Protokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup:

Transkript

1 Protokoly Pracovní potřeby, pufry a chemikálie jsou uvedeny na konci protokolu. Pracovní postupy jsou odvozeny od těchto kitů: Champion pet160 Directional TOPO Expression Kit with Lumio Technology (Invitrogen) a Ni-NTA Purification System (Invitrogen). Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 1. Buňky necháme rozmrazit 5 min. na ledu. 2. K buňkám přidáme plazmid a opatrně zamícháme krouživým pohybem špičkou. (pozor!! Nepipetovat buňky do špičky a zpět, mohly by se poškodit!). 3. Směs přeneseme do elektroporační kyvety tak, aby se nevytvořily bubliny. Kyvetu vložíme do elektroporační aparatury a spustíme elektroporaci dle manuálu elektroporátoru. Pro E. coli použijeme pulz pod napětím 1700 V. 4. K buňkám do kyvety okamžitě přidáme 1 ml LB media, promícháme pipetováním a přelijeme směs do čisté eppendorfky. 5. Inkubujeme na třepačce min. při 37 C, 220 rpm. 6. Inkubační směsí inokulujeme 20 ml LB media s ampicilinem (finální koncentrace amp = 0,1 mg / ml). 7. Inkubujeme přes noc na třepačce při 37 C. Transformace DNA do chemicky kompetentních buněk BL21 1. Buňky necháme rozmrazit 5min. na ledu. 2. K buňkám přidáme plazmid a opatrně zamícháme krouživým pohybem špičkou. (pozor!! Nepipetovat buňky do špičky a zpět, mohly by se poškodit!). 3. Inkubujeme 5 10 minut na ledu. 4. Provedeme teplotní šok (inkubace 45 s při 42 C, zchladit na ledu). 5. K buňkám přidáme 1 ml LB media a inkubujeme na třepačce min. 6. Inkubační směsí inokulujeme 20 ml LB media s ampicilinem (finální koncentrace amp = 0,1 mg / ml). 7. Inkubujeme přes noc na třepačce při 37 C. Expresní kinetika 1. Inokulujeme 20 ml LB + amp 1 ml přes noc narostlé kultury. 2. Necháme kulturu pomnožit do log fáze (obr. 4), OD 600 = 0,5 0,8. 3. Odebereme 1 ml kultury jako startovní vzorek v čase 0 hod. 4. Kulturu rozdělíme po 10ml do dvou erlenmayerových baněk. 5. V jedné kultuře indukujeme expresi proteinu 10 μl IPTG. Baňky řádně označíme!! 6. Každou hodinu po dobu 4 hod. odebereme 1 ml kultury z obou baněk (vzorky v čase 1 4 hod.). Na spektrofotometru změříme optickou denzitu (OD 600 ) všech vzorků a závislost růstu indukované a neindukované kultury na čase zaneseme do grafu.

2 7. Vzorky zcentrifugujeme 1min. při rpm. 8. Pelet rozsuspendujeme v 250 μl B PER a uchováme při -20 C pro další analýzu. Exprese rekombianntních proteinů v E. coli 1. Inokulujeme 50 ml LB + amp 2,5 ml přes noc narostlé kultury. 2. Necháme kulturu pomnožit do log fáze (obr. 4), OD 600 = 0,5 0,8. 3. Indukujeme expresi proteinu 50 μl IPTG. 4. Inkubujeme 4 hod. při 37 C, 220 rpm. 5. Bakteriální kulturu zcentrifugujeme 10 min, 3000 g při 4 C. 6. Pelet uskladníme při -80 C. Příprava bakteriálního lyzátu: 1. Pelet rozsuspendujeme v 8 ml NLB a inkubujeme 30 min. na ledu. 2. Sonikujeme 6 10 pulzů, síla 30 %, pulzer 50 %. 3. Centrifugujeme 15 min., 3000 g při 4 C. 4. Ze supernatantu odebereme 40 μl vzorku pro detekci a supernatant i vzorek uskladníme při -20 C, nebo ihned pokračujeme afinitní chromatografií. Afinitní chromatografie: 1. Kolonku s Ni-NTA agarózou promyjeme 6 ml sterilní H 2 O, vodu necháme odtéci. 2. Kolonku 2 promyjeme 8 ml NBB, pufr necháme odtéci. 3. Do kolonky přelijeme supernatant z bodu 4. - Příprava bakteriálního lyzátu. 4. Inkubujeme na rotátoru min. při 4 C. 5. Necháme odtéci pufr s nenavázanými proteiny a frakci uskladníme při 4 C. 6. Kolonku promyjeme 8 ml NWB1. a frakci uskladníme při 4 C. 7. Bod 6. opakujeme s pufry NWB Kolonku 2 promyjeme 1,5 ml NEB a frakci uskladníme při 4 C 9. Ze všech frakcí odebereme 40 μl vzorku pro detekci. Detekce: SDS-PAGE, western blot Příprava vzorků: 40 μl vzorku smícháme s 10 ml 5 Laemli buffer a denaturujeme 8 10 min. při 96 C. Vzorek ochladíme na pokojovou teplotu a pipetujeme po 20 μl do gelu (celkem 2 gely). SDS-PAGE: Gel: Pro SDS-PAGE analýzu použijeme 10 % polyakrylamidový gel. Podmínky elektroforézy: 90 V 10 min., 160 V 50 min. (dokud vzorky nedoběhnou do konce gelu). Protože v rámci úspory času využíváme vysoké napětí, elektroforetickou komoru chladíme ledem.

3 Wester blot: Podmínky elektrotransferu: 100 V, 60 min. Primární protilátka: Anti-His (1 : 1000) Sekundární protilátka: Anti-mouse (1 : 5000) Wester blot pracovní postup: Příprava vzorku (5 koncentrovaný): µl proteinového extraktu vysrážíme přes noc 14 µl 100% TCA. 2. Centrifugujeme 2,5 min rpm, RT, odstraníme supernatant. 3. K peletu přidáme 100 µl acetonu a pelet špičkou rozsuspendujeme, nebo zvortexujeme. 4. Centrifugujeme 2,5 min rpm, RT, odstraníme supernatant. 5. K peletu přidáme 100 µl acetonu a pelet špičkou rozsuspendujeme, nebo zvortexujeme. 6. Centrifugujeme 5 min rpm, RT, odstraníme supernatant. 7. Pelet rozpustíme v 20 µl 1 PBS. 8. Přidáme 5 µl 5 Laemli buffer a inkubujeme 10 min. při 95 C, následně ochladíme na ledu a zkondenzovanou vodu odstředíme na stolní centrifuze. SDS PAGE (podmínky elektroforézy dle protokolu pro expresi proteinů) Blotting 1. Gel promyjeme 1 5 min. v 1 TBS. 2. Filtrační papíry a molitan namočíme do 1 TBS. 3. Membránu inkubujeme 10 sek. v 100% metanolu, poté 5 min. v destil. H 2 O a následně 10 min. v 1 TBS. (!!membrána nesmí vyschnout!!). 4. Složíme sendvič pro elektrobloting v pořadí: černá strana kazety molitan 2 filtr. papír gel membrána 2 filtr. papír (!!vyhladit bublinky!!) červená strana kazety. 5. Sendvič blotujeme v 1 TBS na ledu 60 min. při napětí 100V. 6. Membránu promzjeme v 1 PBS a poté inkubujeme v blokovacím roztoku při 4 C přes noc. Vyvíjení membrány s protilátkou: 1. Membránu inkubujeme v roztoku primární protilátky 1,5 hod při 4 C. 2. Membránu promyjeme 3 10 min. v 1 PBS + 1% Tween. 3. Membránu inkubujeme v roztoku sekundární protilátky 1 hod při 4 C. 4. Membránu promyjeme 3 10 min. v 1 PBS. Detekce sekundární protilátky: 1. Membránu přemístíme na igelitovou fólii a převrstvíme 1 ml Detection reagent 1 a 2 smíchaných v poměru 1 : Membránu inkubujeme 3 min. ve tmě, zabalíme do fólie (!!bez přehybů a bublin!!) a vyvoláme v luminátoru.

4 Pracovní potřeby, pufry a chemikálie exprese a purifikace rekombinantních proteinů: Ampicilin (c = 100 mg / ml) B PER (Pierce) Elektrokompetentní buňky BL21 Elektroporační kyvety vychlazené na ledu H 2 O (sterilní, deionizovaná) IPTG (0,8 M roztok) Kolonka s Ni-NTA agarózou LB medium s ampicilinem (finální koncentrace amp = 0,1 mg / ml) vytemperované na 37 C LB medium vytemperované na 37 C NBB (Native Binding buffer) NEB (Native Elution Buffer) NLB (Native Lysis Buffer) NWB (Native Wash Buffer 1., 2., 3., a 4.) Plazmid (10 ng, 1 10 μl) Složení purifikačních pufrů: NBB, NEB, NLB, NWB NBB (Native Binding buffer): NEB (Native Elution Buffer): 250 mm imidazol NLB (Native Lysis Buffer): 0,1 % Lysozym 0,1 mm PMSF!!lysozym a PMSF jsou tepelně nestabilní, do pufru přidat těsně před použitím!! NWB 1. (Native Wash Buffer 1.): 20 mm imidazol NWB 2. (Native Wash Buffer 2.): 30 mm imidazol NWB 3. (Native Wash Buffer 3.): 40 mm imidazol NWB 4. (Native Wash Buffer 4.):

5 50 mm imidazol Pracovní potřeby, pufry a chemikálie detekce rekombinantních proteinů: Elektroforetická aparatura Elektroblotovací aparatura PVDF membrána 100 % k. trichloroctová (TCA) Aceton 1 PBS (Phosphate Buffered Saline) 5 Laemli buffer 1 RB (Running Buffer) 1 TB (Transfer buffer) 100 % metanol Blokovací roztok (12,5 g sušeného nízkotučného mléka (1 %) dolít do 250 ml 1 PBS) Primární protilátka (Anti HIS, Sigma), ředění 1 : 2000 v blokovacím roztoku (10 ml) Sekundární protilátka (Anti mouse, Thermo), ředění 1 : 5000 v blokovacím roztoku 1 PBS 1 PBS + 1% Tween Detection Reagent (GE Healthcare RPN 3000 Oil 1) Složení roztoků: 1 RB 1 TB 1 PBS (ph 7,4) Tris base 3,02 g 3,03 g - Glicine 18,8 g 14,41 g - 20% SDS 5 ml % metanol ml - NaCl g KCl - - 0,2 g Na 2 HPO ,44 g KH 2 PO ,24 g destil. H 2 O sterilní Dolít do 1 litru Dolít do 1 litru Dolít do 1 litru Příprava 10% SDS-PAGE gelu: Separační gel (10 ml) Zaostřovací gel (2 ml) destil. H2O sterilní 4 ml 1,4 ml 30 % akrylamide mix_bis 3,3 ml 330µl 1,5 M Tris (ph 8,8) 2,5 ml - 1 M Tris (ph 6,8) µl 10 % SDS 100 µl 20 µl 10 % APS 150 µl 40 µl TEMED 6 µl 2 µl