Přímá analýza reálných vzorků hmotnostní spektrometrií s využitím nanodesorpčního elektrospreje (nano-desi-ms) Teorie: Desorpční elektrosprej (DESI) byl popsán v roce 2004 Zoltánem Takátsem. Jedná se o ambientní měkkou ionizační techniku, která umožňuje přímo analyzovat nízkomolekulární látky povrchu často bez jakékoliv úpravy. DESI ionizuje a desorbuje molekuly povrchu pomocí elektrospreje. Elektrosprej vytváří jemné nabité kapičky rozpouštědla, které dopadají na povrch pod úhlem, desorbují molekuly na povrchu a pod úhlem (viz. br. 1) jsou transportovány do hmotnostního spektrometru (MS). DESI je složeno ze dvou v sobě vložených kapilár. Vnitřní sprejovací kapilárou protéká rozpouštědlo (sprejovací kapalina), na které je vkládáno vysoké napětí 3-5 kv. kolo vnitřní kapiláry proudí dusík, který pomáhá fokusovat jemný sprej a desorbovat molekuly povrchu do MS. Princip ionizace a desorpce molekul povrchu pomocí DESI není zcela objasněn. Na základě počítačových simulací se předpokládá, že analyzovaný povrch je postupně zavlažen sprejovací kapalinou, molekuly povrchu jsou extrahovány z povrchu do kapaliny, ionizovány a desorbovány. Ionty a nabité mikrokapičky jsou z povrchu odprašovány (tzv. droplet pick-up mechanismus) a transportovány do MS. DESI si pro svou jednoduchost našlo široké uplatnění např. v analýze farmakokinetik, výbušnin, produktů pyrolýzy a metabolismu, ale i ve forenzní chemii i v zobrazovacím 2D módu, např. při analýze lipidů v mozkové tkáni. br. 1 Schéma iontového zdroje DESI Pro toto cvičení byla navržena jednodušší alternativa desorpčního elektrosprej, desorpční nanoelektrosprej (nano-desi), se kterým má katedra analytické chemie letité zkušenosti. Nano-DESI nevyžaduje pomocný plyn k tvorbě spreje. Vysoké napětí je vkládáno na kapiláru s vnitřním průměrem 1-2 nm. Jenmý sprej nabitých kapiček rozpouštědla je vytvářen pomocí kapilárních sil ve sprejovací špičce a průtok kapaliny je v jednotkách nl/min (viz. br. 2).
br. 2 Schéma iontového zdroje nano-desi Nano-desorpční elektrosprej: Nano-DESI připevněný k hmotnostnímu spektrometru je zobrazen na brázku 3 a 4. Sprejer je pohyblivý v osách x, y, z a úhlu u. Barevně označené posuvné šrouby umožňují nastavit sprejer do správné geometrie. Žlutý šroub pohybuje sprejem v ose y, červený v ose x, zelený a šedý v ose z. Na pravé straně je červeně označeným drátem přiváděno vysoké napětí, proto buďte opatrní při manipulaci se zdrojem a vždy se ujistěte, že zdroj je vypnutý a v uživatelském okně svítí černý trojúhelník v zeleném pozadí (viz. níže). Pod sprejovací kapilárou je umístěno podložní sklíčko, na které je umístěn vzorek. Sprejer je snadno vyjmutelný k naplnění sprejovací kapiláry sprejovacím rozpouštědlem.
br. 3 DESI nasazené na hmotnostní spektrometr LCQ Finnigan br. 4 Sprejovací kapilára směřuje před ústí vstupní kapiláry hmotnostního spektrometru..
Analýza anthokyaninů ve víně metodou nano-desi-ms Úvod: Anthokyaniny jsou součástí pigmentů plodů i květů. Bobule vinné révy, brusinky nebo borůvky jsou bohaté na anthokyaniny, které jsou významnými antioxidanty a mají blahodárný účinek na lidský organismus. Anthokyaniny přítomné ve vínu určují jeho barvu a každá odrůda má své typické zastoupení anthokyaninů, na základě kterého se dají jednotlivé odrůdy od sebe rozeznat. Úkol: Identifikujte odrůdu neznámého vína na základě porovnání zastoupení anthokyaninů ve skvrnách vín na látce. Chemikálie a pomůcky: Methanol, destilovaná voda, tkanina se skvrnami známých červených vín (Frankovka, Rubinet, Neronet), kádinka s neznámým červeným vínem, metanol, destilovaná voda, kyselina mravenčí, sprejovací kapilára, podložní sklíčko, čistá tkanina, nůžky, pipeta 5 ml, mikrostříkačka, nano-desi, hmotnostní spektrometr Thermo LCQ Finnigan, tabulka s molekulovými hmotnostmi anthokyaninů (viz. Příloha II). Pracovní postup: 1) Připravte si sprejovací kapalinu, směs methanol:voda v poměru 3:1 a 0,2 % kyseliny mravenčí, a okyselující roztok 5 % kyselinu mravenčí. 2) Vytvořte na látce skvrny od vína pomocí pipety a nechte je zaschnout. 3) Připevněte DESI zdroj ke vstupu do hmotnostního spektrometru a upravte geometrii zdroje (viz. Teorie a br. 2, 3 a 4). tevřete si program LCQ tune, ikonu najdete na ploše. tevřete si metodu C:\Xcalibur\methods\desi\cvicení_vino. Sprejovací špičku naplňte sprejovací kapalinou, upevněte ji do držáku, vložte čisté podložní sklíčko do zdroje a přisuňte k vyhřívané kapiláře. Spusťte ladění. Na displeji se objevují spektra pozadí (sprejovací kapaliny), píky o nízké intenzitě okolo 10E3 (viz. Příloha I). Nevidíte-li spektra, zastavte ladění a upravte geometrii nano-desi. Je-li signál stabilní, zastavte ladění. 4) Z tkaniny vystřihněte část skvrny cca 10x10 mm, připevněte ji na podložní sklíčko oboustrannou lepicí páskou a tkaninu zvlhčete 5-10 l 5 % kyselinou mravenčí. Vložte do zdroje. 5) Spusťte ladění. Vidíte-li ve spektru intenzivní píky anthokyaninů, tak zastavte ladění. Jsou-li píky anthokyaninů málo intenzivní nebo nevidíte žádný signál, upravte geometrii.
6) Spusťte akvizici spekter po dobu jedné minuty. Spektra uložte do složky D:\Data\Desi_cvičení. pakujte třikrát, přičemž mezi jednotlivými akvizicemi posuňte tkaninu o několik milimetru, abyste analyzovali novou pozici. Stejným způsobem pokračujte s ostatními skvrnami od vína. 7) Pomocí pipety vytvořte skvrnu neznámého vína na tkanině a po zaschnutí skvrnu analyzujte stejným způsobem jako v předchozím případě. Na základě hmot identifikujte anthokyaniny a přiřaďte odrůdu vína. 8) S protokolem odevzdejte vytištěná spektra s označenými píky anthokyaninů.
Příloha I. Spektrum pozadí DESI.
Příloha II. Seznam antokyaninů. č m/z název vzorec 1 287 kyanidin H + 2 301 peonidin H + 3 317 petunidin H + 4 331 malvidin H + H + 5 419 kyanidin-3-arabinosid
H + 6 449a kyanidin-3-glukosid H + 6 449b kyanidin-3-galaktosid H + 7 463 peonidin-3-glukosid H + 8 479 petunidin-3-glukosid
H + 9 493 malvidin-3-glukosid H + 10 505 peonidin-3-acetylglukosid H H C H 3 H + 11 535 malvidin-3-acetylglukosid H H H 3 C 12 581 kyanidin-3-sambubiosid H +
H + 13 609 peonidin-3-coumaroylglukosid H + 14 625 petunidin-3-coumaroylglukosid H + 15 625 peonidin-3,5-diglukosid H
H + 16 639 malvidin-3-coumaroylglukosid H + 17 641 petunidin-3,5-diglukosid H H + 18 655 malvidin-3,5-diglukosid H 19 743 kyanidin-3-sambubiosid-5-glukosid H H + H
H + 20 771 peonidin-3-coumaroylglukosid-5- glukosid H H + 21 801 malvidin-3-coumaroylglukosid-5- glukosid H