Exprese rekombinantních proteinů Exprese rekombinantních proteinů je proces, při kterém můžeme pomocí různých expresních systémů vytvořit protein odvozený od konkrétního genu, nebo části genu. Tento protein lze purifikačním systémem oddělit od nežádoucích nečistot a získat tak čistý produkt. Čistý protein můžeme následně použít k různým účelům v oboru molekulární biologie, imunologie apod. Existuje několik typů expresních systémů, které můžeme rozdělit na dvě hlavní třídy, eukaryotní a prokaryotní. Prokaryotní expresní systémy: bakteriální Bakteriální expresní systém je v běžné praxi nejznámější a nejpoužívanější systém pro expresi rekombinantních proteinů. Jeho výhodou je především jednoduchost, a vysoký výtěžek exprimovaného proteinu. Samotná exprese není finančně, ani časově náročná (24 hodin). Od bakteriálního expresního systému ovšem nesmíme vyžadovat vysoké nároky na kvalitu proteinu. Přesněji řečeno, systém neumožňuje postranslační modifikace, což může ovlivnit terciální strukturu proteinu. V bakteriích lze také exprimovat protein omezené velikosti, maximální molekulová hmotnost proteinu se pohybuje kolem 150 kda. Proteiny jsou v bakteriích exprimovány buď do cytosolu, nebo se hromadí v inkluzních tělískách. Typ exprese závisí zejména na struktuře rekombinantního proteinu a nelze ho cíleně ovlivnit. Dle typu exprese je tedy nutné zvolit správný druh purifikace proteinu. Eukaryotní expresní systémy: kvasinkové, hmyzí, savčí Kvasinkový systém je v oboru druhým nejpoužívanějším expresním systémem. Nároky na obtížnost a finanční dostupnost se výrazně neliší od bakteriálního systému, je jen třeba počítat s delším časovým plánem. V kvasinkovém systému lze také na rozdíl od bakterií produkovat protein větší než 150 kda. V kvasinkách navíc probíhají postranslační modifikace, potřebné pro formování proteinu do přirozené struktury. Nevýhodou je hlavně nízký výtěžek produktu. Kvasinky produkují rekombinantní protein buď do cytosolu, nebo sekretoricky do růstového média. Typ exprese lze ovlivnit správným výběrem exrpesního vektoru. Exprese proteinu v buňkách hmyzu je specializovaný typ exprese, kdy je nutné pracovat ve striktně aseptickém prostředí. Exprse rekombinantního proteinu je náročná na praktické provedení, čas i finanční porstředky. Také výtěžek exprese se pohybuje ve velice nízkých koncentracích. Výhodou systému je výroba proteinu v buňkách mnohobuněčného organismu. Savčí expresní systém je velice podobný systému hmyzímu. Ke kultivaci savčích buněk ovšem potřebujeme speciální inkubátor, který zajistí specifickou hladinu kyslíku a oxidu uhličitého. Proto se tento expresní systém používá pouze ve specializovaných laboratořích.
Exprese rekombinantního proteinu v E. coli V úvodním odstavci jsou uvedeny základní informace o bakteriálním expresním systému. Následující text se zaměří na konkrétní problematiku exprese v E. coli, dále principy exprese a purifikace rekombinantních proteinů. Inzert: Inzert je lineární molekula DNA, která nese sekvenci nukleotidů kódující rekombinantní protein. Inzert je specificky upravený pro zaklonování do expresního vektoru tak, že jsou na koncích sekvence proteinu přidaná restrikční místa kompatibilní s expresním vektorem. Pomocí restrikčních endonukleáz lze pak jednoduše vytvořit ligační přesahy a zaklonovat inzert do vektoru. Inzert musí nést sekvenci pro začátek transkripce (methionin) a stop kodon pro ukončení transkripce. Dále by měl inzert obsahovat specifickou signální sekveni, pomocí které lze exprimovaný protein následně identifikovat a přečistit. Obrázek 1: Schéma komponent inzertu Expresní vektory: Expresní vektor je plasmid (kruhová molekula DNA), speciálně upravený pro expresi rekombinantních proteinů v bakteriích. Expresní vektor je složen z několika základních sekvencí důležitých pro integraci inzertu, selekci bakteriálního klonu a expresi proteinu (viz obrázek).
Obrázek 2: Expresní vektor Komponenty expresního vektoru: T7 promotor (T7 promoter) je sekvence vektoru, na kterou specificky nasedá transkripční enzym T7 RNA polymeráza, která je zodpovědná za transkripci inzertu. T7 RNA polymeráza není bakteriální enzym, ale pochází z bakteriofága λ, což zajišťuje vazebnou specificitu pouze na jednom úseku DNA expresním vektoru. T7 počátek transkripce (T7 transkription start) je místo, kde začíná T7 RNA polymeráza syntetizovat mrna inzertu. His Tag sekvence (His Tag coding sequence) je úsek DNA kódující histidinovou kotvu užitečnou pro detekci a purifikaci proteinu (viz dále). Pokud His tag sekvenci z nějakého důvodu nechceme, či nepotřebujeme, lze ji jednoduše z vektoru vyštěpit restrikčními endonukleázami. Klonovací místo (Multiple cloning site) je místo na vektoru, kam lze zaklonovat inzert. Tento úsek vektorové DNA obsahuje několik specifických sekvencí pro různé restrikční endonukleázy a tím plní funkci univerzálního klonovacího místa. T7 terminátor (T7 terminator) je místem pro ukončení transkripce inzertu. LacI sekvence (LacI coding sequence) je gen, který kóduje lac represor. Lac represor je protein, který se bez přítomnosti IPTG (isopropyl-beta-d-thiogalaktopyranosid) váže na DNA vektoru do blízkosti T7 promotoru a blokuje tak aktivitu T7 RNA
polymerázy. V opačném případě se represor na molekuli IPTG naváže, což umožní T7 RNA polymeráze nasednout na promotor a zahájit transkripci (viz obrázek 3). pbr322 počátek replikace (pbr322 origin) je sekvence důležitá pro replikaci plasmidu během kultivace bakteriální kultury. bla kódující sekvence (bla coding sequence) je gen, který kóduje resistenci k ampicilinu. Pomocí resistence k antibiotiku lze v médiu obohaceném ampicilinem snadno selektovat bakteriální klony, které obsahují expresní vektor. Expresní buňky: BL21, Rosseta, Origami BL21 jsou geneticky modifikované kmeny E. coli, které mají genom speciálně upravený tak, abychom mohli cíleně ovlivnit a načasovat expresi rekombinantního proteinu. Klíčocou roli zde hraje gen laci, který kóduje lac represor, a gen DE3, který nese informaci pro syntézu T7 RNA polymerázy zodpovědnou za transkripci inzertu. Lac represor nasedá na lac promotor (promotor genu DE3), blokuje tím syntézu T7 RNA polymerázy a transkripce rekombinantního proteinu na vektoru neprobíhá. Pokud je v buňce přítomen IPTG, váže na sebe lac represor, který se uvolní z vazby na lac promotor a umožní tím syntézu T7 RNA polymerázy (viz obrázek 3). Rosseta jsou expresní buňky odvozené od kmenu BL21. Tyto buňky mají navíc upravené t-rna kodony pro syntézu proteinů tak, aby snáze probíhala syntéza eukaryotních genů v prokaryotním systému. Origami B je expresní kmen odvozený od kmene BL21, který zároveň přejímá výhod kmene Origami a usnadňuje tak tvorbu disulfidických můstků cílového proteinu. Obrázek 3: Schéma principu indukce exprese rekombinantního proteinu
Expresní média a kultivační podmínky: Kultivace expresních buněk bakteriálního systému probíhá v LB mediu za standardních podmínek (37 C, 200 220rpm), za přítomnosti IPTG a antibiotika. Pokud exprese probíhá pouze v termostatu, je doporučeno kultivovat bakterie v malém množství média (1/4 objemu kultivační baňky) po dobu 4 6 hodin (Stationary phase). Po delší inkubaci v médiu začnou ubývat živiny, hromadí se odpadní látky a klesá schopnost dělení a přežívání bakterií (Death phase). Dále se zpomaluje exprese proteinu, který může být navíc poškozen stresovým stavem umírajících bakterií. Obrázek 4: Růstová křivka bakteriální kultury Pro zvýšení výtěžku exprese se doporučuje použít pro kultivaci speciální přístroj fermentor, který na základě měření ph, O2, CO2 a živin upravuje podmínky pro růst bakterií tak, aby bylo možné exprimovat rekombinantní protein po dobu 24 hodin za konstatních podmínek. Obrázek 5: Fermentor
Systémy purifikace proteinů: Afinitní chromatografie, purifikace z inkluzních tělsíek Afinitní chromatografie je metoda, která umožňuje ze směsi proteinů oddělit relativně čistou frakci jediného proteinu, nebo přpíbuzných proteinů. Principem metody je vazba purifikovaného proteinu na ligand ukotvený na koloně, promytí nežádoucích nenavázaných proteinů a uvolnění purifikovaného proteinu do čisté fáze. V laboratorní praxi se při purifikaci nejvíce osvědčil systém založený na interakci iontu kovu (Ni 2+, Zn 2+, Cu 2+ ) s histidinem (hexahistidinová kotva). Na chromatografické koloně tak dochází k vazbě proteinu označeného hexahistidinovou kotvou na částice kovu (ligand), který je pevnou součástí výplně kolony (agarózy). Po důkaldném vymytí nenavázané proteinové frakce mobilní fází následuje pomocí imidazolu uvolnění histidinové kotvy z vazby. Jelikož imidazol vykazuje vyšší afinitu k částicím kovu, vytěsní svou vazbou histidinovou kotvu a purifikovaný protein je následně uvolněn do eluční fáze. Obrázek 6: Kolonka na afinitní chromatografii Tato metoda umožňuje purifikaci proteinů buď za nativních nebo denaturačních podmínek. Za nativních podmínek lze purifikovat rozpustný protein, který se nachází v cytosolu bakterií. Purifikovaný protein si za nativnívch podmínek uchová přirozenou strukturu a aktivitu, což má výhodu pro následné využití proteinu. Denaturační podmínky lze zvolit za situace, že je rekombinantní protein nerozpustný a bakterie ho ukaládá do struktur zvaných inkluzní tělíska. Nerozpustný protein poznáme jeho přítomností v lyzovaném bakteriálním peletu. Purifikace z inkluzních tělsíek je poměrně elegantní purifikační metoda vhodná především v případě, pokud zjistíme, že je sledovaný protein nerozpustný a bakterie ho shromažďuje v inkluzních tělískách. Principem je několikanásobná lýze nakultivovaného buněčného materiálu. Při první lýze bakteriální kultuy se po centrifugaci uvolní do supernatantu jako odpadní produkt proteiny cytosolu. Opětovnou lýzou a centrifugací ve speciálních pufrech získáme samostatná inkluzní tělíska a následně čistý protein. Známým lyzačním pufrem je komerčně vyráběný B- PER (bacterial protein extractin reagent, Pierce), který ovšem může odradit vysokou cenou. Pro izolaci proteinu z inkluzních tělísek ve větší míře se proto vyplatí použít běžný protokol dostupný na webu, nebo v odborné literatuře.
Jelikož se pro purifikaci proteinů ve většině protokolů používají koncentrované roztoky solí a jiných nežádouích chemikálií, je třeba proteinový vzorek před vlastním využitím dialyzovat proti vhodnému pufru (např. PBS). Dále je důležité protein správně uskladnit. Typy uskladnění proteinů nabízí obrázek 7 (Pierce). Obrázek 7: Skaldování proteinů Detekce: SDS-page, western blot, hmotnostní spektrometrie K detekci exprese rekombinantního proteinu je možné použít základních metod pro práci s proteiny a to SDS-page elektroforézu a western blot analýzu. Principy obou metod jsou probírány v kurzu Základní metody molekulární biologie. Speciální kapitolou analýzy proteinů je hmotnostní spektrometrie. Pomocí této metody lze velice přesně identifikovat sledovaný protein z roztoku, nebo elektroforetického gelu a ověřit tak jeho identitu porovnáním s databází, nebo známou sekvencí proteinu. Analýza proteinu hmotnostní spektrometrií je ovšem poměrně finančně náročná a lze ji provádět pouze na specializovaných pracovištích.