hlavní separované nukleační faktory aktinového cytoskeletu (Finka et al. 2008). Novější znalosti ale ukazují na to, že konstrukce většiny buněčných aktinových vláken závisí na aktivitě většiny nukleujících a podpůrných faktorů, které pracují provázaně v jednom celku (Chesarone a Goode 2009). Jaké jsou vlastnosti obecně přijímaného aktinového nukleátoru? Spontánní nukleace aktinových filament je velmi náročná, protože potřebuje ke své aktivaci velmi nestabilní aktinové dimery a trimery. V principu aktinový nukleátor může použít jeden ze tří mechanismů k překonání této bariéry. Za prvé je to strukturní napodobení polymerizačních začátků, za druhé stabilizace spontánně 8

9 vzniklých dimerů a trimerů a za třetí aktivní "sběr" a uspořádání aktinových monomerů do formy polymerizačních začátků. Nukleátory, které vám teď představím, využívají všech tří předchozích vlastností. První nukleátor, který byl objeven Arp2/3 komplex, využívá napodobování polymeračních začátků. Když jsou přítomny nukleaci podporující faktory (nucleation promoting factors, NPFs), Arp2/3 komplex zprostředkovává de novo nukleaci - nového - dceřiného vlákna ze stran mateřského filamenta a to v typickém úhlu 70 stupňů a větví aktinovou síť. Nejhojnější NPFs regulující aktivitu Arp2/3 komplexu jsou Scar/WAVE proteiny, které mají alespoň dvě základní role při nukleaci. Za prvé spouštějí konformační změny v Arp2/3 komplexu, které se přenášejí na Arp2 a Arp3 podjednotky, které tvoří jakoby aktinový dimer a tím tvoří základnu pro růst nového filamenta. Za druhé přinášejí a váží k Arp2/3 komplexu aktinové monomery, což je důležitý krok při nukleaci pomocí Arp2/3 komplexu, protože ten sám váže aktinové monomery jen velmi slabě (Goley a Welch 2006, Pollard 2007). Další skupina nukleátorů jsou forminy, které katalyzují vznik přímých (nevětvících se) aktinových vláken a formují různé aktinové struktury v buňce (Faix a Grosse 2006, Goode a Eck 2007). Mechanismus aktinového uspořádávání pomocí forminů zahrnuje vysokou vázající afinitu jejich FH2 domény k plus konci aktinového filamenta. FH2 doména postrádá afinitu k aktinovým monomerům a tak se zdá, že mechanismem nukelace pomocí forminů je stabilizace náhodně vzniklých aktinových dimerů a trimerů (Pring et al. 2003). V kontrastu k Arp2/3 komplexu, který zůstává spojen s mínus koncem, jak nové vlákno roste, formin FH2 doména se udržuje na plus konci vlákna i po nukleaci a umožňuje rychlé vkládání dalších aktinových podjednotek. V poslední době byly u živočichů objevené nové nukleátory aktinu - Spire, Cordon bleu (Cobl), Leiomodin (Lmod), JMY a APC (Chesarone a Goode 2009, Firat-Karalar a Welch 2011). Tyto nukleátory zatím nebyly objeveny u rostlin. 9

10 2. Aktin Aktin je jedna z nejhojnějších intracelulárních bílkovin eukaryotických buněk. Tvoří kolem 5% celkových buněčných proteinů a její struktura je vysoce konzervativní. Je to globulární polypeptid vázající ATP. Jeho molekulární hmotnost je 43 kda a je tvořený přibližně 375 aminokyselinami (Staiger a Blanchoin 2006). Polymerací monomerního aktinu aktivovaného navázáním ATP vznikají vlákna - mikrofilamenta, která mají 7-9 nm v průměru a podobají se dvěma řetízkům perel, jež se navzájem obtáčí. Aktinová mikrofilamenta (MFs) jsou nejtenčí složkou cytoskeletu a mohou být dlouhá až několik µm. Aktin existuje v cytoplazmě eukaryotických buněk buď jako rozpustný monomerní protein (G-aktin) nebo ve formě vláken (F-aktin). Rovnováha mezi F-aktinem a G-aktinem, tedy vznik a zánik aktinových vláken, je ve velkém rozsahu kontrolována proteiny, jež regulují schopnost G-aktinu polymerovat či F-aktinu tvořit svazky. Toto ovlivňuje poměr mezi polymerizací aktinových vláken (především na plus či roztřepeném konci) a depolymerizací vláken (především na mínus či zašpičatělém konci). Tvorba a rozklad mikrofilament je u rostlin velmi dynamický proces (Staiger et al. 2009). Aktin je pozoruhodně konzervovaný protein, s celkovou shodou okolo 85% mezi členy své proteinové rodiny. Nicméně většina druhů vlastní více aktinových isoforem, lišících se jak strukturně, tak funkčně. Počet genů pro aktin v jednom genomu má rozpětí od 1 (v kvasince) po téměř 100 (v některých rostlinách) (Rivero a Cvrckova 2007). Dictyostelium discoideum má 27 genů pro aktin, A. thaliana genom obsahuje 10 genů pro aktin a alespoň 8 je aktivních (Cvrckova, Rivero a Bavlnka 2004). Vzdálený, ale dobře doložený homolog aktinu v prokaryotických buňkách bakterií je protein MreB, který také vytváří v buňce vlákna (Rivero a Cvrckova 2007). Pozoruhodný rozdíl mezi rostlinnými, kvasinkovými i savčími buňkami je vysoký poměr mezi globulárním a F-aktinem. Měření u kukuřice a pylu z Papaver rhoeas prokázalo, že pouze 5-10% z celkového výskytu aktinu v buňce je přítomno ve formě aktinových vláken a data naměřená ze suspenze buněk tabáku ukazují ještě překvapivěji, že ve formě vlákna je zde pouze 1-2% aktinu. Pro srovnání - u pučící kvasinky se předpokládá, že většinu svého aktinu v buňce má ve formě vláken (Staiger a Blanchoin 2006). Tyto informace naznačují, že dynamika rostlinných aktinových vláken je pozoruhodná a že proteiny, které ji řídí, si zaslouží naši další pozornost. 10

11 Dynamika aktinu Reorganizace aktinové sítě je závislá na dvou nejzřetelnějších mechanismech, které se dějí ve stejný čas. Je to rychlá a na více místech probíhající tvorba nových aktinových filament a zároveň zkracování nebo fragmentace existujících. Tento způsob rychlé reorganizace aktinu byl popsán jako stochastická dynamika (Staiger et al. 2009). Pozorováním reorganizace aktinu v různých typech rostlinných buněk bylo také nedávno zjištěno, že aktinová síť se mění s periodicitou cca 70 sekund (Smertenko, Deeks a Hussey 2010). Co se stane s fragmenty, a jak jsou jejich podjednotky navráceny zpět do zásoby stavebních aktinových monomerů buňky? To zatím zůstává neobjasněno, protože mohou být pozorovány pouze velmi krátkou dobu, než nám zmizí ze zorného pole. V této práci se zaměřím právě na tvorbu nových filament z těchto aktinových monomerů - na nukleaci. Nukleace aktinu Nukleace aktinu znamená vytváření nového aktinového vlákna z G-aktinu. Může nastat spontánně při vysoké koncentraci G-aktinu, ale většinou, navzdory vysoké koncentraci G-aktinu v buňkách, spontánní nukleace neprobíhá. Proti spontánní nukleaci je G-actin chráněn například profilinem nebo CAP (Tabulka 1). Chaotická spontánní nukleace aktinových vláken je v buňce in vivo skoro nepozorovaná, jak je tedy umožněna nukleace? Za tímto účelem má buňka specializované proteiny polymerizující aktin, které hrají zásadní roli na procesu růstu a vývoji rostliny závislém na aktinu, a k nimž se řadí Arp2/3 komplex a forminy (Hussey, Ketelaar a Deeks 2006). 11

12 3. Proteiny asociované s aktinem Rostliny jsou unikátně adaptovány na rychlé odpovědi životnímu prostředí. Mnoho signálů vyúsťuje v dramatické změny buněčného tvaru a organizace cytoplasmy, které jsou závislé na aktinovém cytoskeletu. Dynamická povaha aktinového cytoskeletu je charakteristická a umožněná širokou rozmanitostí proteinů asociovaných s aktinem. Vybrané proteiny asociované s aktinem shrnuji spolu s jejich hlavními funkcemi do Tabulky 1 (Hussey et al. 2006, Staiger a Blanchoin 2006). jméno funkce vazba G-aktinu, vyvazuje aktin, zabránění spontánní nukleace profilin udržuje v cytosolu fond ATP-aktinu, který může být použit pro rychlé prodloužení plus konce vlákna fragmentace vláken, depolymerizace z mínus konce vlákna ADF/Cofilin Cofilin zvyšuje helikální vynutí vláken, které může vést k jejich destabilizaci, selektivně se váže na ADP F-aktin AIP1 podpora aktivity ADF nukleace aktinu, nukleace aktinu ze stran stávajících filament Arp2/3 komplex - větvení aktinové sítě nukleace aktinu, nevětví aktinovou síť, Formin zesíťování vyvazuje aktin, brání polymerizaci aktinu, indukuje CAP depolymerizaci Fimbrin/Villin zesíťování aktinových filament Capping proteins inhibice elongace na plus konci filament, regulace jejich délky Tabulka 1: proteiny asociované s aktinem 12

13 4. Arp 2/3 komplex 4.1. Stavba Arp2/3 komplexu Arp2/3 proteinový komplex má velikost 220 kda. Je to strukturálně unikátní komplex tvořený sedmi rozdílnými polypeptidy s afinitou k sobě navzájem. Těchto sedm podjednotek je velkých v rozsahu od 16 do přibližně 50 kda a jejich sekvence a funkce je konzervovaná u většiny organismů. Dvě největší podjednotky, proteiny asociované s aktinem - Actin related protein 2 (Arp2) a Actin related protein 3 (Arp3), daly komplexu jméno (Hussey et al. 2006, Borths a Welch 2002). Arp2/3 komplex tvoří sedm podjednotek [Arp2, Arp3,ArpC1/p41, ArpC2/p31, ArpC3/p21, ArpC4/p20 a ArpC5/p16 (Higgs a Pollard 2001)]. V rostlinách existují homology pro všechny podjednotky Arp2/3 komplexu (Mathur et al. 2003). Podjednotky z Arp2/3 komplexu z Arabidopsis thaliana dokáží funkčně zastoupit v kvasinkách dané podjednotky Arp2/3 komplexu a naopak, v rostlinných mutantech postrádajících Arp2/3 komplex fungují komplexy sestavené ze savčích podjednotek Arp2/3 komplexu (Hussey et al. 2006). Funkční Arp2/3 komplex je životně důležitý pro kvasinku, pro kterou je delece více podjednotek letální (Winter, Choe a Li 1999). Stejně zásadní je pro C. Elegans (Sawa et al. 2003), a Drosophilu (Hudson a Cooley 2002). V savčích buňkách a u prvoků vede inhibice Arp2/3 komplexu k zastavení buněčného růstu (Hussey et al. 2006). V protikladu k tomu u rostlin zaznamenáme pouze jemné vývojové chyby u některých orgánů v případě, že některé podjednotky nejsou translatovány (Hussey et al. 2006). Toto ukazuje na méně výraznou roli Arp2/3 komplexu v biochemii nukleace aktinu u rostlin, než u jiných eukaryotických organismů. U Arabidopsis homozygoti s mutací postrádající geny pro Arp2, Arp3, ArpC5 nebo jednu ze dvou izoforem pro ArpC2 jsou životaschopní a fertilní, ačkoli vykazují zřetelný mutantní fenotyp pokroucených trichomů a pokřivených epidermálních buněk. Možná je to tím, že většinu úkolů pro Arp2/3 komplex v rostlinných buňkách mohou převzít forminy, o kterých se v mé práci zmíním dále (Rivero a Cvrckova 2007, Mathur 2005). 13

14 4.2. Nukleace aktinu Arp2/3 komplexem Na základě prostorového modelování bylo předpovězeno, že Arp2 a Arp3 váží ATP, stejně jako ho váže aktin. Navíc bylo pro tyto dvě podjednotky zjištěno, že tvoří dimer podobný dimeru, jaký tvoří dva G-aktiny a který samostatné aktinové monomery potřebují k navázání a utvoření začátku aktinového vlákna a jeho rychlé elongaci. Je faktem, že Arp2/3 komplex sám o sobě má nízkou schopnost nukleace aktinu, ale může být aktivován k rychlé nukleaci a tvorbě aktinových polymerů třídou proteinů, které podporují nukleaci (NPFs nucleating promoting factors). NPFs kontrolují, kdy a kde v buňce dojde k nukleaci aktinu pomocí ARP2/3 komplexu a vzniknou nová aktinová vlákna. Aktivita Arp2/3 komplexu spolu s NPFs je dále podporována vazbou k již vzniklému aktinovému filamentu (Borths a Welch 2002). Podjednotky Arp2 a Arp3 se nastaví tak, že Arp2 zaujímá konformaci jako plus konec aktinového vlákna a umožňují tak nasednutí aktinových monomerů (Robinson et al. 2001). Navázání ATP a poté jeho hydrolýza je nutná pro plnou aktivaci Arp2/3 komplexu, proto podjednotky Arp2 a Arp3 váží ATP blízko jejich aktin vazebných míst pro aktin, jako součást aktivačního procesu nukleace. Obecná rychlost ATP hydrolýzy Arp2/3 komplexem je velmi pomalá a není stimulovaná NPFs (Dayel, Holleran a Mullins 2001, Le Clainche et al. 2001). To naznačuje, že ATP hydrolýza nastává teprve po navázání Arp2/3 komplexu spolu s NPFs k mateřskému filamentu. Aktivovaný Arp2/3 komplex podporuje nukelaci aktinu na plus (roztřepeném) konci a zároveň omezuje nukleaci na mínus (zašpičatělém) konci filamenta, jako mínus konec totiž slouží samotný Arp2/3 komplex. Komplex se sám o sobě přikládá z boku k již existujícím mateřským filamentům a zakládá nové, dceřiné aktinové vlákno, které se od mateřského vlákna odklání v úhlu 70 stupňů. Nukleuje tedy nová vlákna a zároveň rozvětvuje síť již existujících filament (obrázek 1), (Borths a Welch 2002). 14

15 Obrázek 1: Nukleace aktinu 1. Aktinový monomer se váže k NPFs a k neaktivnímu Arp2/3 komplexu. 2. Aktin, NPFs a Arp2/3 komplex se společně naváží ke straně aktinového filamenta a Arp2/3 komplex se aktivuje. 3. Aktinové monomery se rychle váží na templát plus konce, který představuje Arp2/3 komplex a nové aktinové vlákno roste. Převzato z: Borths a Welch (2002) Regulace nukleace aktinu Arp2/3 komplexem Nukleaci podporující proteiny (NPFs nucleating promoting factors) pro Arp2/3 komplex jsou představovány SCAR/WAVE komplexem (supresor receptoru cyklického adenosin mono fosfátu/ WASP family verprolin homologní protein), ten je regulován pomocí malých GTPáz specifických pro rostliny-rops. SCAR/WAVE komplex SCAR/WAVE proteiny opakovaně váží a aktivují Arp2/3 komplex (Obrázek 2: Aktivace Arp2/3 komplexu Scar/WAVE komplexem). U Arabidopsis thaliana bylo dosud nalezeno pět homologů WASP_Scar_WAVE proteinů (AtSCAR1-4 a At4g18600) a jeden byl popsán v kukuřici (ZmSCAR1) (Frank et al. 2004, Brembu et al. 2006). Sdílejí SCAR homologní doménu - SHD a kromě toho čtyři z nich i verprolin homologní centrální kyselou doménu - VCA, která aktivuje samotný Arp2/3 komplex (Frank et al. 2004). Při aktivaci VCA doména SCAR/WAVE komplexu kontaktuje Arp2/3 komplex principiálně skrze ARPC3 podjednotku (Eden et al. 2002). Také byla zjištěna funkční redundance mezi AtSCAR proteiny (Frank et al. 2004). 15

16 Rostlinné proteiny SCAR jsou rozdílné oproti svým živočišným homologům hlavně díky přítomnosti rostlině-specifických centrálních domén, které výrazně zvětšují vzdálenost mezi SHD N-koncem (který u rostlin váže protein HSPC300/BRICK1, který moduluje koncentraci SCAR komplexu) a VCA/WA C-koncem, který aktivuje Arp2/3 komplex. Tyto domény by mohly poskytnout nová vazebná místa právě pro Arp2/3 komplex, nebo povolit flexibilitu pro jiné SCAR/WAVE proteiny, které by pak mohly Arp2/3 komplex kontaktovat přímo (Uhrig et al. 2007). AtSCAR proteiny jsou nejzásadnější pro aktivaci Arp2/3 komplexu, fungují v komplexu s proteiny SRA1, NAP1, BRK1 a ABI proteinem. Tvoří tak celý SRA1-NAP1- BRK1/HSPC300-SCAR/WAVE komplex, jehož činnost je regulována ROPs. Genetická analýza funkční role každé podjednotky SCAR/WAVE komplexu je ztížena potenciální funkční redundancí mezi SCAR, ABI a ROP izoformami (Uhrig et al. 2007). In vitro ale bylo biochemicky dokázáno, že AtSCAR2 homolog může přímo kontaktovat a aktivovat Arp2/3 komplex (Eden et al. 2002). Spojení mezi AtSCAR proteiny a ROP GTPásami ROPs (Rho proteins of Plants) se nacházejí v rostlině všude tam, kde je potřeba rychlého a směrovaného růstu buněk, v kořenových vláscích, v buňkách pokožky listu a v pylových láčkách. Navíc jsou ROPs lokalizovány v rozvíjejících se buněčných přepážkách a mezi stěnami a Golgiho váčky a stejně tak se podílejí na endocytóze. ROPs homology u zvířat, prvoků a hub (RHOs, RACs a CDC42) jsou hlavními regulátory aktinového cytoskeletu (Hussey et al. 2006). ROPs mohou regulovat celý SCAR/WAVE komplex, ale zároveň některé homology AtSCAR proteinů, které jsou s nimi v přímém kontaktu. Například AtSCAR2-VCA má schopnost interagovat s ROP7 i ROP2. SPIKE1 je považován za protein, který by mohl být potenciálně dalším členem SRA1- NAP1-BRK1/HSPC300-SCAR/WAVE komplexu a zároveň ovlivňovat ROPs jako ROP- GEF. GEF (guanine nucleotide exchange factor) je součástí intracelulárních signalizačních sítí, podporuje v buňce výměnu GDP za GTP a vytváří tím aktivní formu proteinu, který je schopný rozpoznat proteiny, ke kterým se má navázat, nebo efektorové proteiny (Uhrig a Hulskamp 2006, Brembu et al. 2006). 16

17 Obrázek 2: Schéma aktivace Arp2/3 komplexu Scar/WAVE komplexem Převzato z: Zhang et al. (2005) 17

18 5. Forminy Další skupina nukleátorů jsou forminy, které katalyzují vznik přímých (nevětvících se) aktinových vláken a formují různé aktinové struktury v buňce (Faix a Grosse 2006, Goode a Eck 2007) Stavba a rozdělení forminů Kompletně osekvenovaný genom Arabidopsis thaliana odhalil přítomnost rozmanité mnohagenové rodiny formin-like sekvencí, zahrnující více než dvacet isoforem (Blanchoin a Staiger 2010). Je to zřetelně víc, než bylo objeveno u živočichů, například u savců bylo zjištěno pouze 15 isoforem forminu (Harris a Higgs 2006). Členové rodiny forminů jsou definováni přítomností formin homology-2 (FH2) domény. A právě na základě této definice, má rostlinný model Arabidospis thaliana alespoň 21 izoforem (Cvrckova et al. 2004). Každý z těchto proteinů také obsahuje na prolin bohatou doménu FH1,která se nachází vedle FH2 domény, někdy jsou odděleny variabilními sekvencemi (Obrázek 3: Stavba forminů). Funkce FH1 domény je vázat profilin a protože počet prolin-bohatých motivů napříč rostlinnými forminy je variabilní, lze z toho vyvodit rozdílnost v chování izoforem forminu, jejich rozdílnou afinitu pro prolin a variabilitu v rychlosti prodlužování vlákna (Blanchoin a Staiger 2010). Izoformy forminů u Arabidopsis jsou rozděleny do dvou fylogenetických tříd. Třída I je charakterizována signálním peptidem, kterým je na prolin bohatá, potenciálně glykosylovaná extracelulární doména. U všech forminů třídy I, až na výjimku AtFH7, je předpokládaná transmembránová doména na N-konci proteinu. O forminech patřících do třídy II zatím není mnoho informací. Nedávno se u forminového homologu 5 (FH5) ze skupiny II. objevila důležitá role při určování morfologie Oryza sativa (Zhang et al. 2011). Důležitý rozdíl týkající se organizace domén mezi rostlinnými a nerostlinnými forminy je nepřítomnost Rho GTP vázající domény -FH3 u rostlin. Nejlépe prozkoumané jsou některé forminy třídy I, AtFH1, AtFH4,AtFH5, AtFH7 a AtFH8 (Blanchoin a Staiger 2010). 18

19 Obrázek 3: Stavba forminů Organizace domén u klasického zástupce rostlinného forminu třídy I porovnaná s mdia typickým savčím forminem. Když nebudeme uvažovat FH1 a FH2 doménu, formin třídy Iz Arabidopsis nesdílí žádnou homologii s autoinhibiční doménou (DID), autoregulační doménou (DAD) a nemá CC doménu (predicted coiled-coil) mdia forminu. Forminy třídy I z Arabidopsis mají naproti tomu signální peptid (Sp) prolin bohatá, potenciálně glykosylovaná extracelulární doména a transmembránovou doménu (TM) na N-konci. Převzato z: Blanchoin a Staiger (2010) Forminy a jejich funkce Zatím zůstává obtížné vytvořit ucelený náhled aktivit a buněčných funkcí rostlinných forminů. Jedna z limitací pro sumarizování vlastností se týká obrovské variability v organizaci domén. Hledání homologů a určování podobnosti jednotlivých forminů vychází z předpokladu existence konzervovaných domén mimo FH1 a FH2 domény, ty však u rostlinných forminů nejsou a tak tuto metodu nelze využít. Druhý zásadní problém je nedostatek technologií zkoumajících dynamiku jednotlivých aktinových filament v živých rostlinných buňkách. Tato omezení nám extrémně snižují možnost ucelení vědomostí o forminech (Blanchoin a Staiger 2010). V genomu Arabidopsis je více než dvacet genů pro izoformy forminů, ale reverzní 19

20 genetika pro ně odhalila pouze několik biologických funkcí (Ingouff et al. 2005). Je to pravděpodobně způsobeno překrývající se expresí a funkční redundancí mezi nimi. Forminy představují skupinu proteinů, které nukleují aktin de novo a prodlužují aktinová filamenta na plus konci. Jako ostatní forminy, rostlinné forminy vykazují vazbu na plus konec F-aktinu, inhibují depolymerizaci vlákna z plus konce a částečně ho chrání před vazbou jiných proteinů, které by mohly růst zastavit. FH1 doména váže profilin-aktin a přináší je do blízkosti plus konce filamenta, FH2 doména nukleuje aktinová filamenta na plus konci filamenta. U živočichů jsme nejprve předpokládali, že alfa-šroubovicové FH2 domény dvou forminů tvoří unikátní "svázaný dimer", ve kterém jsou dvě podlouhlé aktin vázající hlavy svázané dohromady na obou koncích neobvyklou lasovitě spojující strukturou. Biochemická a krystalografická pozorování ukázala, že dimer je stabilní a zároveň flexibilní v segmentech spojujících dimery. Ačkoliv s plus koncem vlákna může interagovat každá polovina dimeru zvlášť, jenom stabilní neporušený dimer dvou forminů je schopen aktivní nukleace aktinových filament. Struktura svázaných dimerů dovoluje forminům efektivně se pohybovat a nukleovat na plus konci narůstajícího vlákna jako by kráčely po schodišti (Xu et al. 2004). V poslední době je ale na dimery forminů pohlíženo spíše jako na prstýnek z FH2 domén ležící na špičce plus konce aktinového filamenta ze kterého vyrůstají do stran FH1 domény (Firat-Karalar a Welch 2011). U rostlin jsou zobrazeny forminy při nukleaci také jako dimery ve tvaru prstýnku, ale popsanou nuklaci pomocí dimerů forminů jsem nenašla. Čtyři rostlinné forminy třídy I (AtFH1, AtFH4,AtFH5 a AtFH8) jsou schopny nukleovat aktin a umožňují prodlužování na plus konci filament (Tabulka 2). AtFH5 potřebuje FH1 i FH2 doménu, aby byl schopen nukleovat filamenta (Hussey et al. 2006). Rostlinné forminy se chovají procesivně zůstávají na plus konci prodlužujícího se filamenta. Nedávno byl však u rostlin objeven i neprocesivní formin AtFH1, který se po nukleaci z plus konce vlákna sklouzne na bok vlákna a pomocí FH1 a FH2 domény nukleuje další vlákno. U živočichů je známo víc neprocesivních forminů a k vazbě na bok filamenta jim stačí pouze FH2 doména. Síť aktinových filament je ve většině rostlin organizována ve svazky a kabely (Staiger 2000). Jak ukazují některé výzkumy kandidáty na iniciování a tvorbu těchto struktur jsou právě členové velké rodiny forminů. Mohou mít funkci ve svazkování a provazování aktinových vláken stejně jako proteiny fimbrin a villin (Michelot et al. 2006). 20

21 Tabulka 2: Funkce forminů třídy I u Arabidopsis thaliana Převzato z: Blanchoin a Staiger (2010). Vazba na membránu Rostliny postrádají zjevného ortologa integrinu. Integrin je označení pro skupinu membránových receptorů v živočišných buňkách, které se váží na extracelulární matrix či na jiné buňky. Umožňují tím přilnutí buněk k podkladu, účastní se některých signalizačních kaskád, při nichž se navázání ligandu na integrin přenáší do nitra buňky jako signál, který reguluje např. fosforylaci proteinů, genovou expresi, růst a smrt buněk atd., mohou vázat buněčnou stěnu s cytoskeletem. V rostlinných buňkách by mohla převzít některé role integrinu třída I forminů s membránově vázanou doménou a extracelulárním motivem, který se může vázat do buněčné stěny (Deeks et al. 2005). Cytokineze Existují důkazy, které naznačují, že další formin třídy I, AtFH5 hraje roli v průběhu rostlinného dělení. V buňkách exprimujících AtFH5 ve fúzi s GFP byl protein zaznamenán v rostoucí buněčné přepážce a v rostlině specifických membránových strukturách, které se účastní cytokineze. Signál GFP se však objevil pouze u mladých buněčných přepážek a po kontaktu mezi narůstající buněčnou přepážkou a mateřskou plasmatickou membránou rychle vymizel (Ingouff et al. 2005). 21

22 Formin AtFH1 AtFH1, člen Arabidopsis formin třídy I představuje skvělý příklad unikátního mechanismu chování forminů u rostlin (Michelot et al. 2005, Michelot et al. 2006). AtFH1 je schopen nukleace filament de novo, váže se s vysokou afinitou na stranu aktinových filament a také váže aktinová filamenta do svazků. Vázání filament k sobě probíhá na podobném principu, jako u dalších proteinů svazkujících aktin, včetně fimbrinu a vilinu (Ye et al. 2009, Kovar et al. 2000). AtFH1 je první příklad neprocesivního forminu u rostlin, protože nezůstává připojený k rostoucímu plus konci filamenta, jak je předpokládáno při procesivní nukleaci forminů. Jak se AtFH1 pohybuje od konce na stranu aktinového filamenta, může podporovat další tvorbu nového aktinového filamenta ze strany vlákna, které právě vytvořil, což by mělo usnadňovat vznik podélných svazků aktinových filament (Michelot et al. 2006). Skutečnost, že nukleující aktinová filamenta se nacházejí blízko sebe, je vyžadována jako první krok při tvorbě aktinových svazků a kabelů. Navíc, aktin-provazující proteiny jako jsou villin nebo fimbrin mohou dále stabilizovat kontakt mezi dvěma filamenty, které jsou od sebe vzdáleny pouze pár nanometrů. Schopnost AtFH1 organizovat aktinová filamenta do podélných svazků je v souladu s akumulací aktinových kabelů při overexpresi AtFH1 v pylové láčce (Cheung a Wu 2004). 22

23 Obrázek 4: Model dynamické formace aktinových kabelů neprocesivním forminem AtFH1 Předpokládá se, že po dosud necharakterizovaném mechanismu nukleace (krok 1 a 2) se AtFH1 pohybuje od konce na stranu aktinového filamenta, váže se na jeho stranu a nukleuje nové vlákno (krok 3). AtFH1 organizuje aktinová filamenta do svazků (krok 4 a 5). Teplotní fluktuace prospívají interakcím mezi filamenty (červené šipky, krok 4). Nicméně tuhost aktinových struktur indukuje rozvětvení formace (zmenšená velikost červených šipek v kroku 5). Směr překrývání se filament se ustavuje po jejich elongaci (černé šipky, krok 5). Aktinové svazky jsou v blízkosti svého vzniku v antiparalelní orientaci (růžová zóna, krok 5) a v paralelní orientaci po vzdálení se od místa vzniku nukleace (modrá zóna, krok 5). Převzato z Michelot et al. (2006). Signalizace Ještě větší výzvou než zařazení forminů a jejich funkcí se pak jeví pochopení signalizace, která se odehrává mezi forminy a způsob kontroly jejich aktivity a vlivu na celkovou dynamiku aktinu. Žádné ze známých regulačních domén, jež by je mohly kontrolovat, nejsou v rostlinných forminech konzervovány (Blanchoin a Staiger 2010). 23

24 6. Nové typy nukleace u živočichů V poslední době u živočichů objevené nukleátory aktinu Spire, Cordon bleu (Cobl), Leiomodin (Lmod), JMY a APC představují třetí mechanismus nukleace, která zahrnuje aktivní sběr a uspořádání aktinových monomerů do polymerizačních začátků (viz. kapitola 1) (Chesarone a Goode 2009, Firat-Karalar a Welch 2011). Způsob jejich nukleace je graficky znázorněn v obrázku 5a. Tyto nukleátory zatím nebyly objeveny u rostlin, přestože rostliny v některých proteinech využívají WH2 doménu (WASP homology 2 domain; jde o krátký motiv vázající aktinový monomer, který se vyskytuje v mnoha proteinech regulujících aktin, např. i v proteinech rodiny Scar/WAVE, rostlinných Arp2/3 aktivátorů. WH2 doména je pro tyto nové typy nukleace zásadní. (Frank et al. 2004) Spire Spire je konzervován napříč mnohobuněčnými organismy, byl nalezen jako nukleátor aktinu a důležitý protein při utváření polarity v oocytech Drosophily. Společně s forminem Cappucino je potřeba pro utváření cytoplazmatických aktinových sítí, které kontrolují tok cytoplasmy v oocytech a mohou hrát roli v přesunech na membráně. Forminy mají centrální úlohu ve formování aktinové sítě a Spire je podporují (Bosch et al. 2007). Spire má čtyři tandemově uspořádané aktinové monomery vázající WH2 domény (WASP-homology 2) oddělené krátkými linkery. Nejpravděpodobněji stabilně asociuje se čtyřmi aktinovými monomery v prenukleačním komplexu, který se podobá krátkému segmentu vznikajícího filamenta. Post-nukleační efekty nukleace pomocí Spire zatím nebyly uspokojivě vyřešeny (Quinlan et al. 2005) Cobl Cobl je v hojné míře přepisován v mozku a je důležitý pro prodlužování neuronů, byl nalezen při zkoumání nukleace aktinu v neuronech krys. Mechanismus nukleace pomocí Cobl je v některých ohledech podobný nukleaci pomocí Spire, ale jsou tu určité rozdíly. Nukleace 24

25 vyžaduje tři aktin vázající WH2 domény oddělené linkery. Delece první nebo třetí WH2 domény podstatně snižuje nukleční aktivitu, zatímco delece jakékoliv WH2 domény u proteinu Spire pouze částečně redukuje nukleační aktivitu. K tomu je nutno říci, že jeden z linkerů u Cobl je delší než u Spire. Zkrácení tohoto linkeru ruší nukleaci. Tím se zdá, že spíše délka linkeru než sekvence se objevila jako důležitá pro funkci nukleace. To vede k myšlence, že Cobl stabilizuje asociace mezi monomery na krátké i dlouhé vzdálenosti (Ahuja et al. 2007) Lmod Protein Lmod byl poprvé objeven v krysích myokardech. Vyskytuje se v srdeční svalové tkáni, kde se jedná jako silný nukleátor aktinových filament. Nukleace je u něj závislá pouze na jedné WH2 doméně a dvou nesouvisejících aktin-vázajících doménách. Lmod tyto domény využívá k organizování dvou až tří monomerů aktinu do polymerizačního začátku. Jednou ze zajímavostí proteinu Lmod je ta, že aktivita se dá stimulovat in vitro tropomyosinem, podobně jako u forminů (Chereau et al. 2008, Chesarone a Goode 2009) JMY JMY je multifunkční aktin nukleující faktor. Je to protein, který byl u obratlovců identifikován jako transkripční ko-aktivátor proteinu p53. Jeho další funkcí je aktivace Arp2/3 komplexu a přímá nukleace vláken mechanismem podobným jako je mechanismus nukleace proteinu Spire. Funkce JMY byla zkoumána v lidských kultivovaných buňkách HL-60, jeho zvýšená přítomnost v buňkách se projevila zvýšením buněčné pohyblivosti a snížení jeho exprese vedlo k pomalejší migraci buněk. JMY se nachází v jádře a teprve při potřebě buňky zvýšit svoji motilitu je transportován z jádra do cytoplasmy (Zuchero et al. 2009). 25

26 6.5 APC Dalším proteinem potlačujícím nádorové bujení je APC (adenomatous polyposis coli), který reguluje buněčnou migraci koordinací mikrotubulů a mikrofilament. Nachází se na plus koncích mikrotubulů a v místech, kde buňka aktivně vytváří aktinová vlákna. Předpokládá se, že ve spolupráci s forminy nukleuje nová aktinová vlákna, nukleace probíhá pomocí mechanismu, který zahrnuje APC dimerizaci a nábor více monomerů aktinu, podobně jako u forminů (Okada et al. 2010). 26

27 Obrázek 5: Nové typy nukleace u živočichů Převzato z: Ferron F. et al. (2007) 27

28 7. Závěrečné shrnutí V rostlinných buňkách je velká převaha G-aktinu nad F-aktinem, u živočichů je tomu naopak. To svědčí o velké dynamice rostlinných aktinových vláken. Spontánní nukleace aktinových vláken je v buňce in vivo skoro zanedbatelná. Otázkou tedy je, jak je nukleace v buňkách umožněna a regulována. Nukleace aktinu v rostlinných buňkách je umožněna proteiny polymerujícími aktin Arp2/3 komplexem a forminy, které pracují provázaně. Arp2/3 komplex rozvětvuje síť stávajících aktinových filament a zůstává spojen s mínus koncem nového vlákna. Naproti tomu formin FH2 doména se udržuje na plus konci vlákna i po nukleaci a umožňuje rychlé vkládání aktinových podjednotek, forminy katalyzují vznik přímých aktinových vláken. Podjednotky z Arp2/3 komplexu jsou vysoce konzervované u buněk živočichů, hub a rostlin. Delece více podjednotek Arp2/3 komplexu je u kvasinky, C. Elegans i Drosophily letální, u savců vede delece k zastavení buněčného růstu. U rostlin má delece podjednotek Arp2/3 komplexu pouze slabý mutační efekt způsobující vývojové chyby u kořenových vlásků, trichomů a pokožkových buněk. Je možné, že role Arp2/3 komplexu je v rostlinných buňkách částečně nahrazena dalšími nukleátory aktinu forminy. Rostliny mají více isoforem pro forminy než živočichové, avšak o konkrétních rolích jednotlivých forminů v rostlinných buňkách víme zatím jen málo. V poslední době u živočichů objevené nukleátory aktinu Spire, Cordon bleu, Leiomodin, JMY a APC. Tyto nukleátory zatím nebyly objeveny u rostlin. Víme, že u živočichů Spire interaguje s forminy a že isoformy forminů u rostlin nebyly všechny jestě podrobně prozkoumané. Zda mají také rostliny podobné nukleátory aktinu, zatím čeká na ověření. Závěrečné shrnutí mé práce o nukleaci aktinu v rostlinných buňkách vypovídá o tom, že mnoho otázek bylo již o nukleaci aktinu u rostlin zodpovězeno a mnoho důležitých a zajímavých otázek čeká na své odpovědi. Budu ráda, když budu v mé příští práci moci přispět k jejich zodpovězení. 28

29 8. Literatura Ahuja, R., R. Pinyol, N. Reichenbach, L. Custer, J. Klingensmith, M. M. Kessels & B. Qualmann (2007) Cordon-bleu is an actin nucleation factor and controls neuronal morphology. Cell, 131, Blanchoin, L. & C. J. Staiger (2010) Plant formins: Diverse isoforms and unique molecular mechanism. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research, 1803, Borths, E. L. & M. D. Welch (2002) Turning on the Arp2/3 complex at atomic resolution. Structure, 10, Bosch, M., K. H. D. Le, B. Bugyi, J. J. Correia, L. Renault & M. F. Carlier (2007) Analysis of the function of spire in actin assembly and its synergy with formin and profilin. Molecular Cell, 28, Brembu, T., P. Winge, A. M. Bones & Z. B. Yang (2006) A RHOse by any other name: a comparative analysis of animal and plant Rho GTPases. Cell Research, 16, Chereau, D., M. Boczkowska, A. Skwarek-Maruszewska, I. Fujiwara, D. B. Hayes, G. Rebowski, P. Lappalainen, T. D. Pollard & R. Dominguez (2008) Leiomodin is an actin filament nucleator in muscle cells. Science, 320, Chesarone, M. A. & B. L. Goode (2009) Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology, 21, Cheung, A. Y. & H. M. Wu (2004) Overexpression of an Arabidopsis formin stimulates supernumerary actin cable formation from pollen tube cell membrane. Plant Cell, 16, Cvrckova, F., M. Novotny, D. Pickova & V. Zarsky (2004) Formin homology 2 domains occur in multiple contexts in angiosperms. Bmc Genomics, 5, 18. Dayel, M. J., E. A. Holleran & R. D. Mullins (2001) Arp2/3 complex requires hydrolyzable ATP for nucleation of new actin filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98, Deeks, M. J., F. Cvrckova, L. M. Machesky, V. Mikitova, T. Ketelaar, V. Zarsky, B. Davies & P. J. Hussey (2005) Arabidopsis group Ie formins localize to specific cell membrane domains, interact with actin-binding proteins and cause defects in cell expansion upon aberrant expression. New Phytologist, 168, Eden, S., R. Rohatgi, A. V. Podtelejnikov, M. Mann & M. W. Kirschner (2002) Mechanism of regulation of WAVE1-induced actin nucleation by Rac1 and Nck. Nature, 418, Faix, J. & R. Grosse (2006) Staying in shape with formins. Developmental Cell, 10,

30 Finka, A., Y. Saidi, P. Goloubinoff, J. M. Neuhaus, J. P. Zryd & D. G. Schaefer (2008) The knock-out of ARP3a gene affects F-actin cytoskeleton organization altering cellular tip growth, morphology and development in moss Physcomitrella patens. Cell Motility and the Cytoskeleton, 65, Firat-Karalar, E. N. & M. D. Welch (2011) New mechanisms and functions of actin nucleation. Current Opinion in Cell Biology, 23, Frank, M., C. Egile, J. Dyachok, S. Djakovic, M. Nolasco, R. Li & L. G. Smith (2004) Activation of Arp2/3 complex-dependent actin polymerization by plant proteins distantly related to Scar/WAVE. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, Goley, E. D. & M. D. Welch (2006) The ARP2/3 complex: an actin nucleator comes of age. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 7, Goode, B. L. & M. J. Eck (2007) Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry, 76, Harris, E. S. & H. N. Higgs Biochemical analysis of mammalian formin effects on actin dynamics. In Methods in Enzymology, Vol 406, Regulators and Effectors of Small Gtpases: Rho Family, San Diego: Elsevier Academic Press Inc. Higgs, H. N. & T. D. Pollard (2001) Regulation of actin filament network formation through Arp2/3 complex: Activation by a diverse array of proteins. Annual Review of Biochemistry, 70, Hudson, A. M. & L. Cooley (2002) A subset of dynamic actin rearrangements in Drosophila requires the Arp2/3 complex. Journal of Cell Biology, 156, Hussey, P. J., T. Ketelaar & M. J. Deeks (2006) Control of the actin cytoskeleton in plant cell growth. Annual Review of Plant Biology, 57, Ingouff, M., J. N. F. Gerald, C. Guerin, H. Robert, M. B. Sorensen, D. Van Damme, D. Geelen, L. Blanchoin & F. Berger (2005) Plant formin AtFH5 is an evolutionarily conserved actin nucleator involved in cytokinesis. Nature Cell Biology, 7, 374-U34. Kovar, D. R., C. J. Staiger, E. A. Weaver & D. W. McCurdy (2000) AtFim1 is an actin filament crosslinking protein from Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 24, Le Clainche, C., D. Didry, M. F. Carlier & D. Pantaloni (2001) Activation of Arp2/3 complex by Wiskott-Aldrich Syndrome protein is linked to enhanced binding of ATP to Arp2. Journal of Biological Chemistry, 276, Mathur, J. (2005) The ARP2/3 complex: giving plant cells a leading edge. Bioessays, 27,

31 Mathur, J., N. Mathur, B. Kernebeck & M. Hulskamp (2003) Mutations in actin-related proteins 2 and 3 affect cell shape development in Arabidopsis. Plant Cell, 15, Michelot, A., E. Derivery, R. Paterski-Boujemaa, C. Guerin, S. J. Huang, F. Parcy, C. J. Staiger & L. Blanchoin (2006) A novel mechanism for the formation of actin-filament bundles by a nonprocessive formin. Current Biology, 16, Michelot, A., C. Guerin, S. J. Huang, M. Ingouff, S. Richard, N. Rodiuc, C. J. Staiger & L. Blanchoin (2005) The formin homology 1 domain modulates the actin nucleation and bundling activity of Arabidopsis FORMIN1. Plant Cell, 17, Okada, K., F. Bartolini, A. M. Deaconescu, J. B. Moseley, Z. Dogic, N. Grigorieff, G. G. Gundersen & B. L. Goode (2010) Adenomatous polyposis coli protein nucleates actin assembly and synergizes with the formin mdia1. Journal of Cell Biology, 189, Pollard, T. D. (2007) Regulation of actin filament assembly by Arp2/3 complex and formins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 36, Pring, M., M. Evangelista, C. Boone, C. S. Yang & S. H. Zigmond (2003) Mechanism of formin-induced nucleation of actin filaments. Biochemistry, 42, Quinlan, M. E., J. E. Heuser, E. Kerkhoff & R. D. Mullins (2005) Drosophila Spire is an actin nucleation factor. Nature, 433, Rivero, F. & F. Cvrckova Origins and evolution of the actin cytoskeleton. In Eukaryotic Membranes and Cytoskeleton: Origins and Evolution, Berlin: Springer-Verlag Berlin. Robinson, R. C., K. Turbedsky, D. A. Kaiser, J. B. Marchand, H. N. Higgs, S. Choe & T. D. Pollard (2001) Crystal structure of Arp2/3 complex. Science, 294, Sawa, M., S. Suetsugu, A. Sugimoto, H. Miki, M. Yamamoto & T. Takenawa (2003) Essential role of the C-elegans Arp2/3 complex in cell migration during ventral enclosure. Journal of Cell Science, 116, Smertenko, A. P., M. J. Deeks & P. J. Hussey (2010) Strategies of actin reorganisation in plant cells. Journal of Cell Science, 123, Staiger, C. J. (2000) Signaling to the actin cytoskeleton in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 51, Staiger, C. J. & L. Blanchoin (2006) Actin dynamics: old friends with new stories. Current Opinion in Plant Biology, 9, Staiger, C. J., M. B. Sheahan, P. Khurana, X. Wang, D. W. McCurdy & L. Blanchoin (2009) Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. Journal of Cell Biology, 184,

32 Uhrig, J. F. & M. Hulskamp (2006) Plant GTPases: Regulation of morphogenesis by ROPs and ROS. Current Biology, 16, R211-R213. Uhrig, J. F., M. Mutondo, I. Zimmermann, M. J. Deeks, L. M. Machesky, P. Thomas, S. Uhrig, C. Rambke, P. J. Hussey & M. Hulskamp (2007) The role of Arabidopsis SCAR genes in ARP2-ARP3-dependent cell morphogenesis. Development, 134, Vantard, M. & L. Blanchoin (2002) Actin polymerization processes in plant cells. Current Opinion in Plant Biology, 5, Winter, D. C., E. Y. Choe & R. Li (1999) Genetic dissection of the budding yeast Arp2/3 complex: A comparison of the in vivo and structural roles of individual subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96, Xu, Y. W., J. B. Moseley, I. Sagot, F. Poy, D. Pellman, B. L. Goode & M. J. Eck (2004) Crystal structures of a formin homology-2 domain reveal a tethered dimer architecture. Cell, 116, Ye, J. R., Y. Y. Zheng, A. Yan, N. Z. Chen, Z. K. Wang, S. J. Huang & Z. B. Yang (2009) Arabidopsis Formin3 Directs the Formation of Actin Cables and Polarized Growth in Pollen Tubes. Plant Cell, 21, Zhang, X. G., J. Dyachok, S. Krishnakumar, L. G. Smith & D. G. Oppenheimer (2005) IRREGULAR TRICHOME BRANCH1 in Arabidopsis encodes a plant homolog of the actin-related protein2/3 complex activator Scar/WAVE that regulates actin and microtubule organization. Plant Cell, 17, Zhang, Z., Y. Zhang, H. X. Tan, Y. Wang, G. Li, W. Q. Liang, Z. Yuan, J. P. Hu, H. Y. Ren & D. B. Zhang (2011) RICE MORPHOLOGY DETERMINANT Encodes the Type II Formin FH5 and Regulates Rice Morphogenesis. Plant Cell, 23, Zuchero, J. B., A. S. Coutts, M. E. Quinlan, N. B. La Thangue & R. D. Mullins (2009) p53- cofactor JMY is a multifunctional actin nucleation factor. Nature Cell Biology, 11, 451-U