Genová terapie. RNDr. Martin Bunček, Ph.D. Mgr. Lenka Hubálková

Transkript

1 Genová terapie RNDr. Martin Bunček, Ph.D. Mgr. Lenka Hubálková

2 Genová terapie Genová terapie je metoda léčby onemocnění založená na poznatcích o molekulární příčině chorob, která využívá metod molekulární genetiky k léčbě takovýchto onemocnění. ZÁKLADNÍ POŽADAVKY A MOŽNOSTI GENOVÉ TERAPIE: zcela nový přístup [ účinek na genotypové úrovni NEJPRVE: GT jen pro vrozená onemocnění DNES: nádorová onemocnění neurodegenerativní onemocnění arthritis

3 Nutné znát metodiky: PRO IDENTIFIKACI A KLONOVÁNÍ GENŮ CFTR gen (klonován 1989) Projekt HUGO ( ) PRO PŘENOS GENU A JEHO EXPRESI PRO KVANTIFIKACI GENOVÉ EXPRESE A IDENTIFIKACI KLONŮ restrikční analýza real-time PCR sekvenace

4 Typy genové terapie PODLE ZPŮSOBU: in vivo / ex vivo PODLE TYPU OVLIVNĚNÝCH BUNĚK: somatické buňky zárodečné buňky PODLE TECHNOLOGIE: zprostředkovaná vektory (DNA, virové vektory ) zprostředkovaná oligonukleotidy (antisense, antigene TFO, přístup ;RNAi, aptamery) genová (genetická) imunizace

5 Současný stav rozdíl mezi USA a ostatními státy USA při NIH existuje RAC, nezávisle FDA RAC povoluje projekty GT (protokoly) FDA povoluje používané agens (látky) ve světe je v současné době asi probíhajících projektů (2/3 v USA, zbytek v Evropě, Číně a japonsku) 42 nádorová onem. 5 HIV 18 vrozená onem. 2 jiná

6 Rizika 17. září 1999 zemřel první pacient následkem vedlejších účinků GT, Jesse Gelsinger, po aplikaci adenovirového vektoru nesoucího gen pro OTC (ornithin transkarbamoylázu) geneticky podmíněná nemoc: deficience ornitin transkarbamylasy klasická léčba: dieta na proteiny s nízkým obsahem aminokyselin bohatých na dusík + dodatečně podávaný citrulin mortalita 50%, pacienti se dožívají pokročilého věku 19-letý pacient zemřel po genové terapii provedené adenovirovým vektorem

7 Rizika Jesse Gelsinger MOČOVINOVÝ CYKLUS ODBOURÁVÁNÍ AMONIAKU

8 SCID severe combined imunodeficiency TĚŽKÁ IMUNODEFICIENCE jedna z forem se projevuje nedostatkem aktivního enzymu adenin deaminasy (ADA) adenin se nepřeměňuje na inosin ale vzniká deoxyadenosin, který inhibuje metabolismus deoxyribonukleotidu tato nedostatečnost způsobuje zpomalení dělení rychle se poliferujících buněk jako jsou T-lymfocyty výrazně zvýšená náchylnost k infekcím bubble boy disease

9 SCID severe combined imunodeficiency

10 SCID severe combined imunodeficiency od 80let se tato nemoc lečí transplantací kostní dřeně (neúspěšné) 1986 se začaly podávat injekce hovězí ADA stabilizované PEG intramaskulárně (nutno podstupovat každé dva týdny, ADAGEN), často končilo hemofilií pacienta 1990 první pokus genové terapie na člověku 4leté dívce Ashanti DeSilva. Její T-lymfocyty byly upraveny ex-vivo normálním ADA pomocí vektoru odvozeného od MoMLV. (William Anderson, Michael Blaise, and Ken Culver)

11 SCID severe combined imunodeficiency 1990 první pokus genové terapie na člověku 4leté dívce Ashanti DeSilva. Její T-lymfocyty byly upraveny ex-vivo normálním ADA pomocí vektoru odvozeného od MoMLV. (William Anderson, Michael Blaise, and Ken Culver) nutno podstupovat každý rok (životnost transformovaných T- leukocytů 6-12 měsíců) dívka stále žije

12 SCID severe combined imunodeficiency u dalších pacientů, kombinovaná léčba s ADAGENem chlapců s vážnější X-vázanou SCID podstoupilo genovou terapií ex-vivo, u čtyřech se do roka stav výrazně zlepšil, u dvou z nich bohužel propukla leukémie. pokusy pozastaveny a zdokonaluje se metodika transgen se zabudovává do genomu T-leukocytu s oblibou do blízkosti onkogenu

13 Možnosti GT zprostředkované vektory OPRAVA DEFEKTNÍHO GENU IN SITU homologní rekombinace NÁHRADNÍ EXPRESE PROTEINU S PODOBNÝM ÚČINKEM srpkovitá anémie zapnutí genu pro fetální HbF β-thalasémie NÁHRADA POŠKOZENÉHO GENU FUNKČNÍM nejčastější Jak ho dostat do buňky???

14 Srpkovitá anémie hemoglobinopatie gen HbA normální hemoglobin gen HbS poškozený hemoglobin erytrocyty mají srpkovitý tvar heterozygoti téměř bez příznaků (přenašeči) homozygoti těžké projevy (anémie) gen rozšířen v Africe heterozygoti jsou odolní proti malárii Plasmodium falciparum

15 Onemocnění vhodná pro léčbu GT cystická fibrosa gen CFTR (250 kb 26 exonů 1480 AA ) fenylketonurie gen pro fenylalaninhydroxylázu (90 kb 13 exonů) hemofilie A gen pro faktor VIII (186 kb 26 exonů 2351 AA) DMD gen pro dystrofin (cca kb cca. 70 exonů po bp)

16 Onemocnění vhodná pro léčbu GT čím je gen větší tím obtížnější je GT příslušné choroby výběr vhodného vektoru!!! použití cdna homologní rekombinace

17 Nemoci v současnoti léčené GT NEMOC DEFEKT CÍLOVÉ BUŇKY ČETNOST těžká imunodeficience (SCID) hemofilie cysická fibrosa deficience na alfa antytrypsin adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1/ krevní faktor VIII a IX transmembránový regulátor CF játra, svaly 1/ muži plicní alveoly 1/2 500 rozedma plic plicní alveoly 1/3 500 rakovina nespecifické mnoho 1/4 neurologické nemoci (Parkinson, Alzheimer) kardiovaskulární nemoci infekční nemoci (AIDS, hepaiis B) degradace neuronů degradace neuronů 1/250 arterosklerosa cevní endotel 1/2 T- lymfocyty, makrofágové buňky

18 GT nádorových onemocnění STRATEGIE PROTOKOLŮ: aktivace imunitního systému vložení genu pro cytokiny in vitro do nádor. buněk vložení genu pro TNF-α do TIL in vitro využití enzymů konvertujících prodrug na aktivní léčivo: cytosindeamináza (5-FC [ 5-FU) thymidinkináza (gancyclovir [ fosforylovaný GCV) zastavení /snížení exprese genu podílejícího se na karcinogenezi: antisense či ribozym inaktivující: K-ras onkogen u kolorektálního ca. bcr-abl onkogen u CML

19 Vektory VEKTOR BY MĚL OBSAHOVAT: promotor (nejlépe indukovatelný) příslušný gen poly A signál gen pro selekci transformovaných buněk VEKTOR BY NEMĚL OBSAHOVAT: sekvence homologní s lidskými viry sekvence homologní s funkčními geny jiný čtecí rámec (ani trans) produkovat toxický produkt (peptid, protein)

20 Vektory DNA V KOMPLEXU S NOSIČEM nosič: molekula či komplex molekul schopných 1. vázat DNA a 2. usnadnit přechod vytvořeného komplexu přes buněčnou membránu. nosiče: liposomy kationický lipid + kolipid (vážou a chrání DNA) multifunkční: komplex s endosomolytickou látkou, multifunkční polymer jako nosič, biodegradabilní polymery jako nosiče, komplex se zacílovací molekulou (NLS, Ab, atd.)

21 Vektory HOLÁ (NAKED) DNA balistický způsob dopravy DNA adsorbována na kovové mikrokuličky (střely) použitím tzv. gene gun je vstřelena do tkáně výhody většinou nepoškozená DNA i v jádře snadná příprava nevýhody malá penetrace pouze dočasná exprese

22 Vektory HOLÁ (NAKED) DNA magnetický způsob dopravy DNA adsorbována nebo zabudována na/do magn. částice použitím speciálních magnetů zakoncentrována v přísl. místě pozitiva zacílení specifické oblasti (resp. tkáně) relativně snadná příprava negativa použití speciální techniky neřeší problém vstupu DNA do buňky a jádra

23 Vektory VIROVÉ VEKTORY adenoviry pozitiva: byly první negativa: komplikovaný genom ovlivní jen dělící se buňky vysoce imunogenní adeno asociované viry (AAV) pozitiva: v současné době snadná příprava možnost zacílení negativa: možnost výskytu divokého adenoviru ovlivní jen dělící se buňky imunogenní

24 Vektory VIROVÉ VEKTORY retroviry pozitiva: v současné době snadná příprava možnost zacílení negativa: vysoká pravděpodobnost rekombinace v některých případech imunogenní ostatní, např. HPSV pozitiva: vhodné ve specielních případech negativa: vysoká pravděpodobnosr rekombinace vysoce imunogenní

25 Porovnání jednotlivých vektorů Retrovirus Adenovir HSV AAV Liposom gene gun Plasmidová DNA velikost inzertu 8kB 8kB >20kB <4kB >20kB >20kB >20kB titr N/A N/A N/A integrace Ano Ne Ne? Ne Ne Ne exprese Různá Dočasná Dočasná Dočasná Dočasná Dočasná Dočasná použití in vivo Možné Ano Ano Ano Různé nutná ovlivněná tkáň obtížné transfekce klidových buněk Ne Ano Ano Ano Ano Ano Ano

26 Retrovirové vektory

27 Retrovirové vektory

28 Retrovirové vektory

29 Retrovirové vektory: nef genom retroviru: tat ENV pakážovácí virus: ENV retrovirový vektor 1. generace: retrovirový vektor 2. generace: gag pol reporter RRE CMV reporter

30 GT zprostředkovaná oligonukleotidy antisense přístup antigene přístup MODIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ fosforothioáty methylfosfonáty O-Me RNA morfolinové oligonukleotidy peptidové nukleové kyseliny (PNA)

31 CENTRÁLNÍ DOGMA mol. biologie REPLIKACE DNA DNA RNA GENOVÁ EXPRESE PROTEIN

32 SENSE a ANTISENSE sekvence SENSE stejná jako sekvence mrna nepřepisovaná ANTISENSE komplementární k sekvenci mrna přepisovaná

33 ANTISENSE a ANTIGENE přístupy ANTISENSE na mrna nasedne antisense oligonukleotid, který znemožní translaci (expresi daného genu) ANTIGENE využití triplex tvořících oligonukleotidů (TFO, Triplex Forming Oligonucleotides) inhibující oligonukleotid nasedá přímo na DNA za znemožňuje transkripci (expresi daného genu)

34 Milníky OMGT antisense approach Stephenson & Zamecnik (1978) ribozymy Cech (1986), Altman (1989) antigene approach Moser & Dervan (1987) LeDoan et al. (1987) aptamery Ellington & Szostak (1990), Tuerk & Gold (1990) 1st New Drug Application for antisense ODN Isis (April 1998) 1. antisense léčivo povolené FDA Isis (August 1998)

35 Molekulární mechanismy oligoterapie ANTISENSE: inhibice splicingu zastavení translace porušení sekundární struktury RNA inhibice 5 cappingu nebo 3 polyadenylace aktivace RNasy H nebo RNasy L ribozymy RNA interference ANTIGENE (TFO) porušení sekundární struktury DNA zábrana vazby traskripčních faktorů zastavení transkripce modifikace cílového duplexu = arteficiální ribozymy

36 RNA interference (RNAi) post-transcriptional gene silencing (PGTS) indukované dsrna RISC - RNA-induced silencing complex

37 Výhody a nevýhody oligoterapie VÝHODY: žádná nebo velmi malá (sekvenčně závislá) imunogenicita žádné nebo velmi malé vedlejší efekty extrémně malá pravděpodobnost rekombinace dobré farmakologické vlastnosti: snadná příprava (syntéza) snadná charakterizace a purifikace extrémně malá šance vzniku rezistence NEVÝHODY: klinické testy antisense oligonukleotidů zatím s malým úspěchem dosud žádné klinické testy s antigene oligonukleotidy

38 Klinicky testované oligonukleotidy Oligonucleotide: Target: Disease: Status: Sponsor: fomivirsen Vitravene NDA approved (ISIS HCMV IE gene-2 CMV retinitis Isis/Ciba Vision On the market 2922) Pegaptanib (Macugen) ISIS 2302 VEGF receptor / VEGF 165 ICAM-1 neovascular (wet) age-related macular degeneration (AMD) Rheumatoid arthritis, Crohn`s disease, psoriasis, ulcerative colitis FDA approved / on the market Phase III Phase II Gilead Sci. / OSI Pharmaceuticals Isis/Boehringer Ingleheim ISIS 3521/CPG 64128A Protein kinase C-α Cancer Phase II Isis/Novartis ISIS 5132/CPG 69846A c-raf kinase Cancer Phase II Isis/Novartis ISIS HCMV IE gene CMV retinitis Phase I/II Isis GEM-92 gag gene AIDS Phase I Hybridon zintevir HIV integrase AIDS Phase I/II Aronex G3139 bcl-2 Cancer Phase II Genta Heptazyme IRES region HCV Phase I Ribozyme Pharmaceuticals Angiozyme VEGFr angiogenesis (cancer) Phase I Ribozyme Pharmaceuticals

39 Genetická (genová) imunizace konstrukce vektorů kódujících krátké, imunogenní fragmenty peptidů transformace antigen prezentujících buněk imunitní odpověď proti exprimovaným proteinům použití zejména tzv. gene gun v současné době očkování proti HIV, malárii a dalším

40 Souhrn terapie vysoce účinná nutná práce na vhodném vektoru nutná kontrola!!!! nutná znalost lidského genomu [ nejen fyzická ale i FUNKČNÍ kvalitní metodiky pro klonování a expresi genů kvalitní metody pro sledování přítomnosti a exprese genu [ dokonalá znalost molekulární biologie a genetiky a používaných metod potřeba genové diagnostiky [ biochemická diagnostika NESTAČÍ!!! využití výhod prenatální genové diagnostiky!!!