SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY

SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY

využívají se k izolování (separaci) dokazované nebo stanovované složky z analyzované směsi a k odstranění rušivých (interferujících) komponent analyzovaného roztoku (účel získání čistých složek) k získání co nejčistší biologické látky v dostatečném množství. Dříve dílo náhody, dnes vysoce racionální postup. Separace (dělení) operace, při níž se vzorek dělí alespoň na dva podíly odlišného složení Podmínka oddělení dvou látek odlišnost alespoň v jedné fyzikální nebo chemické vlastnosti. Např. v bodu varu - destilace, lyofilizace, v rozpustnosti krystalizace, srážení, extrakce, v rozdělovací konstantě rozdělovací chromatografie LLC, GLC, v disociační konstantě chromatografie na iontoměničích, v iontové pohyblivosti elektroforéza, ve velikosti a hmotnosti molekul centrifugace, gelová chromatografie, dialýza, ultracentrifugace.

Rozdělení separačních metod Metody založené na různé: distribuci jednotlivých složek mezi dvě fáze rychlosti pohybu jednotlivých složek v téže fázi Po separaci se mohou tyto složky: izolovat, kvalitativně nebo kvantitativně vyhodnocovat záznam jejich rozdělení. Nejjednodušší separace destilace, sublimace, filtrace. V mezních případech se využívají mnohastupňové separační metody. Jejich provedení povětšině bývá kontinuální. Hodnocení dokonalosti a účinnosti dělení distribuční poměr D. distribuční koeficient. rozdělovací poměr koncentrační D c. D C c( A) II c( A) I

rozdělovací poměr hmotnostní D m D m m( A) m( A) m(a) je hmotnost složky A v příslušné fázi I nebo II. Distribuční koeficienty se užívají nejčastěji v chromatografii V chromatografii je fází II fáze stacionární a fází I fáze mobilní. II I D g m( A) m( A) II I / m / V m s m s - hmotnost sušiny stacionární fáze v gramech V m - objem mobilní fáze v ml,

D v m( A) m( A) V c je objem náplně kolony v ml D s II I m( A) m( A) II I / V / V c m / A / V A s - povrch stacionární fáze (sorbentu) v m 2. distribuční nebo rozdělovací konstanta K D. V tomto případě platí, že c(a) I = A I a c(a) II = A II, takže K D s m A A I fáze vodná- považujeme za fázi I, fází II organické rozpouštědlo, při výměně iontů měničová fáze, při adsorpci adsorbent. II

výtěžek dělení R: R m( A) m( A) II pů m( A) II m( A) m( A) m(a) pů - hmotnost látky A ve vzorku před dělením. Dělení lze několikrát (n-krát) opakovat, potom výtěžek dělení R n je R 1 (1 R) n I n II Z tohoto vztahu lze vypočítat, kolikrát je třeba dělení opakovat, aby se dosáhlo výtěžku R n, je-li výtěžek jedné separace R n log(1 R ) n log(1 R)

1 ) ( / ) ( ) ( / ) ( ) ( ) / ( ) ( ) / ( ) ( ) ( B D A D I II I II I II c c B c B c A c A c B c A c B c A c Veličina - separační faktor pů pů B A II II B m A m S B m A m ) ( ) ( ) ( ) ( / m - hmotnost oddělené složky m pů - hmotnost téže složky ve vzorku před dělením. obohacovací faktor B A B A R R S /

Separační metody založené na fázových rovnováhách

Fázový diagram fázový diagram jednosložkové soustavy (vody) Fázový přechod je fyzikální pojem, označující skokovou změnu makroskopických vlastností termodynamického systému (fáze) při změně termodynamické proměnné (např. teploty).

Separační metody založené na fázových rovnováhách Extrakce selektivní separační metoda založená na přenosu látky z jedné kapalné fáze do druhé, která je v podstatě nemísitelná s první fází použitelná pro vzorky kapalné i tuhé (přenos z pevné fáze do kapalné), pro org. látky a biochemické materiály provedení v děličce (nejjednodušší), v extraktoru (např. Soxhletův) Požadavky na extrakční činidlo musí být nemísitelné nebo omezeně mísitelné s původním rozpouštědlem mělo by lépe rozpouštět extrahovanou složku než původní rozpouštědlo nemělo by být hořlavé, drahé a korozívní v potravinářství nesmí být jedovaté, životu nebezpečné

EXTRAKCE Převod dané látky z tuhého nebo kapalného homogenátu do kapaliny. Základní typy extrakcí: Pevná fáze kapalina Macerace luhování do jedné dávky kapaliny při normální teplotě, Digesce luhování do jedné dávky kapaliny při zvýšené teplotě (čaj), Perkolace luhování za normální teploty do protékající kapaliny, Kontinuální extrakce perkolace v průmyslovém provedení.

EXTRAKCE Pevná fáze kapalina REALIZACE Zabezpečení dobrého kontaktu mezi fázemi(přenos hmoty): TŘEPÁNÍ (A ZÁHŘEV) třepačka(vyhřívaná) HOMOGENIZACE homogenizátory SONIKACE ultrazvuk VAR POD ZPĚTNÝM CHLADIČEM reflux rozpouštědla (termostabilní analyty) Vyluhování s nuceným tokem (Forced-FlowLeaching) vzorek naplněn do ocelové kolony, kterou je pumpováno za zvýšeného tlaku extr. rozpouštědlo při záhřevu k jeho b. varu výsledky srovnatelné se Soxhletovou extrakcí, ale rychlejší

Pevná fáze kapalina Soxhletova extrakce EXTRAKCE pevný vzorek umístěn do Soxhletovy extrakční patrony (tvrzený filtrační papír nebo sklo s fritou místo dna) patrona umístěna do Soxhletovy aparatury; rozpouštědlo po záhřevu na svůj bod varu kondenzuje v patroně, vymývá analyty,vrací se s nimi do varné baňky, opět se odpařuje... POČET CYKLŮ/ hod max.teplota omezena b.varu rozpouštědla (stabilita analytů) Složení extrakční směsi v roztoku nemusí odpovídat složení v parách HEX:ACET (1:1) x AZEOTROP (3:1) vysoká výtěžnost x velice pomalé dobře zavedená metoda, relativně nenáročná a levná

Aparatura pro extrakci Chladič Soxhletův extraktor Extrakční patrona se směsí pro extrakci Varná baňka

Funkce extraktoru Při zahřívání baňky jsou páry rozpouštědla vedeny spojovací trubicí do chladiče, kde kondenzují. Kondenzované rozpouštědlo stéká na extrahovanou směs v patroně, rozpouští ji a hromadí se v extrakčním prostoru. Když hladina roztoku dosáhne horního ohybu patrony, steče zpět do varné baňky. Z baňky se opět odpařuje rozpouštědlo a celý proces se opakuje. Na extrahovanou směs tak působí stále nové rozpouštědlo, je tedy možné dosáhnout dokonalé extrakce poměrně malým množstvím rozpouštědla.

Pevná fáze kapalina Extrakce podporovaná mikrovlnným ohřevem (Microwave- Assisted Solvent Extraction, MASE) Mikrovlny elektromagnetické vlnění, frekvence 300 MHz 300 GHz, používaná frekvence 2450 MHz

Pevná fáze kapalina MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction) Používaná frekvence 2450 MHz: Záhřev dipól rotace-molekuly s vysokou dielektrickou konstantou se snaží orientovat v el. poli, to se ale mění tak rychle, že začnou vibrovat a v důsledku tření (srážky sousedních molekul) se zahřívat. Jiná frekvence nezpůsobí záhřev: frekvence molekuly se zorientují frekvence molekuly se ani nezačnou orientovat

Pevná fáze kapalina MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction) Rozpouštědlo absorbující mikrovlnnou energii rozpouštědlo se v uzavřené nádobě zahřívá nad bod varu, urychlení extrakce analytu-vysoká teplota a tlak (do 200 o C a 175 psi (libra síly na čtverečný palec) = 1,2.10 6 Pa = 12,3 at) Rozpouštědlo neabsorbující mikrovlnnou energii rozpouštědlo se nezahřívá, selektivní záhřev určitých látek ve vzorku uvolnění zahřátých analytů do chladné kapaliny uzavřená či otevřená nádoba mírnější-pro termolabilní látky možnost použití kapalného CO 2 -neabsorbuje, náhrada SFE ( p, t)

Pevná fáze kapalina MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction) Body varu a teploty rozpouštědel v nádobce:

Pevná fáze kapalina MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction) Záhřev rozpouštědel v závislosti na čase:

Pevná fáze kapalina MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction) Fokusované pole: -μ-vlny zacíleny na dno nádobky se vzorkem, hrdlo chladné -účinný reflux (možný přídavek reagencií), magnet. míchadlo -μ-vlnná frekvence: 2450 MHz, proměnný výkon 30-300 W -0,1-15 g vzorku, cca 30-50 ml rozpouštědla, do 30 min

Pevná fáze kapalina MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction) Výhody: -malá množství rozpouštědel (30-50 ml) -rychlost(minuty x hodiny Soxhletova extrakce) přímý záhřev vzorku, ne nádoby -účinnost,reprodukovatelnost -selektivita -lze ovlivnit výběrem rozpouštědla, dobou záhřevu -lokální záhřev a selektivní extrakce a migrace určitých látek z matrice do rozpouštědla X Soxhletova extrakce záhřev celé matrice a difùze rozpouštědla do matrice -simultánní extrakce více vzorků

Kapalina kapalina Vytřepávání jedinou dávkou (lepšího) rozpouštědla (dnes již téměř nepoužívané), Perforace (lepší) rozpouštědlo, do něhož má přejít dělená látka je v neustálém oběhu. Prostupuje kapalným homogenátem, odebírá z něj dělenou látku a hromadí se v oddělené baňce. V ní se odpařuje a po kondenzaci v chladiči prostupuje homogenátem znovu. Dělená látka se hromadí v destilačním zbytku. Roztřepávání jedna z prvních účinných metod umožňující dělení látek, jejichž rozdělovací konstanty jsou velmi podobné. Jejím zdokonalením je Rozdělovací chromatografie (bude probráno později).

Kapalina kapalina Princip dělicích metod při přechodu kapalina kapalina: Požadovaná látka je (spolu s dalšími látkami) v kapalném homogenátu v nějakém rozpouštědle použitém při homogenizaci nebo luhování. Při vytřepávání, perforaci, roztřepávání nebo rozdělovací chromatografii musíme najít a použít další rozpouštědlo, které se nemísí s prvním rozpouštědlem, v němž je daná látka (a pokud možno jen ona) rozpustná lépe, než v rozpouštědle prvním. Hlavním problémem extrakce z kapaliny do kapaliny je tedy volba vhodného (druhého) rozpouštědla.

Hlediska a požadavky: Kapalina kapalina Co nejmenší vzájemná mísitelnost obou rozpouštědel. Východisko mixotropní (eluotropická) řada organických rozpouštědel seřazených podle rostoucí polarity (podle rostoucí relativní permitivity, vzájemné rozpustnosti) uhlovodíky < alkoholy < voda např.: pentan < benzen < dietyléter < chloroform < aceton < dioxan < < etylacetát < pyridin < etanol < metanol < voda Platí - čím větší je rozdíl relativních permitivit - čím jsou rozpouštědla v mixotropické řadě od sebe dále, tím hůře se mísí. Co nejvyšší rozpustnost dané látky. Pravidlo: podobné rozpouští podobném. Pro látky lipofilní (hydrofóbní bojící se vody), které jsou nepolární, používáme uhlovodíky. Látky hydrofilní (polární) se naopak velmi dobře rozpouštějí v polárních rozpouštědlech alkoholy, voda. Chemická stálost. Rozpouštědlo nesmí chemicky reagovat s prvním rozpouštědlem ani s danou látkou

Kapalina kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) TEORIE Nernstův distribuční zákon -Jakákoliv sloučenina se rozdělí mezi dvě nemísitelná rozpouštědla takovým způsobem, aby poměr koncentrací v obou fázích zůstal konstantní: K D. distribuční konstanta c o...koncentrace analytu v organické fázi c aq...koncentrace analytu ve vodné fázi K D popisuje rovnováhu mezi koncentracemi analytu v obou fázích (charakteristická pro daný analyt v daném systému) k separaci dvou látek dojde, jestliže se jejich K D liší

Kapalina kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) TEORIE Extrahované množství analytu(e): K D. distribuční konstanta V o. objem organické fáze V aq. objem vodné fáze V. fázový poměr V o /V aq

Kapalina kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) TEORIE Distribuční konstanta K D: Extrahované množství analytu:

Kapalina kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) TEORIE JEDNOKROKOVÁ EXTRAKCE: Pro kvantitativní výtěžnost K D musí být >10, protože praktické je 0,1 <V < 10 K D = 10, V = 1: E = ((10*1) / (1 + 10*1)) *100 =91 % K D = 10, V = 0,1: E = ((10*0,1) / (1 + 10*0,1)) *100 =50 % VÍCEKROKOVÁ EXTRAKCE: Není-li splněna podmínka K D >10 Vícenásobná extrakce menším objemem rozpouštědla je účinnější než jedna extrakce sumárním objemem

Kapalina kapalina Extrakce rozpouštědlem Kontinuální extrakce K D velmi malé vícekroková extrakce nepraktická (mnoho opakování, velký extrakční objem, pomalé ustalování rovnováhy) Kontinuální extraktor - rozpouštědla těžší než voda

Kapalina kapalina Extrakce rozpouštědlem Mikroextrakce (ME) X In vial extrakce V 1 miniaturizace: V (0,001 0,01) malý objem rozp. lehčích než voda vysoká zakoncentrace nižší výtěžnost riziko emulzí (čisté vzorky) vhodné pro nepolární analyty vhodné vysolování

Aparatura pro vytřepávání Zátka Dělící nálevka Voda Chloroform ( s jodem) Jímací nádoba

Zásady pro vytřepávání Extrakce kapaliny z kapalné směsi přidáním rozpouštědla, v němž je extrahovaná složka velmi dobře rozpustná. Provádí se protřepáváním směsi s vhodným rozpouštědlem. Čím větší je tzv. rozdělovací koeficient (r.k.) a větší rozpustnost složky v použitém rozpouštědle, tím lépe se extrahovaná složka oddělí od směsi. Účinnost extrakce se zvýši také opakováním extrakce. Rozdělovací koeficient je poměr koncentrací látky rozpuštěné ve dvou různých, navzájem nerozpustných a nemísitelných rozpouštědlech (kapalinách A, B); r.k. = c A / c B. Rozdělovací koeficient závisí pouze na teplotě a je pro danou látku v daných rozpouštědlech konstantní. Jako příklad možno uvést vytřepávání bromu nebo jodu z jejich vodných roztoků např. sirouhlíkem, benzínem, chloroformem nebo petroletherem.

Destilace neselektivní separační metoda k dělení složek kapalné směsi část směsi převedena odpařením do parní fáze, odděleně zkondenzována, získá se kondenzát obohacený těkavějšími složkami, v neodpařené části se koncentrují méně těkavé složky nejčastější využití destilace, resp. rektifikace při analýze ropy, ropných produktů, org. rozpouštědel apod. Látky destilují postupně podle zvyšujícího se bodu varu. Jejich páry se v chladiči postupně kondenzují (sráží) a odkapávají do jímadla Aby při jednorázové, tzv. jednoduché destilaci došlo k úplnému oddělení dvou látek ze směsi, musí být jedna buď úplně netěkavá, nebo se musí lišit teplotou varu alespoň o 150 o C. Některé kapaliny při určité koncentraci tvoří tzv. azeotropní směsi, tj. směsi, které mají konstantní bod varu, destilují spolu a jednoduchou destilací se nedají od sebe oddělit. Např. směs ethanol voda tvoří tuto směs při poměru 96% lihu a 4 % vody ( přesně 95,57 % ethanolu) a bod varu je 78,15 o C.

Destilace

Filtrační metody Kritérium pro dělení: velikost molekul a použitý tlak. reverzní osmóza M r <500; p (1 MPa - 10 MPa); ultrafiltrace M r (500-300000); p ( 0,1 MPa - 1 MPa); mikrofiltrace velikost molekul 1 < mμ; p 0,1 MPa; filtrace velikost molekul > 1 mμ; p 0,1 MPa. Možnost kombinace těchto metod s použitím elektrického pole: elektrodialýza, elektrodekantace (frakcionace vysokomolekulárních látek).

Filtrace membránou Ultrafiltrace: selektivní oddělování molekul protlačováním roztoku membránou s přesně definovanými póry: 0,1 nm - 50 nm. Přetlak, chlazení. Ultrafiltry: anizotropní membrány (kruhové, dutá vlákna). Základní charakteristika ultrafiltru: molekulový limit - hmotnost nejmenší částice, která je filtrem zadržena. Limit nebývá ostrý, jeho stanovení se provádí globulárními bílkovinami. Použití: čištění a frakcionace labilních biomolekul (NK, enzymy, protilátky aj.). Účinnost dělení: největší pro molekuly, jejichž hmotnost se liší o jeden řád. Mikrofiltrace: podobná ultrafiltraci. Póry mikrofiltrů jsou však podstatně větší (0,05 μm - 10 μm ). Použití podtlaku Použití: separace buněčných organel, buněk, mikroorganizmů a virů sterilizace kapalin, izolace buněk pro cytologická vyšetření; koncentrování virů; odstraňování sorbentu aktivního uhlí z reakčních směsí apod.

Molekulová síta Speciální membrány látky anorganického nebo organického původu, jejichž struktura a fyzikální vlastnosti umožňují selektivní oddělování látek s rozdílnou hmotností molekul. Výhoda jemnější dělení. Forma molekulových sít prášek, granule, gel. Dělení molekulovými síty je proces opačný k filtraci malé molekuly dělené látky vnikají do pórů a sítem procházejí velké molekuly. Anorganická molekulová síta: Přírodní nebo syntetické zeolity- hlinitokřemičitany (hydratované alumosilikáty alkalických kovů). Použití: čištění a vysušování rozpouštědel (po zaplnění pórů molekulami H 2 O je nutná aktivace síta vysušením při teplotě 300C-400 0 C, jako adsorbenty v chromatografii. Pórovitá skla vyšší odolnost vůči chemikáliím a vyšším teplotám než u zeolitů (BIOGLAS). separace virů, NK, také jako iontoměniče. Organická molekulová síta: Makromolekulární látky se složitou vnitřní strukturou (sítování) dutiny definované velikosti škrobové, želatinové a agarové gely ve formě granulí (agar komerčně dostupná látka z mořských ruduchovitých řas rozpustná ve vroucí vodě. Při teplotě pod 50 0 C tuhne v rosol gel). Hydrofilní a hydrofóbní forma. Značná dělící schopnost. Nevýhoda snadná možnost mechanického nebo chemického poškození.

Filtrace Filtrace - separační metoda, která umožňuje oddělit pevnou látku od kapaliny. Pevná látka se zachytí na filtru, kapalina proteče jako filtrát. V laboratoři se jako filtru používá nejčastěji tzv. filtrační papír, který je podobný obyčejnému papíru, ale má mnohem větší propustnost kapalin a je dosti savý. Rozlišuje se několik druhů těchto papírů podle vlastností materiálu, který chceme filtrovat. Provedení filtrace Nálevku s filtračním papírem upevníme do držáku Její stopka se musí dotýkat stěny kádinky postavené pod ní na jímání filtrátu. Filtrát musí stékat po stěně kádinky a nesmí se rozstřikovat. Roztok filtrujeme (pokud to látce nevadí) vždy horký, protože je filtrace za horka mnohem rychlejší. Vléváme jej z kádinky do nálevky po tyčince přiložené ke stěně nálevky (pokud používáme hladký filtr, přikládá se zpravidla ke trojité vrstvě filtračního papíru), aby se kapalina nerozstřikovala a nepotřísnila stěny kádinky. Protože kapalina na filtru vzlíná, nenaléváme jí více než centimetr pod okraj filtru.

Filtrace s odsáváním slouží k filtraci tehdy, kdy účelem filtrace je získat nerozpustný produkt. Filtrační nálevka (Büchnerova nálevka) bývá obvykle porcelánová, ale existují i plastové. Její dno je ploché s mnoha malými otvory. Na dno pokládáme kruhový filtrační papír, na kterém se při filtraci zachytí pevná látka, zatímco roztok proteče do odsávací baňky pod nálevkou. Pokud nám záleží na filtrátu (nikoli na sraženině zachycené na filtru), je vhodné mezi odsávací baňku a vývěvu zapojit ještě promývací baňku (viz následující obrázek). Byla pojmenována po německém chemiku Eduardu Büchnerovi, který roku 1907 získal Nobelovu cenu.

Schéma doporučeného zapojení vývěvy (1) k aparatuře (3, 4) přes pojistnou (promývací) láhev (2).