Uplatněná metodika EP 9058 UM 1 - název: Postup při stanovení nového ukazatele mikrobiologické kvality syrového kravského mléka (MPAS) pro výrobu nových mlékárenských výrobků Uplatněná metodika a postup pro stanovení a odhad mikrobiologických ukazatelů syrového mléka jako nového ukazatele při výrobě speciálních mléčných výrobků. Cíl uplatněné metodiky: Cílem metodiky je zajištění vhodné suroviny pro výrobu náročnějších mléčných výrobků, stanovení a odhad výskytu sporotvorných psychrotrofních a mezofilních mikroorganismů na základě hodnotících mikrobiologických ukazatelů pro proplácení syrového mléka (CPM celkový počet mezofilních mikroorganismů) nebo doplňkových ukazatelů (TRM počet termorezistentních mikroorganismů). Náplň uplatněné metodiky: Implementace dosažených výsledků, získaných na základě předchozího výzkumu a vývoje v rámci řešení projektu NAZV, MZe-ČR, EP 9058. Zdroj uplatněné metodiky: projekt NAZV, MZe-ČR, EP 9058, Potravní patogeny rodu Bacillus v mléce, metoda odhadu a redukce jejich průniku do potravního řetězce. Zpracovali dne: 10.1.006 Marcela Vyletělová, Oto Hanuš Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Akreditovaná Zkušební laboratoř č. 140 Národní referenční laboratoř pro syrové mléko (NRL-SM) Referenční laboratoř pracovní sítě referenčních mléčných laboratoří ICAR-CECALAIT Uplatnění bylo provedeno zavedením všech principů metodiky od 1.1. 001
Postup při stanovení nového ukazatele mikrobiologické kvality syrového kravského mléka (MPAS) pro výrobu nových mlékárenských výrobků Důležitost stanovení nových dodatkových ukazatelů při výrobě náročnějších mlékárenských produktů S rozvojem mlékárenského průmyslu a s vývojem výroby nastává potřeba přizpůsobit se hygienickým podmínkám nových mléčných výrobků. Pro syrové kravské mléko platí v současné době pro příjem syrového mléka do zpracovatelského podniku.hlavní hygienický ukazatel CPM (celkový počet (mezofilních) mikroorganismů) < 100 000 CFU/ml (Vyhláška 0/00 Sb.). V projektu mlékárny PMV Zábřeh s.r.o., byla v ČR v r. 001 zavedena výroba čerstvého konzumního mléka s prodlouženou trvanlivostí technologií PURE-LAC (APV a Elopak). Zavedení této koncepce a výroby úzce souvisí nejen s ekonomikou, ale také s kvalitou mléčné suroviny. Sledování ukazatele MPAS (mezofilní a psychrotrofní aerobní sporuláty) je zaměřeno na redukci technologicky obtížných sporulujících mikrooganismů, zejména bacilů (Bacillus cereus a dalších) v syrovém mléce, neboť jsou schopné ve formě biologicky inaktivních spor přežít ošetření a následným pomnožením ve výrobku ohrozit jeho kvalitu (rozklad tuku a bílkovin) nebo zdraví spotřebitele (potravní patogeny a toxiny). Vhodnost použití metodiky Počet MPAS není v ČR legislativně nijak zakotven ani definován v příslušných hygienických standardech (např. ČSN 57 059, Vyhláška 0/00 Sb.) pouze termorezistentní mikroorganismy (kultivace po inaktivaci při 85 C po 10 min.) nebo anaerobní sporuláty v syrovém mléce viz tab. 1. Není tomu tak ani v základních EU standardech. Je specificky spjat s technologií PURE-LAC, se kterou byl v podstatě dodán a zaveden (TEI 118; Methods in food science microbiology; Psychrotrophic and mesophilic aerobic bacterial spores in milk) a to včetně diskriminačního limitu < 00 CFU/ml. Lze ho proto označit za ukazatel konvenční. Zahrnuje především sporulující mikroorganismy rodu Bacillus.Navržená metodika je vhodná pro prvovýrobce i zpracovatele syrového kravského mléka. Využitelnost metodiky v prvovýrobě mléka zajistí eliminaci mikrobiologické kontaminace sledovaného ukazatele a zpracovatelé mléka mohou rychlým stanovením (metodou odhadu) zaručit vhodnou surovinu pro následné mléčné výrobky při zpracování mléka.
Tabulka 1: Hlavní, doplňkové a ostatní mikrobiologické ukazatele kvality syrového mléka hlavní doplňkový Celkový počet mezofilních 100tis. CFU/ml Celkový počet psychrotrofních 50tis. CFU/ml Koliformní 1000 CFU/ml Termorezistentní 000 CFU/ml Sporotvorné anaerobní neg v 0,1ml Odběr vzorků mléka Vzorek mléka je odebírán z bazénového mléka do sterilních vzorkovnic o objemu nejméně 0 ml. Odběr vzorků může být prováděn při pravidelném odběru pro stanovení hlavních ukazatelů kvality mléka. Transport vzorků do laboratoře je nutný za teploty 4.0 C ± 1 C. Při vyšších teplotách v letním období je odběr prováděn do vzorkovnic s konzervačním Heeschenovým činidlem (HEESCHEN et al. 1969; PETTIPHER & RODRIGUES 198) v poměru 1 : 10. Stanovení sledovaného ukazatele Postup analýzy pro stanovení počtu MPAS je prováděn podle předpisu PMV Zábřeh. Syrové vzorky mléka jsou devitalizovány při 80-8 C ± 1 C po dobu 0 minut a dále inkubovány pro mezofilní při 0 C ± 1 C / dny a psychrotrofní při 7 C ± 1 C /10 dnů. Médium pro kultivaci obsahuje: trypton 5,0 g kvasniční extrakt,5 glukózu 1,0 g agar 15,0 g škrob 1,0 g voda 1000 ml Poznámka: i když se požadovaný ukazatel označuje jako psychrotrofní, ale předepsaná kultivační teplota odpovídá podmínkám inkubace pro psychrofilní mikroorganismy, zůstává vzhledem k zažitému používanému pojmu název: psychrotrofní aerobní sporotvorné mikroorganismy.
Metoda odhadu Celkový počet mezofilních mikroorganismů x MPAS V souvislosti s novým hygienickým ukazatelem pro potřeby mlékárny PMV Zábřeh byl pravidelně monitorován od září roku 000 doplňkový hygienický ukazatel MPAS a CPM. Od počátku roku 001 splnilo tento ukazatel (MPAS) následovné procento dodavatelů: leden 1%, únor 77 %, březen 54% a duben 61%. Září 000 až leden 001 byla provedena statistická analýza lineární regrese mezi počtem MPAS a CPM. Korelační koeficient r = 0, (P < 0,001) signalizuje významný vztah (graf 1, a ). Vzhledem k této významnosti byl vypočten poměrný index (poměr reálných hodnot MPAS a CPM), který byl p i = 0,04, dále hodnot MAS/CPM a PAS/CPM. Poměrný index byl p i = 0,019 a p i = 0,005. Pro rychlý odhad počtu MPAS v mléce to znamená, že v případě CPM 50 000 CFU/ml lze očekávat 1 00 CFU/ml MPAS, 950 CFU/ml MAS a 50 CFU/ml PAS. V tabulce jsou uvedeny odhadované počty MPAS a dále mezofilních aerobních sporulátů (MAS) a psychrotrofních aerobních sporulátů (PAS) podle výsledků CPM. Graf 1: Korelace mezi CPM a MPAS (n=85) log MPAS 5 4 1 y = 0,444x + 0,41 R = 0,101 r = 0,*** n = 85 0 4 5 6 log CPM Graf : Korelace mezi CPM a MAS (n=85) 4
log MAS 5 4 1 y = 0,55x - 0,149 R = 0,0947 r = 0,*** n=85 0 4 5 6 log CPM Graf : Korelace mezi CPM a PAS (n=85) log PAS,5,5 1,5 1 0,5 0 y = 0,148x + 0,946 R = 0,0141 r = 0,1 n=85* 4 5 6 log CPM Tabulka : Odhad počtů MPAS, MAS a PAS CPM (cfu/ml) MPAS MAS PAS p i = 0,04 p i = 0,019 p i = 0,005 10000 40 190 50 0000 70 570 150 50000 100 950 50 70000 1680 10 50 100000 400 1900 500 00000 4800 800 1000 400000 9600 7600 000 Přílohy a seznam použitých podkladů Normy a vyhlášky uvedené v sestavené metodice ČSN 57 059: Syrové kravské mléko pro mlékárenské ošetření a zpracování. Praha, 1997. Vyhláška 0/00 Sb.: Vyhláška o veterinárních požadavcích na mléko a mléčné výrobky. Vyhláška ze dne 0. června 00. 5
Literatura HEESCHEN, W., REICHMUTH, J., TOLLE, A., ZIEDLER, H. (1969): Preservation of milk samples for bacteriologic and cytologic examinations and examinations for inhibitors. Milchwissenschaft, 4, 1969: 79-74. PETTIPHER, G. L., RODRIGUES, U.M. (198): A BACTERIOSTATIC MIXTURE FOR MILK SAMPLES AND ITS EFFECT ON BACTERIOLOGICAL, CYTOLOGICAL AND CHEMICAL COMPOSITIONAL ANALYSIS. J. Appl. Bact., 5, 198: 59-65. VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O., BENDA P., KOPUNECZ P. (1998): Psychrotrophic and total bacteria counts in raw cow s milk. Veterinářství, 9 (48): 7-74. VYLETĚLOVÁ M. (1998): Stanovení celkového počtu psychrotrofů v bazénových vzorcích mléka svozné oblasti severní a střední Moravy. Výzkum v chovu skotu, 4: 9-1. VYLETĚLOVÁ M., BENDA P., HANUŠ O., KOPUNECZ P. (1999): Determination of total counts of psychrotrophic bacteria in pool milk samples and their relation to total counts of microorganisms. Czech J. Food Sci., 17: 16-. Publikace výsledků k uplatněné metodice VYLETĚLOVÁ M. (000): Bakteriální kontaminace ve vztahu k některým složkám syrového a pasterovaného mléka. In Den mléka 000 : sborník referátů z konference Katedry chovu skotu a mlékařství, ČZU Praha: 4-46. VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O. (000): Mikrobiologická kontaminace syrového kravského mléka. Náš chov, 6: 7. HANUŠ, O., KOLÁŘ, A., VYLETĚLOVÁ, M., PUR, I. (001): Čerstvé konzumní mléko s prodlouženou trvanlivostí nová kvalitní potravina pro lidskou výživu. In Nové trendy v organizačních, technologických a hygienických postupech nákupu syrového mléka v kontextu podmínek EU: sborník referátů OAK Šumperk: 81-104. VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O., PÁČOVÁ Z., ROUBAL P., KOPUNECZ P. (001): Frequency of Bacillus bacteria in raw cow s milk and its relation to other hygienic parameters. Czech J. Animal Sci.: 46 (6): 60-67. VYLETĚLOVÁ M. (001): Výskyt a redukce sporotvorných bakterií rodu Bacillus v prvovýrobě a po pasteraci. In Nové trendy v organizačních, technologických a hygienických postupech nákupu syrového mléka v kontextu podmínek EU: sborník referátů OAK Šumperk: 75-79. VYLETĚLOVÁ M. (001): Výskyt bakterií rodu Bacillus v syrovém, pasterovaném a UHT mléku. Náš chov, 5: 16-17. VYLETĚLOVÁ M. (001): Výskyt sporotvorných aerobních mikroorganismů v syrovém, pasterovaném a UHT mléku. Bulletin Výzkumného ústavu pro chov skotu, Rapotín, Výzkum v chovu skotu, 4: 7-10. HANUŠ, O., KOLÁŘ, A., PUR, I., VYLETĚLOVÁ, M. (00): Rozšíření mléčného potravinového spotřebního sortimentu v ČR a lokální kvalita suroviny. In Den mléka 00 : sborník referátů z konference, Praha, ČZU Praha: 44-49. HANUŠ, O., VYLETĚLOVÁ, M., PUR, I., KOLÁŘ, A. (00): Nová technologie zpracování mléka. Náš chov, : 5-7. VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O., OPRAVILOVÁ J. (00): Redukce mikroorganismů rodu Bacillus v syrovém mléce před pasterací. Náš chov, 9: 8-9. VYLETĚLOVÁ M., ŠVEC P., PÁČOVÁ Z., SEDLÁČEK I., ROUBAL P. (00): Occurrence of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis strains in the course of UHT milk production. Czech J. Anim. Sci., 47: 00-05. PÁČOVÁ Z., ŠVEC P., STENFORS L.P., VYLETĚLOVÁ M., SEDLÁČEK I. (00): Isolation of the psychrotolerant species Bacillus weihenstephanensis from raw cow s milk. Czech J. Anim. Sci., 48 (): 9-96. 6
VYLETĚLOVÁ M., GODIČ-TORKAR K., ŠVEC P. (00): Characterization of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis strains isolated in the proces of UHT milk production. PO. Bacillus satelite symposium at FEMS Congress, Ljubljana, Slovenia, 9. 6.. 7. 00, Programme book:. Předání uplatněné metodiky Postup při stanovení nového ukazatele mikrobiologické kvality syrového kravského mléka (MPAS) pro výrobu nových mlékárenských výrobků Vyvinutá uplatněná metodika byla předána do užívání v písemné formě ing. Radkovi Musilovi, výkonnému řediteli Svazu výrobců mléka a.s., Šumperk, dne 1.1.006. Přílohy, dokumenty a doklady Technická řešení a postupy této uplatněné metodiky byly zčásti převzaty z vědecké a odborné literatury a zejména podpořeny výsledky vlastního výzkumu, které byly postupně publikovány a jako dokladové materiály mohou tvořit přílohu tohoto metodického materiálu. Datum: 11. 1. 006 Za zhotovitele: RNDr. Marcela Vyletělová, Ph.D. Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Za uživatele: Ing. Radek Musil Svaz výrobců mléka a.s. 7