ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC)

Transkript

1 EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC) -rozdělení směsi látek (primární extrakt) na sloupci sorbentu ve skleněné koloně s fritou (cca 50 cm x 1 cm) -obvykle jde o selektivní adsorpci nežádoucích látek (lipidy, pigmenty) a následnou eluci analytů vhodným rozpouštědlem -extrakt aplikován v rozpouštědle použitém na přípravu sloupce

2 EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC) SORBENTY: - aktivace (odstranění vody žíháním v peci) - deaktivace (standardizace obsahu vody, zeslabení sorpce) Silikagel: SiO 2 x H 2 O, většinou deaktivovaný, slabě kyselý charakter - nevhodný pro separaci silně basických analytů (silná sorpce) někdy impregnace AgNO 3 Florisil: křemičitan hořečnatý, odstranění lipidů a dalších málo polárních látek, před použitím nutná aktivace záhřevem (130 o C, i po vyžíhání)

3 EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC) SORBENTY: Oxid hlinitý: dělení nepříliš polárních látek (záchyt pigmentů), obvykle slabě alkalický (ph 10) - může rozkládat estery promytím HCl a H 2 O vznikne neutrální (ph 7,5) - slabší sorpce, kyselý (ph 4,5) -impregnace AgNO 3 Oxid hořečnatý: malá afinita ke sloučeninám s dvojnými vazbami většinou ve směsných sorbentech (s křemelinou) Aktivní uhlí: nepolární sorbent, často ireverzibilní sorpce, odstranění pigmentů

4 interakce 3 složek: TUHÁ FÁZE-ANALYT-ROZPOUŠTĚDLO CÍL = "DIGITÁLNÍ CHROMATOGRAFIE" a) zádrž analytu, průnik interferencí b) zádrž interferencí, průnik analytu S P E k o l o n k y : Tělo: polypropylen, sklo Frity: 20 µm, polyethylen, ocel Sorbent: převážně silikagel, velikost částic 40 µm, velikost pórů 60 A Objem kolonek: 1, 3, 6 ml Množství sorbentu v kolonce: 100, 500 mg, 1, 2, 5, 10 g Kapacita kolonky: mg analytu / g náplně (koextrakty!!) Bod průniku (Breakthrough): sorbent saturován-nezadržuje analyt

5 MOŽNOSTI APLIKACE SPE (Extrakční módy) A) S e l e k t i v n í e x t r a k c e záchyt analytů, ostatní složky matrice bez zádrže eluce analytů B) S e l e k t i v n í e l u c e záchyt analytů i ostatních složek matrice eluce pouze analytů C) S e l e k t i v n í p r o m ý v á n í záchyt analytů i ostatních složek matrice vymytí interferujících látek (analyty sorbovány) eluce analytů D) O d s t r a n ě n í m a t r i c e záchyt interferencí, analyt prochází bez zádrže

6 O B E C N Á S P E M E T O D A REALIZACE: podtlak, přetlak, odstředění

7 O B E C N Á S P E M E T O D A 1. K o n d i c i o n a c e (1-2 ml / 100 mg náplně) vymytí nečistot (stejná síla jako vzorku) převedení do rozpouštědla vzorku (menší nebo stejná síla) SMÁČENÍ POVRCHU KAPALINOU: úhel dotyku menší než 90

8 O B E C N Á S P E M E T O D A 1. K o n d i c i o n a c e (1-2 ml / 100 mg náplně) vymytí nečistot (stejná síla jako vzorku) převedení do rozpouštědla vzorku (menší nebo stejná síla) 2. A p l i k a c e v z o r k u úprava (ph, iontová síla, ředění, snížení rozpustnosti analytu ve vzorku) objem ( objem odstranění kondic. rozpouštědla účinnost, výtěžnost) průtok (max. 5 ml/min, dostatečný kontakt vzorek / fáze) Objem ovlivňuje: - velikost a typ kolonky - koncentrace analytu - množství interferencí - zádrž analytu sorbentem

9 O B E C N Á S P E M E T O D A 1. K o n d i c i o n a c e (1-2 ml / 100 mg náplně) vymytí nečistot (stejná síla jako vzorku) převedení do rozpouštědla vzorku (menší nebo stejná síla) 2. A p l i k a c e v z o r k u úprava (ph, iontová síla, ředění, snížení rozpustnosti analytu ve vzorku) objem ( objem odstranění kondic. rozpouštědla účinnost, výtěžnost) průtok (max. 5 ml/min, dostatečný kontakt vzorek / fáze) 3. P r o m y t í (0,5 ml / 100 mg náplně) odstranění koextraktů (stejná nebo větší síla) 4. E l u c e a n a l y t u typ rozpouštědla (podobné rozpouští podobné, snadno odpařitelné) objem rozpouštědla (2 x mrtvý objem, cca 2 x 100 µl / 100 mg sorbentu )

10 odstranění interferujících látek zakoncentrace analytu skupinové frakcionace DŮVODY PRO POUŽITÍ SPE změna prostředí vzorku (t.j. rozpouštědla) odsolování cíl: odstranění interferencí nebo maximální citlivost (zakoncentrace)

11 VOLBA ROZPOUŠTĚDEL - "síla" rozpouštědla pro daný systém " s l a b é " rozpouštědlo = sorpce analytu " s i l n é " rozpouštědlo = eluce analytu

12 VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT A) Hydrofobní interakce - disperzní síly (van der Waals) nepolární fáze, energie 1-10 kcal/mol B) Polární interakce - vodíková vazba, dipól-dipól, polární fáze, energie 5-10 kcal/mol C) Iontové (elektrostatické) interakce kcal/mol VAZEBNÉ ENERGIE

13 VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT A) Hydrofobní interakce - disperzní síly (van der Waals) nepolární fáze, energie 1-10 kcal/mol interakce mezi nepolárními molekulami v důsledku vzniku indukovaných dipólů - přitažlivé i odpudivé - slabší než vodíková vazba či dipól-dipól interakce

14 VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT B) Polární interakce - polární fáze, energie 5-10 kcal/mol vodíková vazba mezi molekulami s vodíkem kovalentně vázaným k silně elektronegativnímu prvku (O, N, F) dipól-dipól mezi polárními molekulami s permanentním dipól momentem

15 VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT C) Iontové (elektrostatické) interakce kcal/mol mezi opačně nabitými skupinami iontoměniče a analytu

16 Výběr fáze ovlivňuje: - povaha analytu - rozpouštědlo vzorku - typ interferencí FÁZE POUŽÍVANÉ PRO SPE Nejlepší retence analytů: polarita analytu podobná polaritě fáze interference méně polární než analyt - normální fáze interference polárnější než analyt - reverzní fáze

17 A) N o r m á l n í f á z e - polární FÁZE POUŽÍVANÉ PRO SPE silikagel, oxid hlinitý, Florisil, polárně modif. silikagel (CN, diol, NH 2 ) B) R e v e r z n í f á z e - nepolární nepolárně modif. silikagel (C 18, C 8, C 4, CH, PH, CN) C) I o n t o m ě n i č e ANEX - silikagel s chemicky vázaným kladně nabitým modifikátorem (kvarternární amin, sekund. amin) KATEX - silikagel s chemicky vázaným záporně nabitým modifikátorem (benzen- či propylsulfonová kys.)

18 FÁZE POUŽÍVANÉ PRO SPE

19

20 SYNTÉZA CHEMICKY VÁZANÝCH SORBENTŮ SILIKAGEL + DERIVATIZAČNÍ ČINIDLO SILOXANY Derivatizační činidla : mono- až tri- halo či alkoxy silyl deriváty alkylchlorsilany

21 SYNTÉZA CHEMICKY VÁZANÝCH SORBENTŮ SILIKAGEL + DERIVATIZAČNÍ ČINIDLO SILOXANY Derivatizační činidla : mono- až tri- halo či alkoxy silyl deriváty alkylchlorsilany

22 OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU

23 OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU TRIMETHYLCHLORSILAN

24 OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU

25 OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU SILIKAGEL (normální fáze): silná sorpce velmi polárních sloučenin (glycerol) použití modifikovaných silikagelů (slabší retence) C18 (reverzní fáze): neselektivní, někdy příliš silné sorpce použití fází s polárnějšími modifikátory (C 8, C 4 ) část koextraktů projde bez zádrže POUŽITÍ FÁZÍ NA BÁZI PS-DVB: bez silanolů stabilní v širokém rozmezí ph lepší zádrž polárnějších analytů

26 TRENDY VE VÝVOJI SORBENTŮ PRO SPE Merck: 3 typy sorbentů na bázi C18 lišící se modifikací silikagelového nosiče porovnání na základě kapacity pro hydrofilní (kofein) a lipofilní (diisodecylftalát) látky (Kapacita = mg analytu / g sorbentu)

27 TRENDY VE VÝVOJI SORBENTŮ PRO SPE Waters: OASIS TM HLB hydrofilně-lipofilní sorbent kopolymer N-vinylpyrrolidonu (zvyšuje smočitelnost vodou) a divynylbenzenu (RP) -vyschnutí nesnižuje výtěžnost (automatizace) - větší stabilita ve větším rozsahu ph (x C18) - vyšší retence hlavně pro polární látky (x C18) - univerzální (i pro polární a zásadité analyty)

28 TRENDY SMĚSNÉ SORBENTY Supelclean TM ENVI-Carb II / PSA SPE - retence RP + ANEX chemický filtr odstranění klíčových interferencí při analýze pesticidů vrstva A Supelclean TM ENVI-Carb II: - neporézní grafitizovaný uhlík - plocha povrchu 100 m 2 /g - afinita k planárním molekulám - záchyt pigmentů (chlorofyl, karotenoidy) a sterolů vrstva A Supelclean TM PSA: - N-propyl ethylendiamin (primární-sekundární amin) - záchyt mastných kyselin, cukrů, polárních pigmentů

29 TRENDY VE VÝVOJI SORBENTŮ PRO SPE Carbograph - grafitizovaný uhlík retence RP + ANEX - neporézní, nepolární - plocha povrchu až100 m 2/ g (záhřev sazí na C v inertní atmosféře) - povrch obsahuje kyslíkaté sloučeniny interagující s kyselými sloučeninami (separace od zásaditých a neutrálních bez úpravy ph) - kvantitativní extrakce i velmi polárních sloučenin z velkých objemů

30 IONTOMĚNIČE extrakce kyselin a zásad z vodných roztoků podle zásad iontové výměny (interakce nabitého analytu a opačně nabitého ionexu)

31 IONTOMĚNIČE ph - analyty musí být ionizovány - podle pk a analytu, ph se upravuje 2 jednotky nad či pod pk a (octová kyselina 4,75 cyklohexylamin 10,66) síla protiiontu KATEX : Li+, H+, Na+, NH4+...snadno nahraditelné Cu 2+, Ca 2+, Ba 2+...obtížně nahraditelné ANEX : OH -, F -...snadno nahraditelné HSO 3-, NO 3-, CN -, Cl -...obtížně nahraditelné iontová síla - celková koncentrace iontů ve vzorku - soutěž s analytem o místa na iontoměnči

32 IONTOMĚNIČE

33 IONTOMĚNIČE TYKADLOVÉ (tentacle) funkční skupiny umístěny podél pohyblivého, kovalentně vázaného řetězce složeného z 5-20 monomerních jednotek (XXX u klasických iontoměničů jsou funkční skupiny zakotveny přímo na nosič v rigidní pozici) dobrá přístupnost analytů k funkčním skupinám = rychlý přenos hmoty, vysoká kapacita, malé objemy elučních rozpouštědel