BAKTERIÁLNÍ REZISTENCE Petr Zouhar, Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i.; UK v Praze, PřF, Katedra fyziologie V této úloze se v hrubých rysech seznámíte s některými metodami používanými v běžné molekulárně biologické praxi. Zamyslíte se nad způsoby boje s bakteriálními patogeny i nad strategií, jakou se bakterie pokouší léčbě uniknout. I. část Úkol 1 V následujících dvou hodinách budete provádět myšlenkový experiment s potenciálně patogenními bakteriemi. Nejprve se seznámíte s materiálem a pomůckami, které mikrobiologové běžně používají. Bakterie je v laboratorních podmínkách možno pěstovat na Petriho miskách. Jako kultivační půda se přitom nejčastěji používá tzv. agar. a) Agar bývá izolován z mořských řas. Tvoří součást buněčné stěny ruduch. Mezi důležité složky buněčných stěn organismů patří dále např. celulóza nebo chitin. Napište, do jaké skupiny chemických látek agar, celulóza i chitin patří. Dále uveďte, u kterých organismů je buněčná stěna vyztužena chitinem. b) Podobně jako jiné látky tvořící buněčné stěny je agar těžko stravitelný. To je jeden z důvodů, proč je agar využíván jako kultivační půda pro bakteriální kultury. Bakterie spotřebovávají živné médium, ale agar zůstává netknutý, takže se bakteriální kolonie dají snadno pozorovat a dále s nimi pracovat. To však není jediný způsob využití agaru, který lidstvo objevilo. Kde jinde se běžně používají látky založené na agaru? (stačí uvést dva způsoby) Napovíme, že v jednom případě se jedná o běžně používanou molekulárně biologickou metodu. Úkol 2 Pokud chtějí mikrobiologové zabránit některým bakteriím, aby na půdě narostly, mohou agar napustit některými baktericidními látkami. Často jsou to sloučeniny, které se běžně užívají jako léčiva při nákazách bakteriálního původu.
a) Jak se takovéto baktericidní látky obecně nazývají? b) Objev těchto přírodních látek znamenal v roce 1928 obrovský průlom v léčbě bakteriálních onemocnění. Napište jméno vědce, který tento velevýznamný objev učinil. c) Dnes už se tyto látky vyrábějí synteticky, mnoho různých organismů je však produkuje přirozeně. U jakého organismu (stačí rod) byla první z těchto látek popsána? d) Důvodem, proč se tyto látky dají s výhodou použít pro léčbu bakteriálních infekcí, je to, že zpravidla neúčinkují na eukaryotické buňky, a nepoškozují tedy buňky našeho těla. Jak toho lze dosáhnout? Je nutné zablokovat nějaký proces, který je typický a nezbytný pouze pro prokaryotické buňky, nebo který je u prokaryotických buněk výrazně odlišný od eukaryot? Zamyslete se nad rozdíly mezi prokaryotickou a eukaryotickou buňkou a navrhněte nějaké konkrétní způsoby, jak by mohly léky působit negativně pouze na bakterie. Uveďte alespoň dva způsoby. Úkol 3 I proti těmto účinným látkám však našly některé bakterie obranu. Takové bakterie nazýváme rezistentní. a) Nejúčinnější obranou bakterií je léčiva nějakým způsobem eliminovat. Vymyslete některé způsoby, jak může bakterie tohoto efektu docílit. Uveďte alespoň dva způsoby.
b) Geny pro rezistenci nebývají kódovány na bakteriálním chromosomu (nukleoidu). Kde byste je tedy hledali? Jaká další forma DNA se v bakteriálních buňkách často vyskytuje? c) Zamyslete se nad tím, jaké výhody může bakteriím přinášet přechovávání genů pro rezistenci mimo nukleoid. Úkol 4 Představme si nyní myšlenkový experiment. Máme k dispozici: 1. Čtyři misky s agarem napuštěným živným médiem. Dvě z nich jsou označeny jako misky I a dvě z nich jako misky II. Víme přitom, že buď misky I nebo misky II byly napuštěny látkou inhibující růst a množení bakterií, o které byla řeč v otázce 2. 2. Dva roztoky označené A a B. Víme přitom, že jeden z roztoků je čistá voda a v tom druhém je rozpuštěna látka, jejíž identitu budeme určovat. 3. Suspenzi bakteriálních buněk Escherichia coli ve zkumavce. Váš postup bude následující: a) Suspenzi rozdělíte do čtyř zkumavek. Ke dvěma z nich přidáte roztok A a ke dvěma z nich roztok B. b) Zkumavky s bakteriemi a roztoky A a B držíte po celou dobu na ledu a v jednu chvíli je na několik sekund vystavíte vyšší teplotě, což vyvolá tzv. teplotní šok. O tomto stavu se soudí, že stimuluje tzv. transformaci, tedy přijímání cizorodé DNA do bakteriálních buněk. c) Bakteriální suspenze vrátíte opět na led. Po určité době přidáte k suspenzi živné médium a necháte zkumavky třepat na vyhřívané třepačce. Poté suspenze s živným médiem nanesete na Petriho misky. Bakterie inkubované s roztokem A rozetřete po jedné misce I a jedné misce II, bakterie inkubované s roztokem B rozetřete po druhých miskách I a II. d) Necháte misky přes noc při teplotě 37 ºC a druhý den pozorujete. Výsledek pokusu je shrnut v tabulce: Misky I Roztok A nic nevyrostlo, miska je prázdná Roztok B na misce jsou roztroušeny kolonie buněk Misky II misku pokryly kolonie buněk misku pokryly kolonie buněk
a) Které misky byly ošetřeny látkou inhibující růst a množení bakterií? b) Který z roztoků A a B obsahoval čistou vodu? c) Co obsahoval druhý roztok? d) Proč vyrostlo na misce I výrazně méně bakterií inkubovaných s roztokem B, než na misce II? e) Bakterie jsou po vysetí na misky inkubovány přes noc při 37 C. Ideální pro jejich růst může být rovněž zvýšená koncentrace CO2. Napište, proč jsou právě tyto podmínky pro růst bakterií Escherichia coli optimální.
II. část V minulém experimentu jste inkubovali bakteriální buňky s plazmidy nesoucími geny pro rezistenci k antibiotiku na agarových miskách. Takové plazmidy lze s výhodou využít při metodách genového inženýrství, kterému se budeme věnovat nyní. Používané plazmidy však většinou bývají trochu složitější - kromě genu pro rezistenci (např. gen AmpR kódující rezistenci k antibiotiku ampicilinu) nesou i některé další geny - často např. gen LacZ z tzv. Lac operonu E. coli. LacZ umožňuje bakteriím přeměňovat látku obsaženou v médiu (tzv. X-gal) na modře zabarvený produkt. Pokud se tedy takový plazmid dostane do bakterie, odolává tato bakterie působení antibiotika a zároveň mají její kolonie modrou barvu, oproti normálním bílým divokým koloniím. Nákres použitého plazmidu s polohou obou genů (AmpR a LacZ) vidíte níže. Obr. plazmidu (velikost 2700 párů bazí - 2,7 kb) ori replikační počátek; lacz sekvence genu LacZ; ampr sekvence genu pro rezistenci k ampicilinu; 1 5 viz úkol 4. a) Úkol 1 LacZ je jedním ze tří genů "lac operonu" E. coli. Enzymy kódované geny tohoto operonu umožňují bakteriální buňce využít jako hlavní zdroj energie laktosu v případě, že není k dispozici žádná glukosa. Z důvodu úspory energie je důležité, aby byla exprese genů lac operonu spouštěna pouze tehdy, kdy proto existuje rozumný důvod. Vyberte, jakou roli může hrát v mechanismu kontroly exprese genů Lac operonu laktosa: a) je to represor, který blokuje transkripci genů Lac operonu b) je to induktor, který inhibuje funkci represoru
c) je to promotor transkripce d) je to terminátor transkripce e) je to nezbytný faktor zajišťující správný sestřih primárního transkriptu Úkol 2 Nyní se budeme věnovat podobnému experimentu, jaký jsme už nastínili v předchozí části praktika. Máme k dispozici misky s antibiotikem (ampicilinem) a misky bez antibiotika. Část bakteriální suspenze opět inkubujeme s čistou vodou a část pomocí teplotního šoku transformujeme plazmidem na obrázku výše. Oproti předchozímu pokusu obsahuje plazmid vedle genu pro rezistenci i gen Lac Z. Obě skupiny bakterií následně vysejeme na zmiňované misky. Při ideálním průběhu pokusu byste na jednotlivých miskách pozorovali následující výsledky: 1. nic nenarostlo, prázdná miska 2. několik modrých kolonií 3. souvislý pokryv bílých buněk 4. souvislý pokryv bílých buněk s několika modrými koloniemi Přiřaďte popisy z nabídky do tabulky: misky s ampicilinem Bakterie + plazmid Bakterie + čistá voda misky bez ampicilinu Úkol 3 a) Stručně vysvětlete, čím je způsoben barevný rozdíl mezi koloniemi, a za jakých podmínek se oba typy kolonií mohou vyskytovat na jediné misce. b) Reálný pokus by se asi od popsaného výsledku poněkud odchýlil: Na žádné z misek by se pravděpodobně nevyskytovaly současně bílé a modré kolonie. Bakterie vytvářející bílé kolonie ty modré úplně vytlačily. Zamyslete se nad tím, co způsobuje sníženou konkurenceschopnost bakterií tvořících modré kolonie. Uveďte svůj nápad.
Úkol 4 Genový inženýr používá plazmidy zejména k tomu, aby s jejich pomocí vnesl do bakterie nějaký cizorodý gen. Je tak např. možné vnést do plazmidu upravený gen pro lidský inzulín, transformovat jím bakterie a nechat je pak inzulín produkovat. Ani vkládání genu do plazmidu, ani transformace buněk plazmidem však neprobíhá se stoprocentní účinností. Je proto nutné odlišit úspěšně transformované buňky od netransformovaných a plazmidy s úspěšně vloženým genem od těch původních. K tomu slouží tzv. reportérové geny, které jsou součástí plazmidu, např. právě LacZ a AmpR. Gen pro rezistenci k ampicilinu se používá proto, abychom mohli negativní selekcí vybrat jen ty buňky, do kterých vstoupil plazmid (ostatní buňky nemohou přežívat v prostředí ošetřeném antibiotikem). LacZ nám zase umožňuje odlišit plazmidy, do kterých byl úspěšně vložen cizorodý gen. a) Podívejte se na obrázek plazmidu. Která šipka označuje místo (místa), do kterého budeme vkládat cizorodý gen, abychom mohli využít LacZ selekci? Vysvětlete stručně, proč jste zvolili právě toto místo (místa). b) Jakou barvu budou mít kolonie vzniklé množením buňky transformované plazmidem s úspěšně vloženým cizorodým genem? Úkol 5 Daly by se v bakteriích pomocí vektory vnesených genů připravovat ve velkém proteiny kódované lidským genomem, jak to bylo naznačeno v příkladu s inzulínem? Pokud ne, tak proč. Pokud ano, existovala by nějaká omezení? Úkol 6 V popisovaných pokusech jsme pro vnášení cizorodé DNA do bakterií použili transformaci buněk plazmidem, tj. vstup holé DNA přes cytoplasmatickou membránu. Jakými dalšími způsoby může být do bakteriální buňky přirozeně vpravena cizí genetická informace? Jinými slovy: Jaké další typy horizontálního přenosu genetické informace znáte? Uveďte dva způsoby.