Metody detekce poškození DNA

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Metody detekce poškození DNA"

Aleš Mareš
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 STABILITA GENOMU II. Metody detekce poškození DNA

2 Metody detekce poškození DNA Možnosti stanovení: 1. poškození DNA per se nebo 2. jeho následky mutace genů a mutace chromosomů

3 1. Detekce poškození DNA A: PŘÍMÁ detekce poškození, např. přítomnost DNA aduktů nebo zlomů existuje řada metod pro měření aduktů, např.: kovalentní vazba radiosloučenin 32 P postlabeling (včetně detekce pomocí hmotnostní spektrometrie (Accelerator Mass Spectrometry, AMS) imunologické metody stanovení specifických aduktů pomocí protilátek nástroje pro detekci zlomů vláken a chromosomálních aberací zahrnují např.: analýzu metafáze (karyotypizace) stanovení počtu mikrojader v buňce fluorescenční in situ hybridizace (FISH) elektroforetické metody jako je kometový test Comet assay B: NEPŘÍMÁ detekce poškození skrze měření opravných procesů DNA např. stanovení specifických markerů poškození DNA

specifických aduktů pomocí protilátek nástroje pro detekci zlomů vláken a chromosomálních aberací zahrnují např.

4 Metody přímé detekce poškození DNA 1. stanovení DNA aduktů dodatečným značením 32 P postlabeling 2. kometový test Comet assay

5 32 P postlabeling metoda umožňuje simultánní stanovení řady různých typů DNA aduktů citlivost detekce až 1 modifikovaný nukleotid v v méně než 10 µg DNA (v kombinaci s imunoafinitními metodami) Princip: enzymatické štěpení DNA na nukleotidy (preselekce DNA aduktů pro zvýšení citlivosti) 5 značení nukleotidů izotopem fosforu γ 32 P ATP ( 33 P) chromatografická separace a detekce značených produktů (TLC/PE celulosa).

enzymatické štěpení DNA na nukleotidy (preselekce DNA aduktů pro zvýšení citlivosti) 5 značení nukleotidů

6 32 P postlabeling pokrač. Common methods of 32 P postlabelling. X, adducted or modified nucleosides; N, normal nucleosides; p, a non radioactive phosphate group; p, a phosphate group containing 32 P. D.H. Phillips/Mutation Research

7 Comet assay vyvinuta 1984 Johansonem a Oeslingem denaturační modifikace (Singh et al.) umožňuje sledovat poškození DNA individuálních buněk principem je gelová elektroforéza buněk Postup: 1. buňky jsou zality do agarózy na mikroskopické podložní sklo 2. lýza pro uvolnění DNA 3. elektroforéza 4. vizualizace barvením DNA fluoroforem DNA fragmenty pocházející ze zlomů migrují rychleji a vytvářejí fluorescenční obraz připomínající kometu.

buňky jsou zality do agarózy na mikroskopické podložní sklo 2. lýza pro uvolnění DNA 3. elektroforéza 4.

8 Comet assay pokrač. délka chvostu spolu s dalšími znaky udávají rozsah poškození pro kvantifikaci je dostupné komerční software varianty metody umožňují rozlišit jednovláknové a dvouvláknové zlomy většinou se používají lidské lymfocyty, ale je možné použít jakékoliv eukaryotní buňky

kvantifikaci je dostupné komerční software varianty metody umožňují

9 2. Detekce následků poškození DNA mutací chromosomů přímou vizualizací chromosomálních anomálií cytogenetické metody genů přímo (sekvenování) nepřímo pomocí indikátorů změny fenotypu analýza genových mutací (princip testů mutagenicity Amesův test)

genů přímo (sekvenování) nepřímo pomocí indikátorů změny

10 Metody detekce následků poškození DNA 1. Cytogenetické metody 2. Analýza genových mutací

11 Cytogenetika analýza karyotypu (metafázová analýza) celkový počet chromosomů počet pohlavních chromosomů přítomnost či absence jednotlivých chromosomů povaha a rozsah chromosomálních aberací klonální evoluce

chromosomů přítomnost či absence jednotlivých

12 Cytogenetické metody 1. Chromosome banding (1970) 2. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) (1990) 3. Spectral Karyotyping (SKY) 4. Comparative Genomic Hybridization (CGH)

13 1. Chromosome banding G banding Postup: metafázové (kondenzované) chromosomy izolované z proliferujících buněčných kultur jsou kontrolovaně natráveny trypsinem a obarveny chemickou barvou vázající DNA (Giemsa) tmavé pásy ( G bands ) obsahují kondenzovanější chromatin Detekční limit: ~ 5 10 Mb

natráveny trypsinem a obarveny chemickou barvou vázající DNA (Giemsa)

14 2. Fluorescence in Situ Hybridization (FISH) umožňuje přímou detekci poškozené DNA (dvouvláknových zlomů) nebo následků poškození DNA (chromosomální aberace) je možné vizualizovat jednotlivé geny či celé chromosomy rozlišení je závislé na velikosti použité sondy (BAC, cosmid; 3 5 Mb) Princip: fluorescentní sonda je hybridizována ke komplementární (denaturované) sekvenci DNA metafázových nebo interfázových chromosomů poloha sondy na chromosomu je pozorována fluorescenčním mikroskopem

cosmid; 3 5 Mb) Princip: fluorescentní sonda je hybridizována ke komplementární (denaturované) sekvenci DNA metafázových nebo

15 Sonda proti genu na chromosomu 8 Sonda proti alterovaným telomerám Sonda proti centromerám Příklady FISH Sonda proti celému chromosomu

16 3. Spectral Karyotyping SKY Chromosome painting; Multiplex FISH M FISH směs DNA sond složených z velkého počtu fluorescenčně značených fragmentů jednotlivého chromosomu. Po hybridizaci fluoreskuje celý chromosom. kombinatoriální značení chromosom specifických sond více než jedním fluoroforem umožní definovat celý karyotyp (každému chromosomu je přiřazena pseudobarva) aberace jsou pak snadno detekovány podle počtu barevných oblastí v chromosomech Normální buňka Nádorová buňka

kombinatoriální značení chromosom specifických sond více než jedním fluoroforem umožní definovat celý karyotyp (každému

17 Příklady SKY Karyotypy nádorových buněk Normální karyotyp VL/GG/sky.html Detekční limit: 1.5 Mb

18 4. Comparative Genomic Hybridization (CGH) relativně nová molekulárně cytogenetická technika odvozená od FISH celogenomové zobrazení chromosomálních imbalancí Princip: testovaná DNA a referenční DNA jsou označeny odlišnými fluorofory a kohybridizovány na representační genom (metafázový roztěr cytogenetická varianta CGH nebo genomový array microarray CGH) poměr fluorescenčních signálů detekuje variace v počtu kopií DNA

označeny odlišnými fluorofory a kohybridizovány na representační genom (metafázový roztěr cytogenetická

19 Cytogenetická varianta CGH ccgh Princip: označení testované a referenční DNA odlišným fluoroforem hybridizace obou vzorků společně na normální metafázový roztěr Tumour DNA (Red) Relativní množství testované či referenční DNA vázané na daný lokus závisí na relativním poměru množství obou sekvencí lze identifikovat duplikace a delece. Normal DNA (Green) Normal control metaphases FISH (48-72 hrs) CGH image capture red, green dapi myc amplification on 8q24 in COLO 320 HSR karyotype ratio Detekční limit: 3 8 Mb Kallioniemi et al. (1992) Science 258:

množství obou sekvencí lze identifikovat duplikace a delece.

20 Interpretace ccgh

21 Limity rozlišení ccgh zachytí pouze velké (3 10 Mb) chromosomální imbalance nedokáže rozlišit vyvážené změny uspořádání chromosomů (např. reciproční translokace či inverze, změny ploidity)

22 Array CGH acgh Princip: příprava mikroarraye BACů pokrývajících celý lidský genom fl. značení testované (např. z tumoru) a referenční DNA Cy3 acy5 dctp hybridizace arraye, detekce signálu (až hodnot z jednoho vzorku) Normální buňky Abnormalní buňky Určení poměru signálů na každém fragmentu genomové DNA (BAC) DNA sonda 1 DNA sonda 2

23 Interpretace acgh porovnává se log 2 poměrů normálního a testovaného vzorku pro předem specifikovaný segment genomu klon teoretické log 2 poměry: zisk 1 kopie (duplikace) = log(3/2) = 0.58 neutrální = log (2/2) = 0 ztráta 1 kopie (delece) = log(1/2) = 1 Ishkanian et al. (2004) Nat. Genet. 36: Detekční limit: >1Mb

24 Limity rozlišení acgh neposkytuje informace o lokalizaci sekvence, které ovlivnily počet kopií chromosomální aberace, které nemají za následek změnu počtu kopií (vyvážené translokace) nejsou detekovány heterogenní buněčné populace (např. směs nádorových a normálních stromálních buněk) může falešně udávat frakcionální rozdíl v počtu kopií

25 Srovnání metod pro stanovení chromosomálních aberací Albertson DG et al.,2003 Nat Genentics, 34;369

26 Analýza genových mutací existuje velká řada variací (mutagenicity) obvykle se jedná o selekci reverze u kmene se specifickými nutričními nároky, odlišnými od divokého kmene (auxotrofní mutanty) pravděpodobně nejužívanějsí metodou pro detekci mutagenicity v mikroorganismech je Amesův test v lidských buňkách (lymfocytech) pak hypoxanthinfosforibosyltransferázový test (HPRT assay)

27 Amesův test Princip: sleduje reverzi v sadě histidinových auxotrofů Salmonella typhimurium bakterie jsou vystaveny testované chemikálii a vysazeny na kultivační médium neobsahujícím histidin pokud je látka mutagen, bakterie rostou a vytvoří kolonie může být použito několik geneticky odlišných kmenů, takže mohou být detekovány reverze vzniklé např. substitucí párů bází nebo mutacemi čtecího rámce Pozitivní Amesův test rostoucí kolonie S. typhimurium

Podobné dokumenty

Cytogenetika. chromosom jádro. telomera. centomera. telomera. buňka. histony. páry bazí. dvoušroubovice DNA

Cytogenetika. chromosom jádro. telomera. centomera. telomera. buňka. histony. páry bazí. dvoušroubovice DNA Cytogenetika telomera chromosom jádro centomera telomera buňka histony páry bazí dvoušroubovice DNA Typy chromosomů Karyotyp člověka 46 chromosomů 22 párů autosomů (1-22 od největšího po nejmenší) 1 pár