GENOVÉ TERAPIE GENOVÉ TERAPIE

GENOVÉ TERAPIE přístup léčby nebo prevence genově podmíněných nemocí změnou exprese genů člověka GENOVÉ TERAPIE zatím ve většině případů pouze v experimentálním stádiu GENOVÁ TERAPIE SOMATICKÁ genom nemocného je pozměněn, ale změna není přenášená do další generace GENOVÁ TERAPIE ZÁRODEČNÁ genom je změněn přímo ve vajíčku nebo spermii a změna je přenášená do dalších generací, zatím neprobíhá u člověka a vyšších obratlovců (celosvětové moratorium) 1

GENOVÉ TERAPIE a) změna v jednom genu srpkovitá anémie jednobodové mutace, např. b) multigenové poruchy mutace ve více genech často se uplatňuje i vliv prostředí, např. srdeční poruchy, cukrovka, nebo rakovina c) mitochondriální poruchy mutace v mitochondriální DNA, letální, způsobují poruchy řady ogá orgánů ů d) chromozomální abnormality ztráta či zmnožení celých či částí chromozomů, např. Downův syndrom GENOVÉ TERAPIE In vivo Ex vivo 2

Metody doručení genu do tkáně injekce čisté DNA přímo do nádoru injekční stříkačkou genetické dělo DNA obalující zlaté partikule a vstřelená do epidermis silné heliové dělo (nepoužívá se pro nádory) lipofekce DNA obalená do lipozomů a dodána do tkáně intravaskulárně, intratracheálně, perorálně) biologickými vektory virálního původu V současné době nejpoužívanější a nejefektivnější způsob terapie metody doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY: oncoretroviry (virus Rousova sarkomu kuřat, virus, Moloney murine leukaemia virus ) - jsou schopny atakovat pouze dělící se buňky (neprochází kompaktní jadernou membránou) - napadají především T-lymfocyty - pouze ex-vivo terapie a náhodná integrace do hostitelského genomu - maximální velikost transgenu do 7.5 kbp - retroviry nezpůsobují lyzi buňky 3

metody doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY: onco RETROVIRY cis pozice: musí být přítomný na virionu LTR long terminal repeats potřebné pro integraci do host.genomu a zároveň funguje jako promotor ψ potřebný pro obalování genomové RNA do virionů trans pozice: jsou přítomné na jiné DNA, např. již v genomu napadené selekční marker buňky: gag, pol, env obalový protein, RT, přenášeč přes sodíkovou pumpu host.buňky 5 LTR ψ Packaging transgen Neo r 3 LTR balicí buňka je nakažená wild-typovým virem (pomocný retrovirus) a do jejího genomu se zabudovávají geny pro infekčnost virové částice pak je do této buňky plasmidem přenesen konstrukt nesoucí virové balící (packaging) úseky, transgen a selekční marker po integraci do genomu se vyselektují neomycinem balící buňky produkující viriony jak rekombinantního tak pomocného viru. 4

metody doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY: onco RETROVIRY PROBLÉM: pomocný virus soutěží s transgenním, což vede k poklesu účinnosti infekce sousedních hostitelských buněk pomocným virem může aktivovat protoonkogeny ŘEŠENÍ: nejdřív se vytvoří pomocné buňky, které jsou infikovány pomocným virem, který má inaktivován balící signál ψ linie těchto pomocných buněk je pak napadená rekombinantním retrovirem, který má funkční balicí signál ψ PRAXE: odebereme kostní dřeň pacienta, buňky kultivujeme in vitro, provedeme jejich infekci, vyselektujeme stabilní linii produkující viriony nesoucí transgen a intravenózně vneseme zpět do pacienta. NEBEZPEČÍ: infekce sousedních hostitelských buněk pomocným virem může aktivovat protoonkogen, tím že se zabuduje do jeho blízkosti a začne ho přepisovat transgenová virová DNA se zabuduje do genu pro nádorový supresor a inaktivuje ho metody doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY: LENTIVIRY mohou nahradit klasické retroviry, jelikož jsou schopny infikovat a integrovat svůj genom do nedělících buněk např. neurony, makrofágy, hematopoetické kmenové buňky a buňky svalů a jater lentiviry také mohou vyvolat AIDS u člověka delece v LTR, není schopen produkovat infekční částice ale schopen integrace kočičí lentivirus který neúčinkuje na člověka FIV feline immunodeficiency virus Wang, G., et al.(1999). Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. J.Clin.Invest.104:55-62. 5

metody doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY: ADENOVIRY dsdna viry napadají všechny typy buněk virální DNA se neintegruje do genomu hostitele exprese je silná ale pouze dočasná (max. měsíc) způsobují silnou imunitní odpověď (exprese wild-type proteinů virové částice) nová generace adenovektorů neobsahující přirozené geny nejsou vhodné pro léčbu nádorových buněk protože ty na ně nemají receptory metody doručení genu do tkáně VIRÁLNÍ VEKTORY: Adeno Asociated viruses (AVV) dsdna viry nikdy nespojovány s lidskými nemocemi napadají všechny typy buněk virální DNA se může integrovat do genomu hostitele na specifickém místě (u člověka na konci 19tého chromozomu) exprese je ale slabá a vektory mají malou kapacitu 4kb nezpůsobují silnou imunitní odpověď AAV Adenovirus Retrovirus/Lentivirus nahá DNA 6

metody doručení genu do tkáně vektor nevirální bez limitu snadnost produkce integrace do genomu trvání exprese transdukce nedělících se buněk existující imunita bezpečnost +++ zřídka dočasná ++ ne +++ ne přeno s do potom stva kapacita onkoretroviry 8 kb ++ ano stabilní - ne inserční mutagenese aktivace onkogenů lentiviry 8 kb + ano stabilní ++ ne inserční mutagenese aktivace onkogenů adenoviry 30 kb + ne dočasná +++ ano hyperimunitní odpověď může může ne adeno asociated virus AAV Herpes viry 4.6 kb + možná dlouhotrvající ++ slabá +++ může 150 kb + ne dočasná ++ ano hyperimunitní odpověď ne nemoci v současnosti léčené genovou terapií př. ve fázi klinického testování nemoc defekt cílové buňky četnost těžká imunodeficience adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1/1.000.000 (SCID) T-lymfocyty hemofilie krevní faktor VIII a IX játra, svaly 1/1.000.000 muži Cystická fibrosa transmembránový regulátor CF plicní alveoly 1/2.500 deficience na rozedma plic plicní alveoly 1/3.500 alfa antitrypsin rakovina nespecifické mnoho 1/4 Neurologické nemoci degradace neuronů neurony v mozku 1/250 Parkinson, Alzheimer kardiovaskulární nemoci arterosklerosa cevní endotel ½ infekční nemoci T-lymfocyty, makrofágové b. AIDS, hepatitis B 7

http://www.wiley.co.uk/genetherapy/ clinical/ SCID severe combined imunodeficiency těžká imunodeficience Jedna z forem se projevuje nedostatkem aktivního enzymu adenosine deaminasy (ADA) adenosin se nepřeměňuje na inosin ale vzniká deoxyadenosin, který inhibuje metabolismus deoxyribonukleotidu tato nedostatečnost způsobuje zpomalení dělení rychle se poliferujících buněk jako jsou T-lymfocyty výrazně zvýšená náchylnost k infekcím bubble boy disease 8

SCID severe combined imunodeficiency těžká imunodeficience od 80let se tato nemoc lečí transplantací kostní dřeně (neúspěšné) 1986 se začaly podávat injekce hovězí ADA stabilizované PEG intramaskulárně (nutno podstupovat každé dva týdny, ADAGEN ), často končilo hemofilií pacienta 1990 první pokus genové terapie na člověku 4leté dívce Ashanti DeSilva. Její T-lymfocyty byly upraveny ex-vivo normálním ADA pomocí vektoru odvozeného od MoMLV. (William Anderson, Michael Blaise, and Ken Culver) nutno podstupovat každý rok, životnost transformovaných T-leukocytů (6-12 měsíců). Dívka stále žije. u dalších pacientů, kombinovaná léčba s ADAGENem 2002-5 chlapců svážnější X-vázanou SCID podstoupilo genovou terapií ex-vivo, u čtyřech se do roka stav výrazně zlepšil, u dvou z nich bohužel propukla leukémie. pokusy pozastaveny a zdokonaluje se metodika, transgen se zabudovává do genomu T-leukocytu s oblibou do blízkosti onkogenu. PG1 Cystická fibróza mutace v iontovém přenašeči CFTR transmembrane conductance regulator nejvíce postihuje plicní alveoly, střevní epitel a pankreas zvýšena produkce hlenu, citlivost k plicním infekcím. výhodou pro terapii je že stačí pouze několik k molekul l proteinu na buňku aby se jí vrátila normální funkčnost. úspěšné pokusy v kulturách a na myších transformovaných pomocí liposomů u lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru nesoucího transgen CFTR do nosu, účinné v plicích, nepůsobí na slinivku 9

Snímek 18 PG1 he CFTR is found in the epithelial cells of many organs including the lung, liver, pancreas, digestive tract, reproductive tract, and skin. Normally, the protein moves chloride ions (with a negative charge) out of an epithelial cell to the covering mucus. This results in an electrical gradient being formed and in the movement of (positively charged) sodium ions in the same direction as the chloride via a paracellular pathway. Due to this movement, the water potential of the mucus is reduced, resulting in the movement of water here by osmosis and a more fluid mucus. Petr Galuszka; 29/04/2009

nemoci v současnosti léčené genovou terapií 2003 asi 330 povolených protokolů (přes 6.OOO pacientů) Dědičné monogenické nemoci ADA deficience, Alpha-1 antitrypsin deficience, OTC deficience, chronic granulomatous disease, hemofilie, cystická fibróza, vrozená hypercholesterolemie, Fanconiho anemie, Gaucherova choroba, Hunterův syndrom, Parkinsonova nemoc infekční nemoci HIV získané nemoci artritida ostatní rakovina 70% všech protokolů kardiovaskulární nemoci rizika 1999 první případ zbytečného úmrtí po genové terapii geneticky podmíněná nemoc: deficience ornitin transkarbamylasy močovinový cyklus: odbourávání amoniaku klasická léčba: dieta na proteiny s nízkým obsahem aminokyselin bohatých na dusík + dodatečně podávaný citrulin mortalita 50% pacienti se dožívají pokročilého věku 19-letý pacient zemřel po genové terapii provedené adenovirovým vektorem 10

PG2 Alzheimerova choroba 2001 jako transgen použit NGF nerve growth factor z myši (zvyšuje vitalitu neuronů) z pacientů byly odebrány fibroblasty, ex vivo infikovány AAV nesoucí NGF fibroblasty z pokožky lze snadno transformovat a nemají tendenci se nekontrolovatelně množit v systému neuronů, kde mají nedostatek místa neurochirurgicky pak byly voperovány do buněk cholinergického systému (jeho buňky produkují acetylcholin neurotransmiter) u pacientů demence zpomalena o 50%, jeden zemřel při pokusu provést operaci bez narkózy efekt není dlouhotrvající, připravuje se virem zprostředkovaná terapie Dr. Mark Tuszynski Alzheimerova choroba příčiny: Dr. Karen Asheo (2006) nadměrná aktivita genu APP amyloid precursor protein transgenní myši s tímto lidským genem výrazně zhoršená paměť již ve středním věku produktem enzymu APP je beta-amyloid (peptid cca 40 ak) nadměrná aktivita genu APP již kolem 30 roku věku člověka vytváří shluky beta amyloidů (dodekamery), které se hromadí mezi neuronovými spoji (synapse) projevuje se jako vynecháp j j j y vání paměti, v pokročilém věku Alzheimerova choroba 11

Snímek 21 PG2 v roce 2008 přimá in vivo injekce AAV with NGF do mozku Petr Galuszka; 29/04/2009

genetický základ rakoviny PROTOONKOGEN strukturní gen kódující protein podílející se na dělení buňky (značka: c-onc) typy: geny kódující růstové faktory (např. cytokiny) (c-sis) geny kódující receptory růstových faktorů (c-erbb-1) geny kódující G-proteiny (přenašeče extracelulárních signálů, c-ras) geny kódující proteinové kinasy (c-src, onkogen Rousova sarkomu) geny kódující transkripční faktory (c-fos, c-jun) aktivace na ONKOGENY: mutací zmnožením (zesílení exprese) translokací (nejčastěji mezi chromozomy 8 a 14) retrovirální transdukce (přenesením z virového genomu) onkogeny nejsou dědičné, s výjimkou jednoho RET onkogen, odpovědný za medulární karcinom štítné žlázy genetický základ rakoviny NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny) kódují proteiny, které v somatických buňkách potlačují jejích proliferaci a udržují je v G 0 fázi. nejznámější p53 protein kódovaný TP53 genem, aktivuje inhibitor CDK přirozeně sevbuňkách výrazně zvyšuje jeho exprese po radiaci či působení dalších karcinogenních látek, nazýván také jako strážce genomu mutací ztrácí aktivitu a buňky se začnou dělit i během UV radiace a genom mutuje. mutované supresorové geny se většinou dědí, jejich projev je recesivní, u potomku nesoucí jednu zmutovanou alelu je daleko větší pravděpodobnost že jim zmutuje i druhá a p53 přestane být funkční. Mutantní formy supresorových genů vznikají v zárodečných buňkách. (tzv.predispozice K RAKOVINĚ) mutace TP53 genu je zodpovědná za 70% všech nádorů tlustého střeva, 50% nádorů plic a 40% nádorů prsu. 12

genetický základ rakoviny NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny) 2002 připravená myš overexprimující p53 protein (předpokládalo se že myš bude odolná vůči rakovině) + myš byla čtyřikrát odolnější k rakovině než kontrola - zkrácený životní cyklus o 20% měknutí kostí, rozpad orgánů, zvýšená náchylnost k psychickému stresu, vypadávaní srsti předpoklad: hyperaktivita p53 vysaje z těla všechny kmenové buňky dříve než u kontrolní myši PG3 genetický základ rakoviny NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny) kódují proteiny, které v somatických buňkách potlačují jejích j proliferaci a udržují je v G 0 fázi. prb protein pojmenován podle toho že byl objeven v souvislosti s dětským retinoblastomem blokuje buněčný cyklus tím, že inhibuje transkripční faktor E2F E2F aktivuje všechny geny, které jsou aktivní v S-fázi mutace v prb proteinu byla prokázána u 4O% typů nádoru u člověka 13

Snímek 26 PG3 roteiny patřící do p16 rodiny inhibují především aktivitu komplexů cdk4 a cdk6 s cykliny D, které se podílejí na fosforylaci nádorového supresoru Rb (protein retinoblastomu). Fosforylace proteinu Rb je kritickým krokem při regulaci jeho antionkogenního účinku a buňky, které jsou zablokovány v G1 fázi buněčného cyklu, se vyznačují přítomností hypofosforylované formy tohoto proteinu. Tato forma proteinu Rb tvoří komplexy s celou řadou pozitivních transkripčních faktorů jako jsou proteiny rodiny E2F, kontroluje jejich funkci, brání transkripci DNA a tím vyvolává zastavení buněčného cyklu v G1/S kontrolním bodě. Je-li protein Rb hyperfosforylován, jsou transkripční faktory E2F z tohoto komplexu uvolněny a je umožněno započetí transkripce a další průběh buněčného cyklu Petr Galuszka; 29/04/2009

genetický základ rakoviny obecně lze tvrdit, že většina rakoviny je způsobená poruchou funkce protein kinas podílejících se na regulaci buněčného cyklu inhibitory různých typu kinas jsou nejčastěji používaná kancerostatika látky extrahované ze sójí genistein a daidzein kurkumin tokoferol sukcinát (vitamín E) beta-karoten antioxidanty selen, resveratrol ze zeleného čaje j inhibují oxidanty, které aktivují regulační centra protein kinas typu C genetický základ rakoviny ONKOGENNÍ VIRY inzerční aktivace protoonkogenu (pouze u zvířat) DNA přepsaná z retroviru se začlení před protoonkogen a začne jej svým silným promotorem přepisovat transdukce akutně transformujícími retroviry (pouze u zvířat) virový genom se integruje do blízkosti protoonkogenu integrovaný genom se přepisuje do primárního transkriptu ohraničeného LTR sekvenci, může však vznikat i delší primární transkript nesoucí exony protoonkogenu oba transkripty se sbalí do stejného virionu dochází k nelegitimní rekombinaci během RT při napadení host.buňky LTR gag pol env LTR v-onc LTR gag pol env LTR LTR gag pol v-onc LTR 14

genetický základ rakoviny ONKOGENNÍ VIRY tento nově vzniklý rekombinatní virus je defektní v replikaci, je schopen infikovat další hostitelské buňky pouze v přítomnosti pomocného viru protoonkogen prodělává během replikace viru spoustu mutací až zmutuje v onkogen př. virus Rousova sarkomu kuřat (RSV) virus ptačí myeloblastózy (AMV) Moloneyův virus myší leukemie (MVML) karcinogeneze navozena virovými geny (adenoviry) některé DNA viry obsahují geny jejíchž produkty narušují regulaci buněčného dělení - aktivace S fáze proteiny většinou zesilují funkci transkripčních faktorů nebo vytěsňují regulační proteiny buněčného cyklu SV40 opičí virus nebylo prokázáno vyvolání rakoviny těmito typy virů u člověka PG2 PG1 genetický základ rakoviny viry způsobující rakovinu u lidí nesou informaci pro onkogen asi 20% veškerých karcinogenních onemocnění je způsobeno viry T-leukémie (HTLV virus onco retrovirus) infekce probíhá během porodu nebo kojení mezi dospělými se přenáší ř sex.stykem z muže na ženu virus potřebuje dlouhé latentní období (30 let) největší výskyt Japonsko, Karibská oblast a střední Východ (asi každý 500 člověk infikován) nemoc propuká pouze u 1% infikovaných v Evropě kolem 10 infikovaných jedinců na 100.000 obyvatel retrovirus, kromě pol gag a env genů nese informaci pro proteiny p40tax a p21rex, ty mohou transaktivovat protoonkogeny, nebo některé další regulační č proteiny člověka virus hepatitidy B (HBV) - hepadnavir -způsobuje akutní infekce - v chronické podobě mohou přecházet v nádor jater (hepatom) spojený s cirhózou -na světě v současné době napadeno cca čtvrt miliardy lidí endemické oblasti hlavní příčina úmrtnosti (1/4 miliónu ročně) 15

Snímek 30 PG1 PG2 Včasné očkování proti hepatitidě B může zabránit rakovině jater. Chronická žloutenka typu B je totiž v 60-82 % případů příčinou jejího vzniku. Jako ochranu před rakovinou ho doporučují odborní lékaři i nový Evropský kodex proti rakovině, kde je zahrnuto mezi deset nejdůležitějších bodů preventivní ochrany. galuszka; 30/04/2009 Genom HBV patří mezi nejmenší DNA viry (obsahuje zhruba 3200 párů bazí) s cirkulární dsdna. Díky omezené genetické výbavě kóduje jen několik proteinů: Nukleokapsidový protein (HBsAg), který je nezbytný pro sestavování virionu a tvoří složku nukleokapsidy. Dále je kódován rozpustný antigen HbeAg, který je uvolňován z buňky a koluje ve vysokém titru v séru. Tento antigen potlačuje imunitní reakci vůči viru. Genom viru umožňuje vytvářet rovněž tři obalové proteiny, všechny glykosylované. Jsou podstatou povrchového antigenu HBsAg a označují se S, M a L protein. Z proteinů S a M jsou tvořeny malé kulovité a vláknité částice, kterých je v infikované buňce stokrát více než kompletních virionů a které ve významném množství kolují v krvi. M a L proteiny jsou významné pro přilnutí virionu k hepatocytu. Nestrukturální proteiny HBV jsou dva: Pol protein (virová polymerasa) a HBx protein vyvolávající transkripci v buňěčném jádře a replikaci HBV. Antigenní struktura Povrchový protein S nese tři antigenní determinanty: antigen a, další se vyskytuje ve specifitě d nebo y a poslední w nebo r. Kombinací těchto determinant můžeme dostat devět subtypů HBV. Určitý subtyp je typický pro narkomany, jiný pro homosexuály. Množení viru Replikace HBV začíná vazbou virionu na receptor hepatocytu. Uvolní se DNA viru a ta se dostává k jádru buňky, působí jako virový minichromosom. Ten je přepisován do čtyř sad různě velkých molekul RNA, z nich pak translací vznikají virové proteiny. Největší z těchto molekul je pregenomová RNA (pg RNA), slouží jako matrice pro reversní transkripci virového genomu. Virus tedy sice patří mezi DNA viry, ale ale replikuje svůj genom reversní transkripcií pgrna. Na rozdíl od retrovirů se ale pro vznik produktivní infekce nemusí integrovat do buněčného genomu. Protože se tedy při replikaci HBV přepisuje virová DNA do RNA a ta zpět do DNA, vznikají tak logicky mutace s větší pravděpodobností. Známý je tzv. precore mutant, který má potlačenou tvorbu HbeAg a je podstatně virulentnější, protože je rezistentní k interferinu. Často odpovídá za fulminantní průběh infekce. Mutací může být rovněž postižena a determinanta. Rezistentní mutanty vznikají při terapii lamivudinem. Onkogenita HBV Chronická infekce HBV vede k jaterní cirhóze a následně k hepatocelulárnímu karcinomu. Většina nádorů obsahuje virovou DNA, přičemž integrace HBV DNA předchází nádorovému množení buněk. Pravděpodobně proteiny HBV nemají onkogenní účinek. Riziko spíše představuje situace, kdy regenerují hepatocyty po infekci a to zvyšuje riziko vzniku nádorové buňky. galuszka; 30/04/2009

principy genové terapie rakoviny využití onkoretrovirálních vektorů doručení nemutovaného supresorového genu p53 doručení konstruktu zajišťující zastavení exprese onkogenu (antisense konstrukt) principy genové terapie rakoviny doručení sebevražedného genu přeměňující pro-drug na toxin 16

principy genové terapie rakoviny SEBEVRAŽEDNÉ GENY principy genové terapie rakoviny SEBEVRAŽEDNÉ GENY gangcyklovir ------------hsv-tk--------- gangcyklovir trifosfát (analog dttp blokuje syntézu DNA) 17

principy genové terapie rakoviny DALŠÍ SEBEVRAŽEDNÉ GENY transgen kóduje pro-drug jed mechanismus cytosin deaminasa 5-fluorocytosin 5-fluorouracyl antagonista pyrimidinu, blokuje RNA a DNA syntézu nitroreduktasa nitrobenzyloxykar bonylantracyklin antracyklin DNA crosslinker karboxyl esterasa CPT-11 SN38 inhibitor topoisomerasy cytochrom P450 cyklofosfoamid fosfoamid DNA alkylační činidlo linamarasa amygdalin kyanid blokátor dýchacího řetězce kondiční exprese sebevražedného genu pod specifickým promotorem aktivním pouze v rychle se dělících nádorových buňkách (např. promotor erbb-3 genu způsobující ptačí erytroblastózu) principy genové terapie rakoviny ONKOLYTICKÉ VIRY 18

principy genové terapie rakoviny ONKOLYTICKÉ VIRY nádorové buňky jsou cíleně ničeny lytickými viry 1956 bylo pozorováno že nádor ustupuje po virové infekci první klinicky testovaný virus byl defektní herpesvirus G207, který měl defektní vlastní ribonukleotid id reduktasu a mohl se tudíž replikovat pouze v dělících se buňkách, měl deleci také v genu způsobující virulenci ICP35.4 a tím byl oslaben a proto bezpečný proběhla I a II fáze klinického testování adenoviry aby se mohli množit v buňkách potřebují blokovat p53 protein (ten je nepřítomný v nádorových buňkách) adenovirus ONYX-015 má deletovaný gen pro protein, který blokuje p53 tento adenovirus proto nemůže atakovat zdravé buňky ale pouze nádorové v klinických testech zatím ne moc účinné HLAVNÍ PROBLÉM: imunitní systém člověka okamžitě virus ničí, proto málo účinné principy genové terapie rakoviny HIV může sloužit pro léčbu rakoviny (2005) HIV virus byl mutován byl mu odebrán gen způsobující propuknutí AIDS do genomu HIV byl naklonován sebevražedný gen (např. hsvtk) gen pro plášťový protein HIV byl nahrazen genem pro plášťový protein Sindbis viru (hmyzí virus), který specificky rozpoznává P-glykoproteiny na povrchu buněk většina nádorových buněk obsahuje na povrchu právě P- glykoproteiny dál přidali gen pro luciferasu aby mohli infekci sledovat testování na myši napadené buňkami metastázujícího melanomu, které byly naklonovány tak aby nesly na povrchu lidské P- glykoproteiny. 19

genová terapie rakoviny plic a vaječníku první klinické testy (1999) 19 pacientů v pokročilém stádiu intratumorálně dostávali injekci nemutovaného genu pro p53 v adenovirálním vektoru (3 dávky během měsíce), současně byla prováděna terapie ozařováním výsledek: 2 pacienti zemřeli během pokusu u 10 pacientů nemoc postoupila do pokročilejšího stádia 1 zůstal ve stejném stavu u 4 došlo k mírnému zlepšení u 2 došlo k výraznému zlepšení totéž u 25 pacientek v pokročilém stádiu rakoviny vaječníku (2001), 7 přežilo terapii genová terapie AIDS HIV virus lentivirus ze skupiny retrovirů ssrna 9.8 kbp gag, pol, env proteiny společné pro všechny retroviry tat, rev, vpu, vif, nef, vpr specifické regulační proteiny HIV viru 20

genová terapie AIDS existuje několik postupů genové terapie, které jsou v první fázi klinického testování 1.antisense RNA proti genu CRR5 receptoru, který váže HIV virus a umožňuje mu vstup do buňky T-lymfocytu. Byly vytvořeny CD4+ (typ T- lymfocytu) odolné vůči infekci HIV, kterým byl vnesen antisense konstrukt pomocí lentiviru 5 dobrovolníkům v pokročilém stadiu AIDS byly vstřiknuty tyto buňky genová terapie AIDS 2. terapie pomocí ribozymu RIBOZYM je malá molekula RNA s katalytickou funkcí byl vytvořen ribozym specifický vůči tat genu HIV viru vzhledem k velmi rychlým a častým mutacím mezi jednotlivými variantami HIV viru musí být vybrána velmi konservativní sekvence pro doručení byl použit MoMVL retrovirální systém I fáze klinického testování 2003-4 21