EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY Klára A. Mocová Laboratoř Ekotoxikologie a LCA Ústav chemie ochrany prostředí VŠCHT Praha
Toxikologie vs. ekotoxikologie Toxikologie zkoumá vlivy škodlivých látek na člověka testy na zvířatech příbuzných člověku (savci) Ekotoxikologie zkoumá vlivy škodlivin na veškeré organismy kromě člověka testy na mikroorganismech, rostlinách a zvířatech
Ekotoxikologický biotest Účastníci: zkoumaný vzorek (půda, voda, chemická látka) testovací organismus (bakterie, rostliny, živočichové)
Chemická analýza vs. biotest Chemická analýza určuje koncentraci látek (škodlivin) v prostředí (Kolik čeho) Biotest hodnotí reakci živých organismů na dané prostředí (jak a na koho působí.) Oba přístupy se doplňují
Kam ekotoxikologii zařadit? 1. Problém: havárie, stará zátěž, nové chem. látky, materiály a výrobky 2. Chemická analýza: (odběr vzorku vody, půdy, vzduchu; zjištění obsahu kovů a organických látek) 3. Ekotoxikologické biotesty: nasazení modelových organismů přímo do vzorků odebraných z prostředí nebo do média obsahujícího testovanou chemickou látku zjištění vlivu na organismy 4. Dekontaminační (sanační) práce: vyčištění lokality
Organismy v biotestech Producenti rostliny řasy, vodní rostliny, suchozemské rostliny Konzumenti živočichové vodní: perloočky, ryby suchozemští: roupice, žížaly, chvostoskoci Destruenti (rozkladači) baktérie, plísně vodní bakterie : Vibrio půdní enzymatická reakce
Ekotoxicita legislativa ČR Metodický pokyn odboru ke stanovení ekotoxicity odpadu (MŽP, 2007): pouze aquatické testy (vzorky vod či výluhy půd) testovací organismy: řasy hořčice perloočky ryby
Ekotoxicita mezinárodní Normované postupy (OECD, ISO atd.): aquatické a půdní testy krátkodobé i dlouhodobé speciální (genotoxické) všechny trofické úrovně (na rozdíl od ČR)
Testy na organismech - obecně Porovnávání růstu organismu ve vzorku s kontrolou inhibice růstu (0 100 %) stimulace růstu (záporné hodnoty %) Jak se hodnotí růst? - počet organismů, rychlost množení, rychlost růstu jednotlivců (např. délka kořene, hmotnost sušiny), úhyn organismů
(Eko)toxikologické indexy Toxikologie: LD50 dávka - koncentrace látky v organismu, při níž uhyne 50 % organismů Ekotoxikologie: LC50 koncentrace látky v prostředí, při níž uhyne 50 % organismů (obecně se v ekotoxikologii užívá indexu EC50 účinná (efektivní) koncentrace účinek látky je obecný, nemusí znamenat úhyn, ale inhibici růstu)
Problémy se vzorky Kontrola: vodné vzorky: roztok solí (kultivační voda) vs. výluh (vzorek) půdní vzorky: půda dobré kvality, nicméně se může velice lišit srovnatelnost??? nejjednodušší je test chemikálií Převádění půd na výluhy někde má smysl, ale použití vodních organismů vágní Ředění půd -???
Uspořádání biotestu Vzorek v koncentrační řadě např.: 0 (kontrola) - 0,1 1 10 100 1000 (mg/l; mg/kg ) Kultivační podmínky (teplota, osvětlení, zálivka, krmení) Doba trvání: 1 24 hod bakterie 2-7 dnů řasy, rostliny, akutní - zvířata 3 4 týdny dlouhodobé - rostliny, rozmnožovací - zvířata Sledování organismů: průběžně / na konci testu
Bakterie Vibrio fisheri
Půdní enzymy dehydrogenasová aktivita
Vodní bezobratlí Daphnia magna, Artemia salina
Ryby pstruh duhový, akvarijní ryby danio pruhované
Půdní kroužkovci žížaly, roupice
Půdní bezobratlí chvostoskoci
Unitární vs. modulární organismy
Řasový test Desmodesmus subspicatus
Řasový test v baňkách - ukončení
Řasový test - mikrodestička
Lemna minor L.
Okřehek jak to dělají jinde
Sledování počtu stélek ( lístků )
Velikost listové plochy obrazová analýza A B C A = původní foto B = označení a změření plochy listů C = binární obraz
Rozpad chlorofylu, nekróza
Test klíčivosti jílek (Lolium perenne L.)
Test klíčivosti měření délky kořene
Půdní testy metodika, organismy
toxikant: Cd (NO3)2
toxikant: CdCl2
Obrazová analýza měření růstu kořene binární obraz zeleně vymezený objekt (jetel) původní foto s měřítkem binární obraz ke zpracování
Digitální analýza obrazu NIS Elements
Testy genotoxicity Zaměřené na sledování poškození DNA (genů) Amesův test (geny, bakterie) Mikrojaderné testy (rozpad chromosomů, rostl. a živ. buňky) Kometový test (rozpad chromosomů, živočišné buňky)
Mocová, 2013 Amesův test
STAVBA EUKARYOTICKÉHO CHROMOSOMU
CHROMOSOMÁLNÍ ABERACE delece inverze translokace Cytogenetické vyšetření pacienta: šipkou vyznačeny některé aberace
Mikrojaderné testy Test genotoxicity (mutace, tj. chyby na DNA) Mikrojádro = úlomky chromosomů, které se nemohou rozdělit a tudíž předat do další generace buněk Přítomnost mikrojader v buňkách znamená mutagenní účinky testované látky (vzorku) Provádí se na rostlinách i živočiších
Mikrojaderné testy
Kometový test hodnotí fragmentaci DNA elektroforéza, fluorescenční barvení DNA fragmenty DNA migrují ven z buněk a vytváří ocas komety nepoškozená DNA zůstává přichycena na místě v gelu a vypadá jako tělo komety. Buňky ve tvaru komety jsou poškozené.
Kometový test Mocová, 2013
Poděkování Ing. D. Červený, Ing. Květa Fišerová, Ing. Hana Palková, Ph.D., Ing. Tomáš Sopr