Výživa kvasinek během kvašení vín Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Ústav Vinohradnictví a vinařství Výživa kvasinek během kvašení vín Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Ing. Božena Průšová Vypracoval: Lukáš Kadlec Lednice 2018

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto práci: výživa kvasinek během kvašení vín vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách a o změně a doplnění dalších zákonů (zákon o vysokých školách), ve znění pozdějších předpisů, a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Lednici Dne... Podpis

Poděkování Tímto bych chtěl poděkovat vedoucí mé bakalářské práce, kterou byla Ing. Božena Průšová za odborné vedení a cenné rady. 1

Obsah 1 ÚVOD...3 2 CÍL PRÁCE...4 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED...5 3.1 Kvasinky...5 3.1.1 Pravé kvasinky...5 3.1.2 Druhy kvasinek...5 3.1.3 Rozmnožování kvasinek...6 3.1.4 Původ kvasinek...6 3.1.5 Výskyt a význam kvasinek...7 3.2 Historie alkoholového kvašení...7 3.2.1 Alkoholové kvašení moštu...8 3.2.2 Způsoby kvašení...8 3.2.3 Spontánní kvašení...9 3.2.4 Kvašení pomocí čistých kultur kvasinek... 10 3.2.5 Průběh alkoholového kvašení... 10 3.2.6 Fáze kvašení moštu... 10 3.2.7 Studená fermentace... 11 3.2.8 Sekundární fermentace... 12 3.2.9 Problematické kvašení moštu... 12 3.3 Faktory ovlivňující průběh kvašení... 13 3.3.1 Teplota... 13 3.3.2 Cukr v moště... 13 3.3.3 Alkohol... 14 3.3.4 Vliv kyslíku na kvašení... 15 3.3.5 Oxid siřičitý a jeho vliv na fermentaci moštu... 15 3.3.6 Dusíkaté látky v hroznech... 16 3.4 Asimilovatelný dusík v hroznech... 16 3.4.1 Dusík v amonné formě... 17 3.4.2 Dusík v podobě aminokyselin... 17 3.4.3 Nedostatek asimilovatelného dusíku... 18 3.5 Výživa kvasinek... 18 1

3.5.1 Amonné ionty... 19 3.5.2 Komplexní výživa... 20 3.5.3 Vitamíny... 20 3.5.4 Neaktivní kvasinky... 21 3.5.5 Tvorba sirovodíku (H2S) jinak... 22 3.5.6 Nadbytek výživy... 23 4 MATERIÁL A METODY... 24 4.1 Měřené odrůdy moštu révy vinné... 24 4.1.1 Popis odrůdy Rulandské bíle... 24 4.1.2 Popis odrůdy Hibernal... 24 4.1.3 Popis odrůdy Tramín červený... 25 4.2 Metody... 26 4.2.1 Stanovení titrovatelných kyselin... 26 4.2.2 Stanovení ph... 27 4.2.3 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku... 27 4.2.4 Stanovení amoniakálního dusíku a dusíku obsaženého v alfa-aminokyselinách. 27 7 SOUHRN A RESUMÉ... 35 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 36 2

1 ÚVOD Révu vinnou považujeme za ekonomicky velmi významnou plodinu. Víno nás provázelo již v historii a je jedním z nejstarších nápojů u nás. Na kvalitě vína se podílí celá řada faktorů. V této souvislosti hovoříme o půdě, péči o vinohrad a následně o hrozny, ale i zpracování ve sklepě. Také záleží na tom, zda jsme mošt nechali spontánně a pouze jsme jej pozorovali nebo kolik jsme do vína přidali přípravků a jakých a kolik jsme zvolili technologických postupů. Ve víně se nám na konci ukáže vše, co jsme s ním dělali. Obliba tohoto nápoje a hlavně jeho spotřeba se každým rokem zvyšuje. Každý konzument si může dnes najít své oblíbené vinařství. Co se skutečné skrývá ve výsledném víně, kolik výživy bylo nutné přidat a jak tato výživa ovlivnila konečný produkt? Říká se, že vše potřebné pro kvasinky přichází už z vinohradu, nicméně někdy to tak být nemusí. Problematika výživy kvasinek je nedílnou součástí výroby vína. Dobré znalosti a zkušenosti enologa mohou být nápomocny s tím, kdy je nutné výživu přidat a naopak kdy je to zcela nemístné. Existují ročníky, do kterých se určitě vyplatilo výživu kvasinek přidat a ovlivnit tak následných charakter vína nebo ho nasměrovat zcela odlišným směrem než se původně vydalo. Toto rozhodování není mnohdy jednoduché a je to na zvážení každého vinaře. Někdy to může být ku prospěchu a někdy na škodu. V této bakalářské práci se budeme zabývat výživou kvasinek během kvašení vín. Kvasinky jsou nedílnou součástí výroby vína, jejich úkolem je zajistit přeměnu cukrů v alkohol a zároveň přinést dobré a zajímavé chuťové vlastnosti. Kvasinky se nevyskytují jen na slupce hroznů, ale i v půdě, což se mění v závislosti na klimatických podmínkách, ve kterých hrozny zrají. Největší význam mají kvasinky při fermentaci, kdy se až 15 rodů kvasinek podílí na kvašení moštu. Dále si vysvětlíme, jaké jsou druhy kvašení a co kvašení ovlivňuje. Aby byly kvasinky co nejaktivnější, potřebují správnou výživu, a proto si způsoby výživy popíšeme. Dále se zaměříme na popis měřených odrůd moštu révy vinné a na závěr práce navrhneme aplikaci vhodné výživy. 3

2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo prostudovat literaturu zabývající se výživou kvasinek během kvašení vín. V rámci experimentální části následně stanovit asimilovatelný dusík v moštu a na základě výsledků stanovit optimální dávku přípravku pro výživu kvasinek. 4

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Kvasinky Mikroorganismy, které byly jako první důkladně studovány. Emil Christian Hansen jako první izoloval kvasinky, znalost procesu fermentace se velmi posunula kupředu (Hornsey c2007). Patří do říše houby (Fungi). Mikroorganismy, které mají heterotrofní způsob výživy, získávají uhlík (C) z organických látek. Velikost kvasinek je většinou 3-6 µm. Buňka kvasinek je tvořena buněčnou stěnou, která buňku chrání před mechanickým poškozením. Tato buňka obsahuje buněčné obaly, cytoplazmu s různými organelami a jádro, které obklopuje membrána s chromozomy. Polysacharidy jsou hlavní složkou stěny buňky, dále obsahuje bílkoviny, lipidy, fosfolipidy a fosforečnany (Ribérau- Gayon et al. 2006a ; Šilhánková 2002). 3.1.1 Pravé kvasinky Jsou to jednobuněčné mikroorganismy, které mají většinou elipsoidní tvar. Čisté kultury kvasinek se vypěstovali z jednotlivých kvasinkových buněk, kde byly důkladně prozkoumány jejich fermentační procesy. Tyto čisté kultury kvasinek mají za úkol přeměnit cukr co nejrychleji na alkohol a vytvořit dobré chuťové a aromatické vlastnosti a nevytvářet žádné nežádoucí vedlejší produkty (Pischl 1997). 3.1.2 Druhy kvasinek Od počátku tohoto století prošla taxonomie kvasinek celou řadou zkoumání, které postupně vytvářelo dnešní klasifikaci. První klasifikace byly založeny na rozdílech mezi kvasinkami (rozdíly v tvaru, velikostí buněk, fermentací a asimilací různých cukrů, různou potřebou růstového faktoru aj.) Určité druhy lze identifikovat i pomocí zkoumáním buňky pod mikroskopem. Postupně se vymezovaly druhy na základě biologické a genetické definice (Ribérau-Gayon et al. 2006a). 5

Kvasinky lze rozdělit dle schopnosti kvašení na kvasinky kvasící velmi dobře, kvasinky, které slabě kvasí, křísotvorné kvasinky, kvasinky, které se vyskytují zřídka (sporadicky). Kvasící velmi dobře, jsou takové kvasinky, které produkují velké množství alkoholu a vedlejší produktů. Saccharomyces cerevisiae (ušlechtilé vinné kvasinky), na začátku kvašení jsou v malém počtu. Kvasící slabě, sem patří tak zvané divoké kvasinky, přirozeně se vyskytující v přírodě. Jsou důležité pro zahájení alkoholového kvašení. Mezi hlavní zástupce divokých kvasinek patří Candida pulcherrima a Kloeckera apiculata, též nazývané apikulátní kvasinky. Křísotvorné kvasinky bývají většinou u vín s nižším obsahem alkoholu (11 %), kde se mohou rozmnožovat. Jsou to aerobní mikroorganismy (potřebují kyslík) a pro víno je jejich přítomnost škodlivá. Kvasinky vyskytující se zřídka nemají praktický význam (Steidl, 2002). 3.1.3 Rozmnožování kvasinek Rozmnožování u těchto mikroorganismů je nepohlavní a to dělením nebo pučením ale může být také pohlavně, kdy dochází ke splynutí jader. Jsou schopné vytvořit spóry, pokud jsou vystaveny nepříznivým podmínkám (Farkaš 1998). Kvasinky patří nedokonalým houbám, které se mohou množit pouze vegetativním množením (Ribérau-Gayon et al. 2006a). 3.1.4 Původ kvasinek Kvasinky se nacházejí na povrchu slupek bobulí, kde se množí na místech, kde jsou trhlinky a mají tak přístup k hroznové šťávě. 8 miliónů buněk se nachází na jedné bobuli. Počet kvasinek před sklizní hroznů je 10 3 a 10 5 na bobuli, v závislosti na situaci vinice, klimatických podmínkách během zrání hroznu a ošetření pesticidy. Na prasklé bobuli je 40x více než na bobuli, která není poškozená. Velký výskyt kvasinek je taktéž v půdě, tyto kvasinky se za pomocí deště dostávají na bobule, díky odrazu kapek vody od půdy. Velký výskyt je taktéž na vinařských zařízeních. Nejpočetnější populace kvasinek jsou na místech s nižší zeměpisné šířky, a kde je zvýšená teplota (Ribérau- Gayon et al. 2006a ; Steidl 2002). 6

3.1.5 Výskyt a význam kvasinek V přírodě jsou kvasinky velmi rozšířené, díky jejich sacharolytickým schopnostem se nacházejí hlavně na ovoci (bobulích). Vyskytují se nepravidelně na povrchu vinné révy, malé množství lze nalézt také na stonku, listech, velmi málo se nachází na květu. Najdeme je však také v půdě a ve vzduchu. Vítr a hmyz je také může rozšířit. Kvasinky jsou důležité pro výrobu alkoholických nápojů (vína), protože se podílejí na fermentaci. Je jich velké množství s různými technologickými vlastnostmi. Kvasinkové kmeny, které pracují během fermentace, mají vliv na rychlost, povahu a množství sekundárních produktů vzniklých při alkoholovém kvašení (Šilhánková 2002 ; Ribérau-Gayon et al. 2006a). 3.2 Historie alkoholového kvašení Historické prameny dokládají, jak probíhalo zjištění o alkoholovém kvašení neboli fermentaci. V 17. století Johann Becker - prokázal, že roztoky, které obsahují cukr, kvasí a roztoky, které ho neobsahují, tak nikoliv. V 18. století Lavoistier - cukr se přeměňuje pomocí kvašení na alkohol (etanol), oxid uhličitý a na kyselinu. Role kvasinek v alkoholové fermentaci, hlavně při přeměně cukrů na alkohol, byla jasná asi v polovině 19. století. V 19. století Gay-Lusac při kvašení alkoholu se jedna molekula cukru štěpí na dvě molekuly etanolu a také na dvě molekuly oxidu uhličitého. V 19. století Louis Pasteur prokázal úlohu kvasinek při etanolové fermentaci, vymyslel pojmy aerobní a anaerobní a stanovil rozdíly mezi aerobním a anaerobním kvašením (Ribérau- Gayon et al. 2006a ; Farkaš 1980 ; Jílek 1999 ; Hornsey c2007). Gay-Lusac Chemická rovnice alkoholového kvašení: C 6 H 12 O C 2 H 5 OH + 2CO 2 Glukóza (jednoduchý cukr) Alkohol (Etanol) + Oxid uhličitý + Energie Teoretická výtěžnost je ze 100 g jednoduchého cukru (glukózy) je možné vyrobit 51,1 g alkoholu (etanolu) a 48,9 g oxidu uhličitého (CO 2 ). Tato rovnice byla sestavena správně a platí i dnes, avšak výtěžnost alkoholu bývá prakticky nižší (Jílek 1999). 7

3.2.1 Alkoholové kvašení moštu Proces tvorby vína, při kterém vzniká pomocí složitého biochemického procesu etanol (alkohol) a oxid uhličitý (CO 2 ). Kvašení moštu zapříčiňují kvasinky, kterých může být až 15 rodů. Velmi důležité jsou vinné kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), které zkvašují glukózu a fruktózu, dva zkvasitelné cukry. Glukóza a fruktóza jsou monosacharidy neboli jednoduché cukry, které se přirozeně vyskytují ve vinném moštu, většinou v poměru 1:1. Fruktóza neboli ovocný cukr, se vyznačuje sladší chutí nežli glukóza, též nazývaný hroznový cukr. Obrázek č. 1 zobrazuje srovnání druhů kvasinek, které se vyskytují při začátku alkoholové fermentace Obrázek 1- Srovnání druhů kvasinek přítomných na začátku alkoholového kvašení (Frezier 1992) Vinné kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), pokud mají možnost výběru tak upřednostňují glukózu před fruktózou, jsou glukofilní. Pokud je ve víně zbytkový cukr, tak se většinou jedná právě o fruktózu, která hůře kvasí. Většina koloidních sloučenin, stejně tak i polysacharidy nejsou ve víně žádoucí, při filtraci můžou způsobovat problémy (Pavloušek 2010 ; Steidl 2002). 3.2.2 Způsoby kvašení Má-li propuknout alkoholové kvašení je nutné, aby počet buněk v jednom mililitru byl asi 10 miliónů. Nejčastěji dochází ke zvýšení počtu buněk při kontaminaci se zařízeními ke zpracování hroznů, jako je například lis. Tak dochází 8

k přirozenému zvýšení počtu těchto buněk. Lze rozdělit způsoby kvašení na spontánní kvašení a kvašení pomocí čistých kultur kvasinek. 3.2.3 Spontánní kvašení Je to takový způsob, kdy se výsledek nechá na náhodě. Kvasinky se rozmnoží díky kyslíku (O 2 ) na daný počet buněk, který je potřebný ke kvašení. Záleží na celé řadě faktorů, který druh kvasinek převládne nad ostatními. Hlavní zastoupení mají mikroorganismy, které se dostanou do moštu z hroznů. Převládají apikulátní kvasinky Candida pulcherrima, které jsou velmi aktivní. Vytvořený alkohol a oxid uhličitý vytváří vhodné pro Saccharomyces cerevisiae vinných kvasinek, spontánní kvašení je vhodné u zdravých hroznů (Steidl 2002 ; Voldřich 1984). Fyziologické poruchy u Sacharomyces cerevisiae během spontánního kvašení vidíme v následující tabulce. Tabulka 1- Fyziologické poruchy Saccharomyces cerevisiae během spontánní alkoholové fermentace (Ribérau-Gayon et al. 2006a) Fáze fermentace cerevisiae oviformis capensis chevalieri Červená vína Začátek 23 77 - - Střed 10 90 - - Konec 14 84 2 - Bílá vína Začátek 23 62-14 Střed 35 60-4 Konec 32 62-6 Sladká vína Začátek 37 51 4 8 Střed 40 56 4 3 Konec 23 73 4 4 9

3.2.4 Kvašení pomocí čistých kultur kvasinek Nazývané též řízené kvašení. Čistá kultura kvasinek obsahuje stanovený počet buněk a vybraný jeden druh kvasinek, aniž by došlo k infikování jinými kvasinkami (mikroorganismy). Je to jistota, kvašení probíhá předem určeným směrem (Steidl 2002). 3.2.5 Průběh alkoholového kvašení Kvašení zahajují divoké kvasinky, pokud se jedná o spontánní kvašení. Tyto kvasinky se jmenují Candida pulcherrima a Kloeckera apiculata. Rozmnožování Candida pulcherrima je velmi rychle, avšak netrvá příliš dlouho. Zpravidla jen několik málo dní, jakmile vzroste alkohol na 1 až 2 % dochází k nástupu kvasinek Kloeckera apiculata odolávají alkoholu do 4 až 5 %. Poté se začínají prosazovat kvasinky vinné neboli Saccharomyces cerevisiae, které kvašení moštu obvykle ukončují. Saccharomyces cerevisiae se dokážou rozmnožovat i při 12 až 13 % alkoholu. Při 13 % a více jsou schopné se množit například Saccharomyces byanus, které jsou velmi odolné vůči vyššímu obsahu alkoholu, dokonce do 16 % (Pátek 2001 ; Pavloušek 2010). Ethanolová fermentace Biotechnologie, která se hojně využívá při zkvašování rozemletých bobulí révy vinné neboli rmutu. Kvasinky rodu Saccharomyces a některé další rody kvasinek odbourávají sacharidy pomocí alkoholového kvašení, kdy dochází k přeměně pyruvátu neboli kyseliny pyrohroznové na acetaldehyd, pomocí chemické reakce, kdy se z karboxylové skupiny odštěpí oxid uhličitý (CO 2 ). Dekarboxylací vzniklý acetaldehyd se poměrně snadno přemění na etanol (Vodrážka 2002). 3.2.6 Fáze kvašení moštu 10

Obrázek 2. Alkoholové kvašení se uskutečňuje v několika fázích kvašení moštu, viz Obrázek 2- Fáze kvašení moštu (Pavloušek 2010) Čtyři fáze kvašení moštu: I. Počáteční adaptační fáze: Fáze, při které se kvasinky adaptují na podmínky v moštu, které nemusí být vždy optimální. II. rozmnožovat. Rozmnožovací fáze: Po několika hodinách se kvasinky začnou III. Fáze hlavního kvašení: Při této fázi je tvorba alkoholu a kultury na maximální hranici IV. Fáze odumírání kvasinek: Dochází k postupnému odumírání kvasinek, buď vlivem zvýšeného množství alkoholu nebo vlivem nízkého (žádného) množství cukru (Pavloušek 2010). 3.2.7 Studená fermentace Kvašení za studena je takové, kdy je teplota kvašení od 12 do 15 C. Ne však všechny kvasinky takové podmínky zvládají a proto je nutné použít kvasinky pro studenou fermentaci. Saccharomyces bayanus jsou právě takovými kvasinkami, které jsou vhodné pro kvašení za nižší teploty. 11

Výhodou studené fermentace je menší odpaření alkoholu, vína mají více buketních látek, aroma vydrží déle. Nevýhodou je, že je větší potřeba vyšších dávek oxidu siřičitého (SO 2 ) a je nutné mít zařízení pro chlazení, aby se udržovala nízká teplota, což jsou pro vinaře další náklady navíc (Steidl 2002). 3.2.8 Sekundární fermentace Toto kvašení probíhá například u šumivých vín, kdy se do vína přidají speciální čisté kultury kvasinek a druhotné kvašení probíhá například v lahvi. Jsou to hlavně ušlechtilé kultury kvasinek vejčitého nebo kulovitého tvaru Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces bayanus, které se přidávají v tirážním likéru. Tyto kvasinky musí být odolné určitým podmínkám, jako je například rozmezí alkoholu 8 až 12%, teplotě kolem 10 C, ph 2,8 a obsahu oxidu siřičitého nad 25 mg.l, který je volný (Nádeníčková 2014). 3.2.9 Problematické kvašení moštu Probíhá-li sklizeň hroznů za normálních podmínek, to znamená za slunečného a teplého počasí, pak bývá na povrchu hroznů dostatek kvasinek a se začátkem kvašení nebývá problém. Pokud však sběr hroznů probíhá během velmi chladného nebo deštivého počasí, pak může být s kvašením problém a může nastat až za několik dní. Za těchto podmínek je vhodné použít čisté kultury kvasinek nebo kvasící mošt, zvýšit teplotu, popřípadě i provzdušnit mošt (Pátek 1995). Existuje celá řada faktorů, které mají větší nebo menší vliv na kvašení moštu a mohou způsobit jeho problematické kvašení. Faktory ovlivňující kvašení jsou teplota, množství cukru v moštu, oxid uhličitý (CO 2 ), obsah kalových částic, koncentrace alkoholu (etanolu), množství oxidu siřičitého (SO 2 ), přítomnost kyslíku (O 2 ), obsah asimilovatelného dusíku aj. (Pavloušek 2010). Důvodů, které vedou ke zpomalení, nebo zastavení kvašení může být několik. Teplota, alkohol, množství cukru a kvasinky, tyto parametry by měly být zkontrolovaný, aby byl zásah do kvašení cílený a byl co nejefektivnější. Jestliže se jedná o nízkou teplotu, která bývá jeden z nejčastějších problémů, lze ji velmi často 12

vyřešit ohříváčkem, který vložíme do moštu. Pokud ani ohřívání nepomůže, je vhodné zbavit se látek, které mohou fakticky bránit dalšímu kvašení a to se provede tak, že se stočí kvasnice, ve kterých se tyto látky nacházejí. Poté se přidá největší možná dávka čisté startovací kultury kvasinek, která při teplotě 22 C začíná kvasit. Na trhu existuje celá řada kultur kvasinek. Faktory ovlivňující kvašení je vhodné kontrolovat v celém průběhu procesu kvašení (Steidl 2002). 3.3 Faktory ovlivňující průběh kvašení 3.3.1 Teplota Je považována za nejdůležitější faktor, který ovlivňuje kvašení moštu. Pokud dojde k problému s kvašením, pak příčinou je často nevhodná teplota. Pro rozmnožování a látkovou výměnu kvasinek je ideální teplota kolem 25 C. Při rychlé změně teploty dochází ke stresu kvasinek. Při vysoké teplotě nad 35 C může dojít k zastavení kvašení a uvaření kvasinek. Obecně lze říci, že při vyšší teplotě, je kvašení rychlejší, ale dochází k větším ztrátám alkoholu a aromatických látek. Naopak při nižších teplotách je kvašení daleko pomalejší, nižší ztráty alkoholu a aromatických látek, ale o to je zapotřebí většího množství oxidu siřičitého (SO 2 ) (Steidl 2002). Výhodou nižší teploty je také fakt, že je menší riziko napadení octovými bakteriemi, které mají optimální teplotu od 30 do 35 C. Pakliže je teplota pod 10 C je pro ně teplota špatně snesitelná na rozdíl od kvasinek. Proto je riziko octovatění daleko nižší u studené fermentace (Dyr 1997). 3.3.2 Cukr v moště Obecné pravidlo je takové, že mošty, které obsahují nižší množství cukru, kvasí lépe než mošty s vyšším obsahem cukru, jako je například výběr z bobulí. Mošty, které hůře kvasí, jdou obohatit o výživu kvasinek a je také možné přidat kvasinky. Vyšší obsah cukru v moštu znamená, že je i vyšší osmotický tlak a ten působí na kvasinky, které poté pomaleji prokvášejí cukr. Je tedy vhodné přidat kvasinky, které jsou osmofilní, mají vyšší odolnost vůči vyššímu osmotickému tlaku (Pavloušek 2010 ; Nádeníčková 2014). 13

Nejlépe kvasí roztoky, které mají koncentraci cukru 8 20%, při 30% je kvašení velmi slabé a při 50% prakticky nekvasí. Avšak existuje celá řada kvasinek, které mohou prokvasit i roztoky s vyšší koncentrací cukru. Na vliv cukru, respektive cukernatosti moštu mají nemalý vliv choroby révy vinné, jako například padlí révy, plíseň révová a další. Cukernatost je nižší, celková sklizeň hroznů je znehodnocená. Opakem může být napadení ušlechtilou formou Šedé hniloby révy, kdy může být za příznivých podmínek cukernatost zvýšena (Farkaš 1980 ; Hluchý et al. 1997 ; Šafránková 2013). 3.3.3 Alkohol Podílí se na chuti vína. Citlivost na obsah alkoholu má každý kmen kvasinek jinou. Jsou kmeny, které jsou vnímavější na přítomnost etanolu, a proto může při jeho vyšším obsahu dojít až k zastavení kvašení. Vyšší obsah působí také na asimilaci dusíku kvasinkami, která je poté nižší. Etanol je ale tak důležitý při konzervaci vína. Čím vyšší koncentrace alkoholu, tím je víno stabilnější. Určité množství etanolu se během zpracování odpaří, při vyšších teplotách je odpar alkoholu vyšší. Vliv na chuť a aroma vína má jak ethanol, tak i vyšší alkoholy, které dodávají vínu charakteristické aroma. Při fermentaci moštu vzniká, převážná většina vyšších alkoholů (Ribérau-Gayon et al. 2006a ; Hubáček et al. 1996 ; Farkaš 1980). Následující tabulka dokládá vliv přidaného etanolu na fermentaci moštu (v omezeném aerobním prostředí při teplotě 25 C) (Ribérau-Gayon et al. 2006a). 14

Tabulka 2- Vliv přidaného etanolu na fermentaci moštu (Ribérau-Gayon et al. 2006a) Přidaný alkohol glycerol (% vol.) (mmol/l) Opožděný začátek kvašení Populace kvasinek (10 6 /ml) Dosaženo obsahu alkohol (% vol.) Vytvořený alkohol (% vol.) Zbytkový cukr (g/l) Asimilovatelný dusík (mg/l) +0 57 +2 65 +6 72 +10 80 1 den 80 14.0 14,0 2 252 2 dny 67 15,6 13,6 6 233 4 dny 62 18,2 12,2 15 194 12 dní 30 16,0 6,0 125 81 3.3.4 Vliv kyslíku na kvašení Kvasinky jsou fakultativně anaerobní mikroorganismy, rostou jak za přítomnosti vzdušného kyslíku, tak i v případě jeho absence (Šilhánková 2002). Pokud se přidá do kvasu jemně rozptýlený vzduch, je možné zvýšit činnost kvasinek. Většinou mošty, které jsou v dřevěných sudech, nemají problém s nedostatkem vzduchu. Problém mohou mít kvasy, které se nacházejí v tancích a cisternách. Pouze u moštu, kde byly hrozny v naprostém pořádku, je možné použít vzdušný kyslík na podporu fermentace (Farkaš 1980). 3.3.5 Oxid siřičitý a jeho vliv na fermentaci moštu Jeho vliv je velký na rozmnožování a růst kvasinek. Důležitá je dávka oxidu siřičitého do moštu. Pokud je do moštu přidaná dávka do 20 mg l, pak kvašení stimuluje. Při vyšší dávce dochází k prodloužení kvašení, hovoříme o 50 až 100 mg/l. U 15

moštů, kde nebyl přidán oxid siřičitý, dochází ke kvašení hned, naopak u moštů ihned zasířených dochází ke zpomalení fermentace. Jestliže by nebyl přidán určitý obsah síry, pak by absolutní absence síry byla nemožná, protože určité množství si kvasinky syntetizují (Farkaš 1980). 3.3.6 Dusíkaté látky v hroznech Dostávají se do vína z hroznů a mají vliv na charakter vína. Některé dusíkaté látky slouží jako výživa pro kvasinky během alkoholovém kvašení moštu. Bylo prokázáno, že ve víně je 22 aminokyselin. Během složitého procesu fermentace moštu se množství dusíkatých látek snižuje a na konci kvašení se množství dusíkatých látek opět zvyšuje, z důvodu rozpadu (autolýze) kvasinek. Celkový obsah dusíku v moštu bývá od 100 do 1200 mg/l. Hovoříme o organické a anorganické formě dusíku v hroznech. Aminokyseliny, bílkoviny a sloučeniny, ve kterých se vyskytuje dusík v amonné formě, to jsou hlavní dusíkaté sloučeniny. Záleží na více faktorech, jaké bude množství dusíkatých látek v hroznech. Rozdíly bývají mezi odrůdami, podnožemi, a ročníky. Záleží na hnojení a ošetřování révy vinné nebo na napadení houbovými chorobami. Botrytis cinerea spotřebovává aminokyseliny kvůli svému metabolismu a tím může být obsah dusíkatých látek snížen. V suchém roce se také stává, že je obsah těchto látek nižší (Farkaš 1998 ; Malík 1994 ; Pavloušek 2011 ; Steidl 2002). 3.4 Asimilovatelný dusík v hroznech Asimilovatelný dusík (YAN yeast assimilable nitrogen), je takový dusík, který jsou kvasinky schopné vstřebat (asimilovat). Je tvořen z primárních aminokyselin (volných) a amonných iontů. Minimální hodnota asimilovatelného dusíku je 150 mg/l, aby proběhlo kvašení. Pokud je vyšší cukernatost u hroznů, pak je i vyšší potřeba YAN. Při maceraci hroznů (vyluhovaní), dochází k většímu uvolnění YAN, což většinou bývá u modrých hroznů, ale může být i u bílých hroznů. Velmi důležité je změřit hodnotu YAN, aby nedošlo ke zbytečnému dávkování dusíkatých látek a následnému negativnímu projevu na aromatickém charakteru vín (Pavloušek 2011). 16

3.4.1 Dusík v amonné formě Amonná forma dusíku je v rozmezí od několika desítek až po stovky mg.l. Amonné ionty potřebují kvasinky k tvorbě buněčné stěny a k syntéze proteinů. Těkavé kyseliny nám vznikají při nadbytku amonných iontů. Amonná forma dusíku (NH 4 ) je kvasinkami využívána jako první zdroj výživy a až poté využívají kvasinky aminokyseliny. Amonné ionty v bobulích jsou závislé na hnojení révy vinné dusíkem, respektive na množství organického dusíku, který se v půdě nachází (Baroň 2010 ; Pavloušek 2011). 3.4.2 Dusík v podobě aminokyselin Celkového dusíku se nachází v moštu a víně 1 4 g.l -1. Aminokyseliny jsou formou dusíku, který se nachází v hroznové šťávě a moštu. Aminokyseliny ve zralých hroznech představují asi 30-40% z celkového dusíku. V moštu dominují především aminokyseliny jako arginin, prolin, alfa alanin, serin, kyselina glutamová. Arginin a prolin jsou pro některé odrůdy hroznů charakteristické, např. prolin dominuje v Chardonnay, Cabernet Sauvignon, zatímco arginin převládá v odrůdě Rulandské modré (Handbook of Enology: The Chemistry of Wine ).Množství aminokyselin se mění, ale nejvíce aminokyselin bývá zpravidla před obdobím sklizně hroznů. Arginin a prolin mají největší zastoupení z aminokyselin (Ribérau-Gayon et al. 2006b ; Baroň 2010 ; Pavloušek 2011). Vzorec obecný pro aminokyseliny je následující: Obrázek 3- Obecný vzorec aminokyseliny (Ribérau-Gayon et al. 2006b) 17

Při různé cukernatosti moštu se mění i jeho potřeba na asimilovatelný dusík, což znázorňuje tabulka č. 3. Tabulka 3- Potřeby asimilovatelného dusíku (Pavloušek 2011) Cukernatost ve Brix Cukernatost ve NM Potřeba YAN v mg/l 21 20,2 200 23 22,4 250 25 24,7 300 3.4.3 Nedostatek asimilovatelného dusíku U silně filtrovaných a odkalených moštu, je nižší množství živin, a tím je vyšší pravděpodobnost problémů s kvašením. Pokud se v moštu nachází nízké množství asimilovatelného dusíku, pak to vede k tvorbě sirovodíku (H 2 S) ve vyšší míře a tím pádem k tvorbě sirky ve víně. Nedojde-li k infikování hnilobou hroznů, pak by měl mošt obsahovat pro kvašení na začátku dostatečnou výživu pro kvasinky. U hroznů, které jsou napadené hnilobou, je nižší množství dusíku, protože hniloba spotřebovává dusíkaté látky. Botrytis cinerea (původce šedé hniloby révy) dokáže spotřebovat až 50 % aminokyselin, které se nacházejí v hroznech. Při použití bentonitu může také dojít ke snížení aminokyselin (Pavloušek 2010). 3.5 Výživa kvasinek Co nejlepší aktivita kvasinek znamená ideální podmínky pro výživu. Kvasinková potřeba je především na amoniakální dusík a na aminokyseliny. V neposlední řadě potřebují i vitamíny, minerální látky a mastné kyseliny. Asimilovatelný dusík je rok od roku velmi proměnlivý a závisí na celé řadě faktorů. Některé faktory může vinohradník ovlivnit, jako například hnojení, odrůdu a další. Nebo to mohou být faktory, které jsou ve své podstatě neovlivnitelné. To je především ročník, který může být moc suchý nebo naopak může být příliš deštivý a podobně. 18

Existují vinařské firmy, které nabízí celou škálu přípravku pro výživu kvasinek. Například firma Lipera, která má sídlo ve Velkých Bílovicích takový sortiment nabízí. Některé přípravky zajišťují komplexní výživu pro kvasinky, jiné zase dodání konkrétní živiny, které je v moštu nedostatek. Je vhodné před každým zásahem do moštu či do vína nejdříve udělat rozbor v akreditované laboratoři. Akreditovaných laboratoří zabývající se analýzou hroznových moštů a vín je celá řada. Správně provedený zásah do moštu révy vinné a především ve správném okamžiku může vinaři ušetřit spoustu problémů. Stanovení YAN Asimilovatelný dusík (YAN) lze stanovit jednoduchou titrací, kdy stanovujeme celkový YAN nebo enzymaticky. Pomocí enzymatického stanovení YAN lze zjistit amonné ionty a aminokyseliny zvlášť. 3.5.1 Amonné ionty Jak již bylo popsáno v dřívější kapitole, jsou upřednostňovány kvasinkami. Na začátku kvašení je potřeba amonných iontů největší. Kvasinkám umožňuje zvýšení jejich populace, neboli rychlé a dobré rozmnožování. Amonné ionty jsou velmi levná volba výživy kvasinek, na trhu jsou v řádech pár desítek korun, nicméně při jejich použití jako při použití i jiných výživ vzrůstají náklady pro vinaře. Hovoříme o diamonium fosfátu a síranu amonném. Diamoniumfosfát je nachází ve výživné soli SIHA Gärsalz od firmy Lipera. Tento přípravek slouží k vyrovnání dusíku a fosfátu při jeho nedostatku ale hlavně k rozmnožování kvasinek, které probíhá rychleji. Dochází k lepší prokvašení moštu a vyššímu výtěžku alkoholu. Použití je velmi snadné. Výživná sůl se rozmíchá v malém množství šťávy nebo studené vody a přidá se do celého objemu moštu, poté dobře rozmíchat v celém objemu. Tím se zajistí přísun amonných iontů pro kvasinky. Dávkuje se 3 x 20 g / 100 l nebo při normální průběhu kvašení 100 g na 1 hl (Ribérau-Gayon et al. 2006b) (www.lipera.cz). 19

3.5.2 Komplexní výživa Tato výživa je obsáhlejší, protože sice obsahuje amonné ionty ale i další složky výživy pro kvasinky. Zpravidla to jsou amonné ionty, aminokyseliny, vitamíny, minerální látky. Velmi důležitým faktorem, které potřebují kvasinky k růstu a fermentaci je považován draslík. Významnou úlohu má draslík i při interakci s ostatními živinami, např. dusíkem. Pokud je v půdě vysoká hladina draslíku, podporuje to příjem dusíku (Dombeck et al. 1986). Tato výživa je o něco dražší než samotné amonné ionty. 3.5.3 Vitamíny K tomu, aby kvasinky optimálně rostly a přežily ve stresových podmínkách, jsou vitamíny nezbytné. Pokud je vitamínů nedostatek, dochází ke změnám kvašení. Základní dělení je na rozpustné ve vodě a rozpustné v tucích. Hlavní vitamíny zasahují do transportu látek, přeměně energie a působí jako doplňky enzymů (Dharmadhakari 1994). Mezi nejvýznamnější patří biotin (vitamín H), thiamin (vitamín B 1 ) a kyselina pantotenová (vitamín B 5 ). Každý vitamín má jinou funkci. Díky vitamínu H je množství kvasinek větší. Vitamín B 1 působí na rychlost fermentace moštu. Na biosyntéze sirnatých aminokyselin se podílí vitamín B 5 (Pavloušek 2010). Následující tabulka č. 4 ukazuje jednotlivé zastoupení hlavních vitamínů v moštu Tabulka 4- Vitamíny v moštu (Pavloušek 2010) Vitamín Obsah v moštu [mg/l] Biotin (vitamín H) 0,001 0,004 Kyselina pantotenová (vitamín B 5 ) 0,05 1,40 Thiamin (vitamín B 1 ) 0,150 0,450 Kyselina nikotinová (niacin, vitamín B 3 ) 0,7 2,6 Pyridoxin (vitamín B 6 ) 0,2 0,5 Kyselina askorbová (vitamín C) 30,00 50,00 20

Vitamín B1 (thiamin) Thiamin se běžně vyskytuje moštu révy vinné, pokud však byly hrozny napadeny šedou hnilobou nebo byl mošt tepelně ošetřen, pak ho bývá v moštu nedostatek a je na místě thiamin ve formě výživy přidat do moštu. Při jeho nedostatku může nastat až zastavení fermentace. Uplatňuje se při enzymatických reakcí, např. dekarboxyláza α- ketaglutarová kyselina. Tato reakce je důležitá při metabolismu sacharidů a aminokyselin (Ribérau-Gayon et al. 2006a ; Laho et al. 1970). Thiaminpyrofosfát a jeho strukturu leze vidět na obrázku č. 4. Obrázek 4- struktura thiaminpyrofosfátu (Ribérau-Gayon et al. 2006a) 3.5.4 Neaktivní kvasinky Jedná se o buňky kvasinek, které nejsou schopné života, i když jejich složení živin srovnatelné se suchými kvasinkami. Představují přirozený zdroj živin pro kvasinky. Neobsahují čisté amonium, tudíž se nevyužívají jako hlavní zdroj dusíku. Existuje celá řada přípravků, které obsahují mimo jiné neaktivní kvasinky. Například od firmy Lipera přípravek ACTIVE PLUS. Průměrná dávka tohoto přípravku je 25 g na 100 litrů (Trioli et al. 2009 ; www.lipera.cz). Buněčné stěny kvasinek Buňka je obklopena buněčnou stěnou, která tvoří asi 20-25% hmotnosti buňky. Určuje tvar buňky a poskytuje ochranu proti osmotickému tlaku. Stěna kvasinek je schopna reagovat na změny vnějších podmínek. Její tloušťka může být mezi 150-300 nm, obsahuje enzymy. 21

Často jsou buněčné stěny složeny z různých polysacharidových částí, na které jsou připojeny proteiny. Důležitost buněčné stěny je i při fermentaci vína. Na počátku fermentace jsou kvasinky v prostředí bohaté na živiny s nízkým ph ale s vysokým obsahem cukru, což je značná osmotická zátěž. Na konci fermentace se buňky nacházejí v prostředí, kde je to osmoticky více přijatelné ale je zde vyšší koncentrace ethanolu, což je pro mnoho organismů silně toxické a kromě toho se některé živiny mohou být vyčerpány. Navíc velmi často dochází i k teplotním výkyvům. Buněčná stěna kvasinek stojí mezi všemi těmito změnami, také samozřejmě cytoplazma a další organely (Hornsey c2007). 3.5.5 Tvorba sirovodíku (H 2 S) jinak Pokud mají kvasinky nedostatek asimilovatelného dusíku, pak to vede k tvorbě sirky ve víně. Vada vína, která je spojena s rychlým odumíráním kvasinek. H 2 S vzniká při autolýze kvasinek po primární fermentaci. Mošty, které mají nízký obsah amoniaku jsou náchylné k uvolňování H 2 S během fermentace. Může vzniknout tzv.,,sulfidová fermentace, které je třeba zabránit. Pokud H 2 S přetrvává po fermentaci, musí se víno provzdušnit za přítomnosti oxidu siřičitého. Když by ani toto nepomohlo, lze použít síran měďnatý. Pokud H 2 S vznikne, je třeba jej odstranit co nejdříve, jinak to vede např. ke změně aroma. V ideálních případech by mělo být víno skladováno v malých sudech, aby se na dně nevytvářely silné sedimenty, které vedou ke tvorbě H 2 S (Hornsey c2007). Vývoj sloučenin obsahujících síru je na obrázku č. 5. Obrázek 5- Vývoj sloučenin obsahujících síru v barelech v bílém víně (bez vad) na kalech (Ribérau-Gayon et al. 2006a) 22

3.5.6 Nadbytek výživy Při alkoholovém kvašení vzniká mimo jiné kyselina jantarová. Její velmi častý výskyt je při bouřlivém kvašení. Při odbourávání kyseliny jablečné vzniká hlavně kyselina jantarová a stává se tak pravidelným vedlejším produktem kvašení. Obsah kyseliny jantarové může být v průměru do 1 g/l. Největší obsah kyseliny jantarové je u vín červených, kdežto u vín bílých se hodnota kyseliny jantarové pohybuje okolo 0,7 g/l. Přispívá ke kyselosti vína. Senzoricky vnímaná jako slaná chuť, někdy se hovoří o kamenité chuti nebo je taky považováná za mineralitu vína (Steidl 2002). Mikrooxidace Velmi populární metoda okysličování plně prokvašeného vína. Jedná se o technologický postup, kdy se řízeně přidává přesně dané množství kyslíku do vína, aby se dosáhlo kladných změn v textuře vína, aromatu a fenolickém složení. Proces mikrooxidace probíhá dvojím způsobem. V dřevěných sudech probíhá přirozeně, v nerezových nádobách dochází k řízené mikrooxidaci. Obvykle 16 % kyslíku prochází přes póry dřeva, mezerami mezi dýhami prochází 63 % a zbytek 21 % projde přes zátku. Při procesu zrání vín Při řízené se do vína aplikují přesně dávky kyslíku a důležitý je taktéž přesný termín aplikace. Mikrooxidace má hlavní využití u výroby červených vín. Při výrobě bílých vín se mikrooxidace využívá také ale podstatně méně. Strukturní a harmonizační fáze probíjí v průběhu mikrooxidace. Nicméně mikrooxidace může mít i negativní vliv na kvalitu vína, pokud je kyslíku nepřiměřené množství. Neméně významné je v tomto procesu změna taninu. Mikrooxidace se může využívat v různých stádiích výroby vína (v průběhu zrání vína nebo po ukončeném kvašení) (Pavloušek 2010 ; Ribérau-Gayon et al. 2006a). Doplněk pro výživu u bílých vín mikrooxidace v první třetině kvasného procesu (konec růstové fáze) na 48 hodin v dávce 2 mg/l/48 hodin 23

4 MATERIÁL A METODY 4.1 Měřené odrůdy moštu révy vinné Rulandské bílé, Hibernal, Tramín červený 4.1.1 Popis odrůdy Rulandské bíle Název této odrůdy používaný v zahraničí je Pinot blanc. Tato odrůda s největší pravděpodobností pochází z Burgundska ve Francii, kde se nejspíš mutací vytvořila z Rulandského šedého (Pinot gris). Silně bělavě ochlupený vrchol mladého letorostu. Středně velký list, který je třílaločnatý a pětiúhelníkovitý. Řapíkový výkrojek je ve tvaru V, otevřený, ohraničený krajovým lemem vně žilky. Jedním z ampelografických znaků odrůdy Rulandské bíle je list. Hrozen této odrůdy je válcovitý středně velký až malý. Bobule v hroznu jsou uspořádány středně hustě až hustě. Středně velká až malá bobule, je kulatá nebo mírně podlouhlá. Žlutozelená barva slupky. Zlatavě žlutá je v době kvalitní zralosti. Bezbarvá, šťavnatá, sladká dužnina. Dužnina má jemné odrůdové aroma. Kvalitním odkalením suroviny omezíme přechod možných nežádoucích látek do vína. Příkladem jsou houbové choroby. Při odkalení poté přidáme kmen ušlechtilých kvasinek při teplotách 18-22 C. U hroznů s vynikající zralostí a vynikající zdravotním stavem lze vyrábět víno spontánním kvašením. Mírné odkalení a řízení teploty je vhodné. Lze nechat mošty kvasit v dřevěných sudech a ponechat tyto mošty na kvasnicích. Touto technologií lze dosáhnout aromaticky zajímavých plných vín. Pokud chceme kvalitní přívlastkové víno, pak musí být dosaženo všech parametrů na co nejvyšší úrovni. Cukernatost, aromatické látky, kyseliny a minerální látky na vysoké úrovni (Pavloušek 2007). 4.1.2 Popis odrůdy Hibernal Vyšlechtěná v Německu. Od roku 2004 je zapsána ve Státní odrůdové knize. Interspecifická odrůda, která má zvýšenou odolnost k houbovým chorobám. Velmi dobře odolává zimní mrazům. 24

Hladký vrchol mladého letorostu bez ochlupení. Zelené mladé lístky mají načervenalé okraje. Středně velký až velký list, který je slabě trojlaločnatý. Na horní straně puchýřnatá listová čepel. Hrozen této odrůdy je malý až středně velký, středně hustý až hustý, valcovitě kuležolovitý. Řidší hrozny a menší bobule se vyskytují na sušších půdách. Silné napadení šedou hnilobou u této odrůdy nebývá časté. Zdravé hrozny se ve výrobě vína pozitivně projeví. Silná slupka bobule a pevná slizovitá dužnina je u této odrůdy běžná. Enzymatické preparáty dovedou částečně rozložit slizovitou dužninu a tím pádem dochází k lepší výlisnosti hroznů. Pozitivně se to projeví i na aromatickém projevu budoucího vína. Odkalení moštu a následné použití aktivních suchých vinných kvasinek (ASVK). Důležité je sladit obsah alkoholu, kyselin a zbytkového cukru. Prokvašení absolutně do sucha není vždy na místě. Proto by se tyto parametry měly po celou dobu kvašení hlídat a ve správném okamžiku kvašení ukončit (Pavloušek 2007). 4.1.3 Popis odrůdy Tramín červený Původ této velmi staré odrůdy není jasný. U této odrůdy se používá velmi často v České republice označení pouze Tramín. Hustě plstnatý vrchol mladého letorostu. Okraj mladých lístků je načervenalý. Středně velký, nálevkovitý list. Středně hustě ochlupená spodní strana listové čepele. Povrch této listové čepele je puchýřnatý a tmavozelený. Malý až středně velký hrozen u odrůdy Tramín červený. U základu třapiny s křidélkem. Husté uspořádání bobulí v hroznu. Pevná a silná slupka, špinavě červená, šedočervená nebo slabě oranžová barva. Velmi výrazné kořenité aroma je u této dužniny. Kulaté bobule, mohou být i slabě oválné. Velmi oblíbená jsou přívlastková vína z této odrůdy. Důležité je vyrobit víno, které je v harmonické rovnováze aromatických látek, obsahu zbytkového cukru a kyselin. Pouze krátkodobá macerace při řízených teplotách umožní extrakci aromatických a také chuťových látek. Používají se čisté kultury kvasinek a kvašení probíhá při teplotách kolem 20 C. Vysoký extrakt ve víně je velmi žádoucí. Metodou chladného kvašení lze získat velmi aromatická vína, nicméně je třeba počítat, že u těchto vín je absence chuťové plnosti (Pavloušek 2007). 25

4.2 Metody 4.2.1 Stanovení titrovatelných kyselin Veškerými titrovatelnými kyselinami ve víně rozumíme sumu volných kyselin těkavých (mimo kyseliny uhličité), netěkavých a kyselých solí, které je možné zneutralizovat titrací hydroxidem sodným nebo draselným. Titrovatelné kyseliny byly stanoveny pomocí automatického titrátoru značky Titrtoline easy. Tento přístroj se skládá z ph metru, automatického dávkovače NaOH, byrety a kádinky s magnetickou míchačkou. 10 ml vzorku bylo odebráno pipetou do titrační baňky o objemu 50 ml, která byla doplněna o 10 ml destilované vody. Následně poté byla ponořena kombinovaná elektroda a bylo nastaveno magnetické míchadlo. Kombinovaná elektroda během titrace zaznamenávala změny hodnot ph. 0,1 mol/l roztoku NaOH postupně přidával automatický titrátor. Po celou dobu bylo měřený roztok míchán magnetickou míchačkou. Jakmile bylo dosaženo hodnot ph 8, došlo k ukončení titrace. Spotřebované množství roztoku NaOH v ml bylo hned poté odečteno (Balík 2011). x = a. f. 0,75 x = g.l -1 veškerých titrovatelných kyselin vyjádřených na jedno desetinné místo jako kyselina vinná a = ml spotřebovaného roztoku NaOH f = faktor roztoku NaOH Obrázek 6- Automatický titrátor Titroline easy (www.wtwkucerova.cz ) 26

4.2.2 Stanovení ph Hodnota ph je záporný dekadický logaritmus aktivity vodíkových kationů v moště nebo víně. Stanovujeme se ph-metrem, který se kalibruje tlumivými roztoky o známém ph. Měření probíhalo pouhým vložením elektrody do kádinky s moštem a výsledná hodnota byla odečtena z digitálního display. Po každém měření bylo nutné opláchnou elektrodu střičkou s destilovanou vodou. Výsledné hodnoty ph byly zaokrouhleny na dvě desetinná místa. Po skončení měření hodnoty ph bylo nutné opět opláchnout elektrodu střičkou a vložit ji zpět do uchovávacího roztoku (Balík 2011). 4.2.3 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku Automatickým titrátorem bylo stanoveno celkové množství asimilovatelného dusíku. 5 ml formaldehydu bylo přidáno do vzorku, který byl měřen. Měřený vzorek měl ph 8 z předešlého měření, kdy byly stanoveny veškeré titrovatelné kyseliny. Jakmile byl přidán formaldehyd, tak došlo k okamžitému poklesu ph. Titrováno bylo roztokem 0,1 mol/l NaOH. Během titrace docházelo k míchání pomocí magnetické míchačky (Balík 2011). m=(a-blank).f.140 [mg N.l -1 ] m množství dusíku v mg/l a - ml spotřebovaného roztoku NaOH f - faktor roztoku NaOH 4.2.4 Stanovení amoniakálního dusíku a dusíku obsaženého v alfaaminokyselinách 27

Amoniakální dusík: Enzym Glutamát dehydrogenáza (GlDH) katalyzuje kondenzaci amoniaku a α-ketoglutarátu na L-glutamát spolu s oxidací NADH (nikotin adenin dinukleotid). NH 3 + α-ketoglutarát + NADH+H (GLDH) L-glutamát + NAD + Pomocí oxidace NADH dochází ke snížení absorbance při 340nm. Toto je přímo úměrné množství NH 3 ve vzorku (International organization of vine and wine (OIV), 2008b). Alfa-aminokyseliny: Primární amino-skupiny jsou derivatizovány reakcí s o- ftaldialdehydem a N-acetyl-L-cysteinem (OPA/NAC) na formu isoindolů v médiu. Přítomnost těchto derivátů je detekován spektrofotometricky při 340 nm. Množství α- aminokyselin ve vzorku je absorbanci úměrná. Stanovení pomocí přístroje Miura One. Miura One je plně automatizovaný přístroj biochemický analyzátor. Ke každému stanovení bylo potřebné použít už hotové reagenty (vždy R1 a R2), které si autosampler automaticky naředil podle zadané metody spolu se vzorkem do kyvet. Po inkubační době přístroj změřil absorbanci a následně vyhodnotil. Vzorky byly vkládány do přístroje v mikrozkumavkách. spotřeba vzorků byla na každou metodu 5µL (International organization of vine and wine (OIV) 2008a). 28

Obrázek 7- Biochemický analyzátor Miura One (www.logotech-ise.com) 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Před každým zásahem do moštu je ideální znát jeho základní parametry. Díky tomu může enolog zvolit adekvátní přípravek pro odstranění nedostatků nebo vylepšení jakosti. Lze toho dosáhnout analýzou v laboratořích. Tabulka č. 5 uvádí přehled základních parametrů moštu u měřených odrůd vína. Brix lze přepočítat na NM a naopak. Vzorec pro výpočet NM je následující: NM = Brix. 1,158 4,26. Tabulka 5- Základní parametry moštu Odrůda Datum Titrovatelné kyseliny Celkový asimilovatelný dusík ph NM Rulandské 12.10.2016 10,1 g/l 329,43 mg/l 3,02 21,4 bílé Hibernal 19.10.2016 7,6 g/l 387,57 mg/l 3,55 21,8 Tramín červený 19.10.2016 10,9 g/l 289,29 mg/l 3,57 21,7 Grafy 1-4 znázorňují výčet rozdílů jednotlivých hodnot u měřených odrůd z tabulky č. 5- základní parametry moštu. 29

12 10 8 6 4 Rulandské bílé Hibernal Tramín červený 2 0 Titrovatelné kyseliny Graf 1-Titrovatelné kyseliny 450 400 350 300 250 200 150 Rulandské bílé Hibernal Tramín červený 100 50 0 Celkový asimilovatelný dusík Graf 2- Celkový asimilovatelný dusík 30

3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 3 Rulandské bílé Hibernal Tramín červený 2,9 2,8 2,7 ph Graf 3- ph 21,9 21,8 21,7 21,6 21,5 Rulandské bílé Hibernal Tramín červený 21,4 21,3 21,2 NM Graf 4- NM Následující tabulka byla vytvořena na základě tří měření, ze kterých byla vytvořena průměrná hodnota dusíku v alfa-aminokyselinách v moštu. 31

Tabulka 6- Naměřené hodnoty dusíku v alfa-aminokyselinách v moštu Odrůda Hibernal Rulandské bílé Tramín červený Obsah dusíku v alfaaminokyselinách 412,89 mg/l 252,63 mg/l 303,91 mg/l Jak ukazuje tabulka tabulka č. 7, nejvyšší hodnota amoniakálního dusíku byla naměřena v odrůdě Tramín červený, naopak nejmenší hodnota byla naměřena v odrůdě Ruladské bílé. Tabulka 7- Naměřené hodnoty amoniakální dusíku v moštu Odrůda Hibernal Rulandské bílé Tramín červený Obsah amoniakálního dusíku 104,13 mg/l 92,49 mg/l 114,54 mg/l Množství asimilovatelného dusíku je ukazatel toho, jak kvalitně bude probíhat fermentace. Jak uvádí Pavloušek, 2013: 150 mg/l YAN je minimální množství pro úspěšnou fementaci. Pokud by se takové množství v moště nevyskytovalo, docházelo by k značným problémům, jako je například váznoucí fementace nebo vznik sirky. V opačném případě, kdy je v moště dostatečné množství YAN a přesto bude dodána výživa v podobě komerčních preparátů, mohou nastat negativní účinky na mošt a následně na výsledné víno. Známé jsou například tvorby vyšších alkoholů a těkavých kyselin. Optimální množství je 200 mg/l YAN. Při takovém množství YAN ale i vyšším, jako je to u našich vzorků bývá běžnou praxí přidat zhruba v 1/3 - ½ výživu kvasinkám, ve formě organické například fosforečnanu amonného. Firma Lipera se sídlem ve Velkých Bílovicích má ve své nabídce takové přípravky. Přípravek SIHA PROFERM Plus obsahující kombinaci hydrogenfosforečnanu amonného, síranu amonného, vitamínu B 1 a stěny kvasničních buněk je možnou variantou. Tento kombinovaný přípravek se dá použít od ½ kvašení a dodá potřebné živiny a minerální látky a dochází ke kvalitnějšímu množení kvasinek. 32

Bylo zjištěno, že množství asimilovatelného dusíky ve všech moštech bylo dostačující k tomu, aby proběhla bezproblémová fermentace. Lze doporučit přidání do moštu odrůdy Rulandské bílé aktivní suché vinné kvasinky (ASVK), LALVIN D 47 je takový přípravek ASVK, který podpoří ovocný charakter u této odrůdy a napomůže rychlejšímu průběhu kvašení. Při použití ASVK je samozřejmě velmi důležité mošt naočkovat kvasinkami co nejdříve, v opačném případě může dojít k bakteriální kontaminaci nebo k množení nežádoucích divokých kvasinek. Dávkování v běžných podmínkách je 15 20 g/hl. Jak uvádí Pavloušek 20 u odrůdy Tramín červený by se výroba takového vína měla snažit dosáhnou vysoké extraktu. Proto se doporučuje jemné odkalení moštu a přidání kvasinkové kultury, která bude kvasit při teplotách kolem 20 C. LALVIN Cross Evolution je pro takové čisté kvašení vhodným přípravkem, u kterého dochází k výraznému uvolnění aroma a malé spotřebě živin. Odrůda Hibernal se pěstuje za účelem výroby vysoce kvalitních vín a možnost produkce biovína. U každé aplikace výživy pro kvasinky nebo čisté kultury kvasinek je nutné přečíst si příbalový leták, najít si potřebné technické informace. 6 ZÁVĚR Bakalářské práce se zaměřovala na výživu kvasinek během kvašení moštů révy vinné. Na začátku práce byly popsány a rozděleny kvasinky, které se v moštu vyskytují, jejich rozmnožování, původ a také jejich důležitost. Bez kvasinek, které přeměňují cukr na alkohol, by fermentace nebyla možná. Další neméně důležitá část práce byla věnována kvašení neboli fermentace. Od historie alkoholového kvašení, kdy probíhaly první zjištění tohoto procesu, přes různé způsoby kvašení, až po faktory, které ovlivňují průběh fermentace. Některé faktory, které jsou důležitější a některé nám fermentaci neovlivní tak rapidním způsobem. Zmíněné tam jsou faktory jak teplota, která je faktor nejdůležitější, dále cukr v moště, množství etanolu, kyslík a jeho vliv na průběh fermentace a oxid siřičitý. Velmi důležitá část práce byla zaměřena na dusík a na jeho různé formy. Především na asimilovatelný dusík, který mohou kvasinky využít. Jedná se o primární aminokyseliny a amonné ionty. Také zde je zmíněn nedostatek asimilovatelného dusíku. 33

Problematika asimilovatelného dusíku se dále odráží ve výživě kvasinek, kde se práce zaměřila i na vitamíny, komplexní výživu nebo také na neaktivní kvasinky. Poslední část bakalářské práce byla věnována experimentální části. Metodám stanovení titrovatelných kyselin, ph, celkovému asimilovatelnému dusíku, amoniakálního dusíku a dusíku v alfa aminokyselinách. Nakonec i možný návrh aplikace výživy, která nebyla u moštů odrůd Rulandské bílé, Hibernal a Tramín červený, úplnou nutností, protože asimilovatelný dusík ve všech případech byl dostačující. Je samozřejmě možné výživou podpořit kvasinky, urychlit jejich množení a zefektivnit celý proces fermentace. Další možností, které se velmi často využívá s kombinací výživy, je přidáním čisté kultury kvasinek. Takovéto kvasinky podpoří charakter vína. Je dobré mít na paměti, že každý zásah do moštu, který vinař provede, je lepší mít cílený a vědět proč to dělá, než dělat něco automaticky a někdy zcela zbytečně. Závěrem výrok mikrobiologa Louise Pasteura, který vystihl citátem, jakou mají mikroorganismy důležitost. Pánové, jsou to mikrobi, které mají vždy poslední slovo. Louis Pasteur 34