Nový postup stanovení N-(2-hydroxyethyl)valinu v globinu pracovníků exponovaných ethylenoxidu J. Mráz, I. Hanzlíková, Š. Dušková, L. Dabrowská, H. Chrástecká, M. Tvrdíková, R. Vajtrová Státní zdravotní ústav, Praha
Ethylenoxid (E) C H 2 CH 2 Fyzikálně-chemické vlastnosti za normální teploty plynná látka (bod varu 10,7 o C) neomezeně rozpustný ve vodě za nízkých koncentrací bez zápachu chemicky reaktivní krátký biologický poločas (10-40 min) Použití meziprodukt v chemickém průmyslu sterilizace zdravotnického materiálu Zdroje expozice sterilizace zdravotnického materiálu chemické výroby a petrochemie cigaretový kouř expozice ethylenu
Akutní účinky (při vysokých koncentracích) mírné dráždění očí, sliznic, dýchacích cest bolesti hlavy, nevolnost Mutagenita, genotoxicita a karcinogenita mutagenní a genotoxický in vitro a in vivo profesionální expozice: leukemie, lymfomy, nádory i v dalších orgánech (???) chromosomové aberace karcinogen třídy 1 (IARC) Přípustný expoziční limit (PEL) 1 mg/m 3 (ČR), ostatní státy často 1 ppm (1.8 mg/m 3 ) Čichový práh 700 mg/m 3 (tj. zápach nevaruje před nadměrnou expozicí)
Hodnocení profesionální expozice chemickým látkám Monitorování škodlivin v pracovním ovzduší nebo biologické monitorování? 4
Přeměny E v organismu: možnosti pro biologického monitorování? Konzultační den SZÚ, Praha, 21.9.2017
Proč adukty s globinem? Vhodná náhrada za adukty s DNA Dlouhodobá persistence v organismu po celou dobu života erythrocytů (u člověka ca. 125 dní) Dostupnost v dostatečném množství (140 mg/ml krve) Zavedené analytické postupy Doporučené pro hodnocení expozice na pracovištích (biologické limity, BET) Použitelné pro alkylační činidla (např. epoxidy), arylaminy, isokyanáty, N,N-dimethylformamid
Vazba E na nukleofilní aminokyseliny globinu Val Cys His HS N N H 2 Globin E H N N H S H E-adducts in globin N-(2-hydroxyethyl)valin (HEV)
Stanovení 2-(hydroxyethyl)valinu v globinu Modifikovaná Edmanova degradace (MED) + GC/MS N-(2-Hydroxyethyl)valin (HEV) H S N N H H N C S E-adducts in globin F 5 PFPITC H H HN N S S N N F 5 F 5 1-(2-hydroxyethyl)-5-isopropyl- 3-pentafluorophenyl-2-thiohydantoin (2-HE-PFPTH) Törnqvist et al. 1986
Stanovení HEV v legislativě ČR Vyhláška MZ č. 432/2003 Sb v platném znění (107/2013 Sb.), kterou se stanoví podmínky pro zařazování prací do kategorií, limitní hodnoty ukazatelů BET, podmínky odběru biologického materiálu pro provádění BET a náležitosti hlášení prací s azbestem a biologickými činiteli Příloha č. 2 Limitní hodnoty ukazatelů BET Tabulka č. 2 Limitní hodnoty ukazatelů biologických expozičních testů v krvi Látka v krvi Ukazatel Limity Doba odběru Ethylenoxid N-(2-Hydroxyethyl) valin v globinu 0,3 µg/g globinu 1,9 nmol/g globinu nerozhoduje
Stanovení HEV v globinu osob exponovaných E (pracovníci průmyslové sterilizovny, n=14) měření MED(2/2012) Vzorek HEV (nmol/g glob) H040 3.1 H041 3.8 H042 6.1 H043 5.4 H044 7.7 H045 4.7 H046 6.8 H047 2.8 H048 8.1 H049 4.6 H050 1.4 H051 4.6 H052 0.6 H053 4.9
Stanovení HEV v globinu osob exponovaných E (pracovníci průmyslové sterilizovny, n=14) měření MED(2/2012) Vzorek HEV H040 3.1 H041 3.8 H042 6.1 H043 5.4 H044 7.7 H045 4.7 H046 6.8 H047 2.8 H048 8.1 H049 4.6 H050 1.4 H051 4.6 H052 0.6 H053 4.9 (nmol/g glob)
Konzultační den SZÚ, Praha, 21.9.2017 Špatná reprodukovatelnost stanovení HEV metodou MED pravděpodobná příčina: malá robustnost metody Princip metody MED: derivatizace s nekompletním výtěžkem, který závisí na reakčních podmínkách Požadován reprodukovatelný výtěžek derivatizace - vlastního globinového aduktu - kalibračního standardu - vnitřního standardu Alternativní postup stanovení HEV? Totální kyselá hydrolýza globinu (AH) + HPLC/MS univerzální metoda pro stanovení stabilních aduktů v proteinech
Kyselá hydrolýza (AH) globinu H HEV v globinu HEV H AH H 5 mg globinu přídavek vnitřního standardu (HEV-d 4 ) 1 ml 12 M HCl hydrolýza 100 C x 16 h odfoukání HCl dosucha rozpuštění odparku HPLC/MS analýza
Stanovení HEV v globinu osob exponovaných E (pracovníci průmyslové sterilizovny, n=14)
R (HEV/HEV-d4) Konzultační den SZÚ, Praha, 21.9.2017 ptimalizace podmínek hydrolýzy při stanovení HEV Vliv doby hydrolýzy na výtěžek HEV (analýza exponovaného globinu) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Doba hydrolýzy (h)
80 C/2 h 100 C/2 h 120 C/2 h 80 C/16 h 100 C/16 h 120 C/16 h 80 C/2 h 100 C/2 h 120 C/2 h 80 C/16 h 100 C/16 h 120 C/16 h R (HEV/HEV-d4) Plocha píku Konzultační den SZÚ, Praha, 21.9.2017 ptimalizace podmínek hydrolýzy při stanovení HEV Vliv teploty a doby hydrolýzy na výtěžek HEV (analýza exponovaného globinu) 1,0 0,8 5000 4000 HEV HEV-d4 0,6 3000 0,4 2000 0,2 1000 0,0 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
80 C/2 h 120 C/2 h 80 C/16 h 100 C/16 h 120 C/16 h 80 C/2 h 120 C/2 h 80 C/16 h 100 C/16 h 120 C/16 h R (HEV/HEV-d4) Plocha píku Konzultační den SZÚ, Praha, 21.9.2017 ptimalizace podmínek hydrolýzy při stanovení HEV Vliv matricového efektu (konstantní přídavky HEV a HEV-d 4 ke kontrolnímu globinu) 1,4 1,2 1,0 0,8 8000 6000 4000 HEV HEV-d4 0,6 2000 0,4 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
R (HEV/HEV-d4) Konzultační den SZÚ, Praha, 21.9.2017 Reprodukovatelnost stanovení HEV 10 vzorků kontrolního globinu s konstantními přídavky HEV a HEV-d 4 1,5 1,3 1,1 0,9 0,7 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Účast na MPZ (G-EQUAS, University of Erlangen) 1/2017 7/2017
Poděkování Projekt institucionálního výzkumu RV-SZÚ (2016 2017) European Regional Development Fund (ERDF) IP Reg. No. CZ.1.06/3.2.01/11.08435.