TECHNICKÁ ZPRÁVA PILOTNÍHO PROJEKTU Název pilotního projektu: Ověření technologie hromadné indukce triploidie u lína obecného v provozních podmínkách rybích líhní Registrační číslo pilotního projektu: CZ.1.25/3.4.00/09.00530 Příjemce dotace: Název nebo obchodní jméno: Rybářství Hluboká cz. s.r.o. Adresa: Tyršova 681, 373 41 Hluboká nad Vltavou IČ: 28087992 Registrační číslo pp: CZ.1.25/3.4.00/09.00530 Název pilotního projektu: Ověření technologie hromadné indukce triploidie u lína obecného v provozních podmínkách rybích líhní. Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna příjemce dotace zastupovat: Ing. Vladimír Kaiser Vědecký subjekt: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany IČ: 60076658 Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, 2. 11. 2010 Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna vědecký subjekt zastupovat: prof. PhDr. Václav Bůžek, CSc. Zpracovatel technické zprávy pilotního projektu: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany IČ: 60076658 Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, 2. 11. 2010 Jména a příjmení osob, které zpracovaly technickou zprávu: doc. Ing. Martin Flajšhans, Dr.rer.agr., Ing. Marek Rodina, Ph.D. Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna zpracovatele technické zprávy zastupovat: prof. PhDr. Václav Bůžek, CSc. 1
Souhlas s publikací technické zprávy: Souhlasím se zveřejněním této technické zprávy pilotního projektu v rámci opatření 3.4. Pilotní projekty z Operačního programu Rybářství 2007 2013 na internetových stránkách Ministerstva zemědělství a s využíváním výsledků této technické zprávy všemi subjekty z odvětví rybářství. Podpis osoby oprávněné zastupovat: 1. Příjemce dotace: Ing. Vladimír Kaiser 2. Partnera projektu (vědecký subjekt): prof. PhDr. Václav Bůžek, CSc. 3. Zpracovatele technické zprávy: prof. PhDr. Václav Bůžek, CSc. 2
Obsah: 1. CÍL... 4 1.1. Co je cílem pilotního projektu... 4 1.2. V čem tkví inovativnost testované technologie... 4 1.3. Proč je nutná inovace, která je předmětem testování... 4 2. ÚVOD... 5 3. MATERIÁL A METODIKA... 6 4. VÝSLEDKY... 8 5. ZÁVĚR... 9 6. PŘÍLOHY... 9 3
1. Cíl 1.1. Co je cílem pilotního projektu Cílem pilotního projektu bylo ověření technologie hromadné indukce triploidie u lína obecného v provozních podmínkách rybí líhně s optimalizací výnosu triploidního váčkového plůdku pro potřeby nasazení plůdkových výtažníků, s ohledem na dosažení maximálního procenta indukovaných triploidů v potomstvu ve stadiu váčkového plůdku při maximalizaci procenta oplozenosti jiker a líhnivosti plůdku vůči kontrole. Dalším postupným cílem bylo sledování užitkových vlastností triploidního plůdku v rybničním odchovu. 1.2. V čem tkví inovativnost testované technologie Inovativnost testované technologie spočívá v rozpracování postupu, publikovaného v laboratorním měřítku, v technologii hromadné indukce triploidie u velkého množství jiker najednou tak, aby tato technologie byla využitelná v produkčním měřítku sladkovodního rybářství, k získání velkého množství triploidního plůdku k nasazení do odchovných rybníků. Kroky k získání dostatečného množství triploidního plůdku k odchovu jsou zde maximalizace ukazatelů a) oplozenosti jiker, b) líhnivosti plůdku a c) získání co nejvyššího procenta triploidů, které společně vedou k maximalizaci výnosu triploidního plůdku. Jedná se o inovaci pro celé odvětví rybářství v České republice, která doposud nebyla rybářským podnikem v provozu využita. 1.3. Proč je nutná inovace, která je předmětem testování Indukce triploidie chladovým šokem je příkladem toho, kdy nelze postup úspěšný v laboratorním měřítku úspěšně aplikovat v praxi prostým zvětšením kapacity a tuto technologii je nutné inovovat. Zásadními kroky zde bylo a) nastavení teploty ledové lázně pro chladový šok na nižší úroveň, než byla doporučována v literatuře, b) rychlost zchlazení jiker na počátku chladového šoku a c) zamezení přímého kontaktu oplozených jiker (ve stadiu před dokončením II. fáze meiózy) s ledem přítomným v ledové lázni. 4
2. Úvod Předmětem testování je metodika indukce triploidie chladovým šokem, která vychází z práce Flajšhanse a Linharta (2000). Principem technologie hromadné indukce triploidie u lína obecného aplikací chladového šoku je hromadné vystavení oplozených jiker, které byly aktivovány a inkubovány v teplotě 20 C, chladovému šoku o teplotě 1 2 C v přesně stanovené době a na stanovenou dobu expozice. Za normálního vývoje by v tomto období došlo k vytvoření dělicího vřeténka, k oddělení druhého pólového tělíska a z oplozené jikry po splynutí samčího a samičího pronukleu by vznikl diploidní jedinec. Fyzikální šok (chladový, teplý nebo změnou hydrostatického tlaku) způsobí depolymerizaci tubulinu (hlavní stavební součásti dělicího vřeténka), k oddělení druhého pólového tělíska nedojde a z oplozené jikry pak ze samčího a samičího pronukleu a ze zadrženého druhého pólového tělíska vznikne triploidní jedinec, který ponese v každé somatické buňce tři sady chromozomů. Chladový šok je z provozního hlediska nejjednodušším postupem, který lze na běžné líhni aplikovat. Triploidní samice (jikernačky) jsou sterilní, triploidní samci (mlíčáci) mohou za určitých okolností produkovat snížené množství pohyblivých, většinou aneuploidních spermií (Linhart a kol., 2006). Sterilita, resp. substerilita triploidů lína obecného se projeví zvýšeným růstem v období pohlavního dospívání a po dosažení pohlavní dospělosti jejich diploidních sourozenců, kdy lze očekávat projev přínosu této technologie. Z ekonomického hlediska má tedy smysl produkovat triploidy k pokrytí poptávky po těžkém tržním línu nad 250 g tržní hmotnosti, kdy Flajšhans a kol. (2004, 2010) zjistili, že při odchovu ve společné obsádce v monokultuře mohou triploidní samice ve věku L 4 mohou dorůst až 2,36x vyšší tržní hmotnosti než jejich diploidní sourozenci. 5
3. Materiál a metodika Testovaným druhem ryby byl lín obecný (Tinca tinca L.). Předmětem práce byla kategorie generačních ryb (L g ), pohlavních produktů (jiker a spermií) lína, inkubujících se jiker, váčkového plůdku (L 0 ) a plůdku (L 1 ). Výběr generačních ryb, jejich předvýtěrová příprava, hormonální stimulace generačních ryb, odběr gamet a manipulace s nimi probíhala dle protokolu Linharta a kol. (2000, 2006 a, b). Umělým výtěrem byly získány gamety od 75 generačních ryb (25 samců a 50 samic). Sperma bylo odebíráno do imobilizačního roztoku dle Kurokury (Rodina a kol. 2004). Použito bylo celkem 30 ml spermatu v imobilizačním roztoku a 1 005 g jiker. Do doby použití byly gamety uchovávány dle Linharta a kol. (2000, 2006 a, b). K aktivaci gamet bylo použito vody z líhně, temperované na 20 C. Voda byla temperována 2 kw závěsným termostatem Julabo ve 40 l plastové nádobě. Technologická sestava pro hromadnou indukci triploidie chladovým šokem byla sestavena před zahájením umělého výtěru podle schématu na Obr. 1. Ze zpracovny ryb byl v polystyrenových termoboxech dovezen šupinový led. Do laminátového žlabu v líhni (Obr. 1, položka 1) bylo napuštěno 600 l vody z líhně. Nad žlab byl umístěn 3kanálový registrační digitální teploměr (6) a jedno jeho čidlo bylo umístěno do vodního sloupce ve žlabu. Přidáním dostatečného množství šupinového ledu byla vytvořena ledová lázeň (2) o teplotě 0,5 C. Do žlabu bylo ponořeno akvaristické čerpadlo (3) o výkonu 700 l.h -1 s hadicovým rozvodem vody, čímž byla zabezpečena cirkulace ledové vody ve žlabu. Do ledové lázně byla umístěna plastová nádoba (4) o objemu 40 l pouze s vychlazenou vodou bez kusového ledu. Do nádoby byla umístěna další dvě čidla registračního teploměru, a to ke dnu (tj. do místa, kam budou převedeny oplozené jikry) a pod hladinu. Stopky (7) k měření času od aktivace gamet do začátku šoku a k měření expoziční doby byly umístěny vedle registračního teploměru. Ověřovaný technologický postup vycházel z práce Flajšhanse a Linharta (2000): směs jiker byla oplozena heterospermicky (10 ml heterospermatu v imobilizačním roztoku na 300-400 g jiker). Aktivace byla provedena okamžitě po osemenění pomocí desetinásobného množství vody, než bylo množství heterospermatu v imobilizačním roztoku. K aktivaci bylo použito vody z líhně temperované na 20 o C. Od okamžiku aktivace gamet byl měřen čas na stopkách (7). Čas aktivace gamet byl zaznamenán jako čas 0 min. Misky s aktivovanými jikrami byly uchovány ve 20 o C. Po +2 minutách od aktivace gamet bylo provedeno odlepkování jiker alkalázou (Alcalase, Merck EC 3.4.21.14.) podle metodiky Linharta et al. 6
(2000) v dávce 100 ml pracovního roztoku enzymu na každých 100 g jiker. Pracovní roztok byl vytvořen naředěním enzymu ve vodě z líhně temperované na 20 o C a přidán do misky s jikrami, z nichž byla předem slita voda. Odlepkování bylo provedeno opatrným mícháním jiker s roztokem enzymu po dobu 2 min. Před ukončením odlepkování byl enzym slit a přesně dvě minuty od začátku odlepkování (tedy +4 min od aktivace) byly jikry 3krát po sobě propláchnuty čistou vodou z líhně o teplotě 20 o C. V +4 min 30 s po aktivaci gamet byla z jiker slita přebytečná voda a v +5 min po aktivaci gamet byly jikry (6) převedeny do plastové nádoby (4) s ledovou vodou na expoziční dobu 35 min, s ukončením v čase +40 min od aktivace gamet. Teplota vody v nádobě byla v případě potřeby udržována ručním přiléváním ledové vody a jikry byly udržovány v mírné cirkulaci mícháním vody v nádobě. Průběh a rozložení teplot ledové lázně, jiker a vody v nádobě s jikrami je znázorněn na Obr. 2. Po ukončení chladového šoku v čase +40 min od aktivace gamet byla plastová nádoba vyjmuta z ledové lázně a voda slita. Jikry byly 3x propláchnuty vodou z líhně o teplotě 20 C a vysazeny k inkubaci do Zugských lahví, zásobovaných vodou z líhně o teplotě 19,4 ± 0,5 C. S kontrolní skupinou diploidů bylo manipulováno stejně, bez aplikace chladového šoku. Do 24 h po aktivaci gamet byla stanovena oplozenost jiker v % a z počtu ks plůdku po vykulení zjištěného objemovou metodou byla stanovena líhnivost plůdku v % (Tab. 1). Ověření triploidní konstituce rozplavaného plůdku bylo založeno na stanovení relativního obsahu DNA průtokovou cytometrií podle Linharta a kol. (2006b). Z procenta oplozenosti, líhnivosti a z procenta triploidních larev ve vzorku byl vypočítán výnos triploidů. Rozplavaný plůdek byl vysazen do plůdkových výtažníků v areálu Ostrov Čejkovice, Rybářství Hluboká cz s.r.o. Do 1 rybníka bylo vždy nasazeno společně 100 000 ks diploidního a 100 000 ks triploidního plůdku k testování užitkovosti podle prováděcí vyhlášky k plemenářskému zákonu č. 154/2000 Sb. ve znění pozdějších předpisů. Diploidní plůdek sloužil jako kontrolní skupina. Rybníky nebyly na podzim 2010 pracovníky Rybářství Hluboká cz s.r.o. přeloveny, proto nebylo možné zjistit počet vyloveného plůdku a % přežití z L 0 na L 1. Biometrické ukazatele diploidního a triploidního plůdku byly stanoveny ze vzorků á 30 ks ryb, odlovených v říjnu na plné vodě. Z ryb byla punkcí srdce odebrána krev podle metodiky Svobodové a kol. (1991) k ověření ploidie analýzou relativního obsahu DNA průtokovou cytometrií v jádrech krvinek. 7
4. Výsledky Optimalizací metodiky bylo opakovaně získáno 100% triploidního lína ve stadiu rozplavání plůdku (Tab.1; Obr. 3). Průměrná oplozenost jiker po chladovém šoku byla 65%, oplozenost kontroly byla 75%, tj. průměrná oplozenost triploidů dosahovala 86,67% kontroly. Průměrná líhnivost triploidního plůdku byla zjištěna na úrovni 58,05%, průměrná líhnivost kontroly byla 67,5%, tj. průměrná líhnivost triploidů dosahovala 86% kontroly, což lze v provozních podmínkách považovat za velmi dobrý výsledek. Z celkem 705 g jiker podrobených chladovému šoku bylo získáno přes 650 000 ks (přesně 658 584 ks) triploidního plůdku k nasazení do plůdkových výtažníků. Biometrické zhodnocení diploidního a triploidního plůdku, rozlišeného podle relativního obsahu DNA průtokovou cytometrií v jádrech krvinek, neshledalo v délkovém ani hmotnostním růstu diploidního a triploidního L 1 žádný významný rozdíl (Obr. 4 a 5). Výpočtem korigované hmotnosti triploidů podle vzorce: h k = h. (k 1 /k 2 ), kde h k je korigovaná hmotnost hodnoceného triploida, h je skutečná hmotnost hodnoceného triploida, k 1 je průměrná hmotnost kontroly (diploida) ze všech rybníků a k 2 je průměrná hmotnost kontroly (diploida) v hodnoceném rybníku, byla zjištěna korigovaná hmotnost pro triploidní L 1 2,21 ± 0,48 g oproti přímo zjištěné hodnotě 2,16 ± 0,46 g, zatímco hmotnost kontrolní skupiny diploidů byla 2,29 ± 0,66 g. 8
5. Závěr Lze konstatovat, že cíl pilotního projektu ověřit technologii hromadné indukce triploidie u lína obecného v provozních podmínkách rybí líhně s optimalizací výnosu triploidního váčkového plůdku pro potřeby nasazení plůdkových výtažníků byl úspěšně splněn. Předložený technologický postup indukce triploidie chladovým šokem je technicky nenáročný a s použitím ledu, teploměru, stopek a běžných líhňařských pomůcek jej lze aplikovat na kterékoli rybí líhni v ČR. Domníváme se proto, že testovanou technologii lze doporučit k využití v rybářské praxi. Růstový potenciál triploidů se podle očekávání projeví až během pohlavního dospívání ryb, proto doporučujeme pokračovat ve sledování dané problematiky podáním nového návrhu pilotního projektu s touto tématikou. Použitá literatura: Flajšhans M., Kocour M., Gela D. and Piačková V. 2004. The first results on interactions among diploid, gynogenic and triploid tench, Tinca tinca (L.) under communal testing. Aquacult. Int. 12: 103 118. Flajšhans, M., Linhart, O., 2000. Produkce triploidních línů. Edice Metodik VÚRH Vodňany, č. 62, 14 s. Flajšhans, M., Gela, D., Kocour, M., Buchtová, H., Rodina, M., Pšenička, M., Kašpar, V., Piačková, V., Sudová, E., Linhart, O., 2010. A review on the potential of triploid tench for aquaculture. Reviews in Fish Biology and Fisheries 20: 317 329 Linhart, O., Gela, D., Flajšhans,M., Rodina, M., 2000. Umělý výtěr lína obecného s použitím enzymu k odlepkování jiker. Edice Metodik VÚRH Vodňany, č. 65, 14 s. Linhart O., Rodina M., Kocour M. and Gela D. 2006a. Insemination and gamete management in tench, Tinca tinca (L.). Aquacult. Int.14: 61-73. Linhart, O., Rodina, M., Flajšhans, M., Mavrodiev, N., Nebesářová, J., Gela, D., Kocour, M., 2006b. Studies on sperm of diploid and triploid tench, Tinca tinca (L.). Aquaculture International 14 (1-2): 9-25. Rodina M., Cosson J., Gela D., Linhart O., 2004. Kurokura solution as immobilizing medium for spermatozoa of tench (Tinca tinca L.) Aquaculture International, 12, 119-131. Svobodová Z., Pravda, D., Paláčková,J., 1986. Jednotné metody hematologického vyšetřování ryb. Edice metodik VÚRH Vodňany č. 22, 36 s. Ve Vodňanech dne 2. 11. 2010 doc. Ing. Martin Flajšhans, Dr.rer.agr. řešitel projektu 9
Teplota [ C] 6. Přílohy Obr.1: Schéma chladového šoku k hromadné indukci triploidie u lína obecného. 1 laminátový žlab 2 ledová lázeň (voda z líhně se šupinovým ledem) 3 čerpadlo s rozvodem vody 4 plastová nádoba 5 oplozené jikry lína ve vychlazené vodě (bez přítomnosti kusového ledu) 6 kanálový registrační digitální teploměr s čidly a) u dna nádoby 4, b) u hladiny nádoby 4, c) v ledové lázni 2 7 stopky (timer) 3.0 jikry u hladiny jikry u dna lázeň 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Čas [min] Obr. 2: Rozložení a dynamika teplot v průběhu 35 min chladového šoku. modrá - teplota ledové lázně oranžová teplota u dna nádoby s jikrami červená teplota u hladiny nádoby s jikrami 10
Obr. 3: Výsledky analýzy relativního obsahu DNA průtokovou cytometrií v jádrech somatických buněk diploidního (2n) a indukovaně triploidního (3n) plůdku lína obecného před rozplaváním. Hodnota obsahu DNA (tabulka vpravo nahoře, sloupec DNA cont.) potvrzuje 1,53násobný obsah DNA v jádrech buněk indukovaně triploidního lína, a tedy úspěšnou indukci triploidie. Varianta Navážka jiker (g) Oplozenost jiker (%) Líhnivost plůdku (%) Triploidů ze vzorku (%) Výnos triploidů (ks) Triploidizace 1 300 62,0 55,8 100 267 840 Triploidizace 2 405 67,2 60,3 100 390 744 Kontrola 300 75,4 67,5 0 0 Tab.1: Výsledky ověření technologie hromadné indukce triploidie chladovým šokem. Optimalizací metodiky bylo získáno 100% triploidního lína ve stadiu rozplavání plůdku. Z celkem 705 g jiker bylo získáno přes 650 000 ks (přesně 658 584 ks) triploidního plůdku k nasazení do plůdkových výtažníků. 11
CD (mm) Hmotnost (g) 3.5 3 a a 2.5 2 1.5 1 0.5 0 2n Ploidní úroveň 3n Obr. 4: Průměrná hmotnost diploidního (2n) a triploidního (3n) plůdku L 1, směrodatná odchylka a statistické zhodnocení významnosti rozdílu. Data se stejným abecedním indexem se významně neliší při P < 0.05. 61 60 59 58 57 a a 56 55 54 53 52 51 2n Ploidní úroveň 3n Obr. 5: Průměrná celková délka diploidního (2n) a triploidního (3n) plůdku L 1, směrodatná odchylka a statistické zhodnocení významnosti rozdílu. Data se stejným abecedním indexem se významně neliší při P < 0.05. 12