MALDI, DESI, DAPPI, DART

Hmotnostní detekce v separačních metodách III. - Iontové zdroje - Iontové zdroje pro spojení s planárními separacemi: MALDI, DESI, DAPPI, DART - Iontové zdroje pro prvkovou analýzu: ICP - Pohyb iontů v elektrických a magnetických polích - Hmotnostní analyzátory - Magnetický sektorový analyzátor - Analyzátor doby letu Iontové zdroje pro spojení s planárními separacemi MALDI, DESI, DAPPI, DART

Spojení planárních separačních technik s MS Planární separační techniky jednoduché a rychlé chromatografické metody v plošném uspořádání Tenkovrstvá chromatografie (TLC) Separace na deskách (sklo, kov, plast) s tenkou vrstvou sorbentu. Adsorpční nebo rozdělovací chromatografie. - vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) využívá stacionární fáze o malé a jednotné velikosti částic (vysoká separační účinnost), instrumentaci pro automatické dávkování Papírová chromatografie (PC) Separace na speciálních filtračních papírech Rozdělovací chromatografie (stacionární fáze je kapalina zachycená v papíru) - starší, málo používaná metoda Spojení planárních separačních technik s MS Spojení planárních technik s MS: - nejprve se látky separují pomocí TLC (PC výjimečně), po odpaření rozpouštědla následuje analýza oddělených zón na desce či papíru Analýza látek z TLC desky 1/ automatizovaná extrakce & MS analýza extraktu 2/ desorpce analytů &přímá MS analýza 1/ 2/ DOI: 10.1039/C3MD00235G

TLC/MS: Automatizovaná extrakce On-line spojení TLC (PC) s hmotnostním spektrometrem (ionizace ESI nebo APCI). Extrakční rozpouštědlo dodávané čerpadlem vstupuje do eluční hlavice, která je v přímém kontaktu a s analyzovaným povrchem. Extrakt je následně unášen do API zdroje spektrometru. Zařízení je možné využít i pro analýzy jiných povrchů, např. řezů tkání. Firemní materiály ADVION TLC/MS: Desorpční techniky Desorpci analytů z povrchu lze realizovat pomocí MALDI, DESI, DAPPI a dalších ambientních ionizačních technik - skenování povrchu, záznam signálu v ose desky, případně z celé plochy DOI: 10.1039/C3MD00235G

Ionizace laserem za účasti matrice - MALDI Karas, M.; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 78, 53-68. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. Rapid Comm. Mass Spectrom. 1988, 2, 151-153. Vzorek je po smísení s matricí vnesen do zdroje pro MALDI. Pomocí laserového pulsu dojde k desorpci. Primárně se ionizuje matrice, následnými reakcemi (nejčastěji přenos protonu) se ionizuje analyt. Ionizace laserem za účasti matrice - MALDI MALDI je vhodná pro: - peptidy, proteiny, oligonukleotidy, - polymery - lipidy, uhlovodíky - nízkomolekulární netěkavé látky lasery ( ) infračervené ultrafialové Ionty ve spektrech: [M + H] +, [M - H] -, adukty s alkalickými kovy Funkce matrice: absorpce záření laseru, zředění analytu, izolace molekul, ionizace

Ionizace laserem za účasti matrice - MALDI Běžné matrice pro UV MALDI kyselina -kyano-4-hydroxyskořicová peptidy kyselina sinapová peptidy kyselina 2,5-dihydroxybenzoová obecné použití, lipidy, proteiny, peptidy kyselina 3-hydroxypikolinová nukleové kyseliny dithranol syntetické polymery TLC/MALDI-MS MALDI lze s výhodou kombinovat s TLC TLC deska se nechá vyschnout, pokryje se vhodnou matricí (sprejováním) a umístí se pomocí adaptéru na MALDI desku. Změří se MALDI spektra z vybraných bodů, případně se v režimu MALDI imaging sejmou spektra z celé desky (časově náročné)

Ambientní ionizace přímá ionizace z povrchu analyzovaných objektů bez nutnosti extrakce analytů Výhody: - jednoduchost analýzy (odpadá složitá úprava vzorků) - vysoká propustnost vzorků - široká aplikační oblast (analýza výbušnin, léčiv, lipidů, metabolitů, peptidů a proteinů, forenzní analýza, analýza potravin, sledování chemický reakcí apod.) - možnost zobrazování distribuce látek na povrchu objektů - kombinace s planárními separačními technikami (TLC) DESI Desorpční ionizace elektrosprejem Proud pozitivně nebo negativně nabitých kapiček vytvořený elektrosprejem je pod daným úhlem nasměrován na zkoumaný povrch. Ionty jsou tvořeny obdobně jako v ESI, vznikají [M + H] +, [M + Na] +, [M - H] -, [M + Cl] - apod. Účinnost ionizace ovlivňuje geometrické uspořádání (sprejovací úhel), typ a průtok rozpouštědla (typicky MeOH nebo MeOH/H 2 O), vlastnosti povrchu.

DAPPI Desorpční fotoionizace za atmosférického tlaku Vyhřívaný aerosol tvořený rozpouštědlem a nebulizačním plynem je nasměrován na zkoumaný povrch. Dojde k desorpci analytů, které jsou následně v plynné fázi fotoionizovány UV výbojkou. Obdobně lze ionizovat pomocí koronového výboje na jehle (DAPCI). DART Direct Analysis in Real Time Doutnavý výboj ve zdroji vytvoří plazmu, ze které jsou odstraněny nabité částice. Zbylé neutrální částice jsou v excitovaném stavu (metastabilní částice N*) a ionizují buď přímo analyt za tvorby radikál kationtu ( Penningova ionizace ), nebo vodu, která přenese proton na analyt -> tvorba [M+H] +. Tvorba radikál-kationtu: N* + M M + + e - + N Tvorba protonovaných molekul: N* + nh 2 O [(H 2 O) n-1 + H] + + OH + N [(H 2 O) n-1 + H] + + M [M + H] + + nh 2 O

Ambientní ionizace pro detekci v TLC TLC/DESI-MS TLC/DART-MS doi:10.1016/j.chroma.2011.01.077 Př. Charakterizace sfingolipidů v oční čočce metodou TLC/DESI-MS doi:10.1016/j.bbalip.2014.05.006 Iontové zdroje pro prvkovou analýzu ICP

Indukčně vázaná plasma - ICP Vzorek je zmlžen, vzniklý aerosol je po smíchání s argonem přiveden do plasmového hořáku. Horká plazma desolvatuje, atomizuje a ionizuje vzorek. Ionty jsou extrahovány z plazmy pomocí chlazených skimmerů a vedeny iontovou optikou do analyzátoru. Většina prvků poskytuje za podmínek ICP jednou nabité ionty. Indukčně vázaná plasma - ICP Zdroj pro ultrastopová prvkovou analýzu. Umožňuje analyzovat téměř všechny prvky od lithia po uran s vysokou citlivostí. Aplikace: Kontrola kvality potravin, pitné vody, léčiv, biologie a medicína, geologie LC aplikace analýza metaloproteinů, organokovů, iontověvýměnná chromatografie anorganických iontů Vysoké množství solí vede ke kontaminaci (zanášení) zdroje a k matričním efektům ovlivňujícím signál (salinita mořské vody je ~40 g/l, krevní plasmy nebo krve ~25 g/l). Řeší se naředěním.

Indukčně vázaná plasma - ICP Indukčně vázaná plasma - ICP Příklad: Analýza sloučenin obsahujících arzen v pitné vodě Tetsushi Sakai: Agilent 5980-0262E (2003)

Pohyb iontů v elektrických a magnetických polích Vizualizace pohybu Rb + v iontové pasti (https://www.youtube.com/watch?v=qswobwuzub4) Pohyb nabité částice v homog. elektrostatickém poli - homogenní elektrostatické pole mezi rovnoběžnými deskami s rozdílnými elektrickými potenciály elektrostatická síla F e působící na částici s nábojem q F QE 1. směr okamžité rychlosti kladně nabité částice je rovnoběžný s vektorem E intenzity elektrického pole a má shodný směr + E = konst. v 1 v 2 + + v 1 < v 2 - elektrostatická síla F e působící na nabitou částici (ion) mění velikost její rychlosti - potenciální energie elektrostatického pole se mění na kinetickou energii elektronu -nabitá částice (ion) koná pohyb přímočarý a rovnoměrně zrychlený

Pohyb nabité částice v homog. elektrostatickém poli - průchodem elektrostatického pole (urychlením) získá nabitá částice energii E el E QU ezu e: elementární náboj (e = 1,6 10 19 C), z: nábojové číslo, U: urychlovací napětí - potenciální energie E el se změní na kinetickou energii E k (částice se pohybuje), tj. E E ezu mv - po průchodu elektrostatickým polem má získá nabitá částice rychlost v v 2ezU m Pohyb nabité částice v homog. elektrostatickém poli 2. směr okamžité rychlosti kladně nabité částice je kolmý k vektoru E intenzity homogenního elektrického pole E = konst. + v + x v x v y,1 + v y,2 v y,1 < v y,2 - elektrostatická síla působící na nabitou částici mění směr její rychlosti a nabité částici uděluje zrychlení ve směru vektoru - částice koná ve směru osy x rovnoměrný pohyb a ve směru kolmém pohyb rovnoměrné zrychlený -nabitá částice se pohybuje po parabole k desce s opačným nábojem

Pohyb nabité částice v homogenním magnetickém poli - homogenní magnetické pole (např. mezi Helmholtzovými cívkami) magnetická síla F m působící na částici s rychlostí v a nábojem q F BQvsinα B: magnetické indukce homogenního magnetického pole α: úhel, který svírá směr magnetické indukce B se směrem rychlosti v 1. směr okamžité rychlosti nabité částice je shodný (nebo opačný) s vektorem magnetické indukce (α = 0 nebo α = 180 ) - magnetické pole na pohybující se částici s nábojem Q silově nepůsobí Pohyb nabité částice v homogenním magnetickém poli 2. směr okamžité rychlosti nabité částice je kolmý k vektoru magnetické indukce (α = 90 ); velikost magnetické síly je maximální + F F v + - magnetické pole působí na částici tak, že zakřivuje její trajektorii do tvaru kružnice - F m se stává silou dostředivou (F m = F d ) v F + r v BQv mv r r m Q v B

Pohyb nabité částice v homogenním magnetickém poli 3. směr okamžité rychlosti nabité částice je pod určitým úhlem vzhledem vektoru magnetické indukce (α 0, 90, 180 ) - nabitá částice se pohybuje po šroubovici Velikost rychlosti částice (a tedy i kinetická energie) se v magnetickém poli nemění. Směr se měnit může. Pohyb nabité částice v elektromagnetickém poli Pohybuje-li se částice současně v magnetickém i elektrickém poli, působí na ní jak síla elektrostatická F e, tak síla magnetická F m. Výslednicí obou těchto sil je síla F L, která se nazývá Lorentzova síla. F F F F Q E v B značí vektorový součin Pozn. Někdy je jako Lorentzova síla označován pouze příspěvek magnetické síly

Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátor Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua Hmotnostní analyzátor je zařízení, které využívá elektrických a magnetických polí k separaci iontů v plynné fázi podle jejich poměru hmotnost/náboj (m/z).

Hmotnostní analyzátory TOF B Q LIT IT OT ICR Analyzátor doby letu Magnetický sektorový analyzátor Lineární kvadrupól Lineární kvadrupólová iontová past Iontová past Orbitrap Iontová cyklotronová resonance Hmotnostní analyzátory se liší principem měření, a tedy i svými vlastnostmi. Vhodný typ analyzátoru volíme dle aplikace. doi:10.1016/0168-1176(87)80030-7 Parametry hmotnostních analyzátorů Hmotnostní rozsah nejnižší a nejvyšší hodnota m/z, kterou lze s daným analyzátorem měřit Rozlišovací schopnost schopnost poskytnout rozlišené signály pro ionty s malým rozdílem hmotností Přesnost určení hmotnosti přesnost, se kterou lze měřit m/z iontů (udává se pro vnitřní i vnější kalibraci) Dynamický rozsah - počet koncentračních řádů, v nichž je odezva závislá na koncentraci Rychlost rychlost záznamu spekter

Parametry hmotnostních analyzátorů Magnetický sektorový analyzátor (B)

Magnetický sektorový analyzátor Ionty jsou urychleny vysokým napětím (4-8 kv) do magnetického pole vytvořeného elektromagnetem. Využívá se zakřivení dráhy iontů v magnetickém poli (poloměr dráhy iontů je úměrný poměru m/z). Při analýze iontů je detektor na fixní pozici, skenuje se buď magnetické pole nebo urychlovací napětí. Klasický typ analyzátoru používaný od počátků organické MS. Magnetický sektorový analyzátor Ionty upouštějí iontový zdroj po urychlení napětím U s rychlostí v: v 2ezU m V magnetickém poli se ionty začnou pohybovat po kruhové dráze s poloměrem r: r m ez v B Kombinací vztahů získáme výraz pro m/z ( základní rovnice hmotnostní spektrometrie ): m ez r B 2U Magnetický sektorový analyzátor separuje ionty v prostoru na základě zakřivení dráhy iontů. Magnetický sektorový analyzátor lze skenovat buď změnou magnetické indukce B nebo urychlovacího napětí U.

Sektorové analyzátory s dvojitou fokusací Analyzátory s dvojitou fokusací kromě magnetického sektoru obsahují ještě elektrostatický sektor, který kompenzuje energetickou disperzi iontů a tak zvyšuje rozlišení. Elektrostatický sektorový analyzátor vytváří radiální elektrické pole mezi dvěma opačně nabitými deskami. Ionty o stejném m/z s různou kinetickou energií jsou zaostřeny (fokusovány) do jednoho místa. Elektrostatický analyzátor neseparuje monoenergetické ionty! Magnetické sektorové analyzátory Obecně: Klasický typ analyzátoru s vysokou rozlišovací schopností umožňující izolace při vysokém rozlišení, a vysokoenergetické MS/MS. Vysoký dynamický rozsah, avšak relativně pomalý. Typické aplikace stopová GC/MS dioxinů, furanů, bromovaných difenyletherů, polychlorovaných naftalenů (PCNs) apod. Rozlišení: do 100 000 (dvojitá fokusace) Přesnost určení hmotnosti: 5 ppm Hmotnostní rozsah: 20 000 Rychlost skenu: pomalý

Analyzátor doby letu (TOF) Analyzátor doby letu Měření doby letu částic o známé kinetické energii v trubici o fixní délce. Nabité částice (ionty) s různým m/z jsou urychleny elektrickým polem. Získají tak stejnou energii, ale různou rychlost. Čas, který je potřebný k překonání letové dráhy je rozdílný - těžší ionty potřebují delší čas než lehčí ionty. potenciální energie iontu v elektrickém poli E p E ezu 1 2 mv E kinetická energie iontu E k v L t m z 2eUt L t L 2eU m z Příklad: Doba letu iontu o hmotnosti 1000 Da, napětí 20 kv, délka 1 m: t = 16 s

Lineární uspořádání TOF MS odpuzovací elektroda (repeller) 20 kv extrakční mřížka 18 kv mřížka 0 V ionty E = 0 urychlovací mřížka 0 V L detektor Zdroje iontů: - pulzní zdroje (doba pulzu ns), tvorba balíčků (obláčků) iontů - ideální zdroj: vytvoří všechny ionty ve stejném čase, ve stejném místě, se stejnou rychlostí ve směru k detektoru a s nulovými rychlostmi v ostatních směrech - reálné zdroje: disperze času a místa vzniku iontů, různé počáteční rychlosti a směry pohybu Tvorba iontů pro TOF MS: pulzní zdroje Extrakce konstantním elektrickým polem - pulzní ionizace (např. MALDI), konstantní elektrické pole Extrakce napěťovým pulzem - pulzní ionizace (např. MALDI), pulzní elektrické pole (pulsed extraction, delayed extraction, time-lag focusing) - kontinuální zavádění iontů v kolmém směru, pulzní elektrické pole (orthogonal extraction, orthogonal acceleration) pulzní ionizace laserem z ortogonální extrakce iontů

Reálné iontové zdroje pro TOF MS A1 A2 A3 Vliv počáteční prostorové distribuce iontů A1: odpuzovací elektroda; A2: extrakční mřížka; A3: urychlovací mřížka Ionty vzniklé v různé vzdálenosti od odpuzovací elektrody stráví různě dlouhou dobu pod vlivem pole. Ionty tak získají různé rychlosti a kinetické energie (čím jsou dále od akcelerační mřížky, tím mají větší rychlost a energii). F V určitém místě rychlejší ionty doženou pomalejší (primární ohnisko). Primární ohnisko nelze využít k detekci, ionty o různém m/z nejsou ještě dostatečně rozděleny. Reálné iontové zdroje pro TOF MS Vliv počátečních rychlostí a směrů pohybu iontů Ionty s počáteční rychlostí směrem k detektoru dorazí dříve. Ionty s opačným směrem jsou nejdříve zpomaleny, otočeny, a tím se zpozdí. Počáteční rychlost v kolmém směru způsobuje drift iontu z osy letové trubice. - + Korekce směru iontů se provádí pomocí dvojice elektrod ( steering plates ). V reálných iontových zdrojích dochází ke snižování rozlišení.

Zlepšení rozlišení v TOF MS I. Vysoká urychlovací napětí II. Reflektron III. Opožděná extrakce iontů IV. Dlouhá letová dráha I. Vysoká urychlovací napětí E 1 2 mv ezu 1 2 mv v 2ezU m v v: celková rychlost iontu; v 0 : počáteční rychlosti iontu Při vyšších urychlovacích napětích se snižuje relativní příspěvek počáteční rychlosti k celkové rychlosti iontu. II. Reflektron: elektrostatické iontové zrcadlo odpuzovací elektroda (repeller) extrakční mřížka reflektron, - ionty se stejným m/z v (E k ) > v (E k ) urychlovací mřížka detektor - reflektron: soustava elektrod s postupně se zvyšujícím potenciálem - ionty s větší E k pronikají hlouběji do elektrostatického pole, tím se prodlouží dráha a dojde k jejich zpoždění - hloubka průniku do elektrostatického pole nezávisí na m/z, pouze na E k - detektor je v oblasti sekundárního (reflektronového) ohniska Rozlišení se zvyšuje na úkor citlivosti a snížení hmotnostního rozsahu.

III. Opožděná extrakce iontů µs napětí na odpuzovací elektrodě (MALDI desce) t 0 odpuzovací elektroda extrakční mřížka urychlovací mřížka 18 kv 18 kv 0 V t 0 t Po vytvoření iontů pulzním zdrojem (např. MALDI) se urychlovací napětí vloží až po malé časové prodlevě (t ). Ionty se při E = 0 rozdělí podle rychlostí. t 20 kv 18 kv 0 V Po vložení napěťového pulsu (E > 0) získají pomalejší ionty více energie a rychlosti iontů se vyrovnají. t x 18 kv 18 kv 0 V Izobarické ionty se pohybují trubicí s užší distribucí rychlostí, zlepšuje se rozlišení. Brown, Lennon Anal. Chem. 67 (1995) 1998. IV. Letová dráha rozlišení v TOF MS: R m m t 2 t t - doba letu; Δt -časový interval detekce iontů se stejným poměrem m/z Vyšší rozlišení lze dosáhnout prodloužením dráhy letících iontů. Výrazné prodlužování letové trubice nepraktické: řešením je opakované použití stejné dráhy pro prodloužení doby letu iontů - technická řešení: 1/ bezmřížkové elektrostatické reflektrony TOF s vícenásobným odrazem iontového svazku 2/ elektrostatické sektory TOF s vícenásobným otočením iontového svazku analyzátory s otevřenou nebo uzavřenou dráhou (uzavřená dráha: lehčí ionty mohou vykonat více otáček, nejednoznačná spektra).

Typy analyzátorů podle letové dráhy Lineární TOF TOF s vícenásobným odrazem iontového svazku TOF s vícenásobným otočením iontového svazku TOF s jedním odrazem iontového svazku (reflektron) uzavřená dráha uzavřená dráha otevřená dráha otevřená dráha Int. J. Mass Spectrom. 349 350 (2013) 134 TOF s vícenásobným odrazem iontového svazku Folded Flight Path (FFP) Ionty ze zdroje jsou odráženy iontovými zrcadly a směrovány sérií fokusačních prvků umístěných v řadě uprostřed. Podle režimu měření ionty prochází různou trajektorií a s tím souvisí i dosažené rozlišení. Bezmřížková iontová zrcadla vysoká transmise (>50 % v High resolution módu) Délka analyzátoru 75 cm, maximálně 64 odrazů (celková dráha až 40 m) Rozlišení max. 100 000 FWHM, přesnost určení hmotnosti <1 ppm, Rychlost sběru dat do 200 spekter za sekundu LECO Corporation

TOF s vícenásobným otočením iontového svazku MULTUM: Konstrukční řada analyzátorů TOF z Univerzity v Osace původně vyvíjený pro projekt COSAC (ROSETTA space mission). - základem 4 válcovité elektrostatické sektory - R > 350 000 (po 500 cyklech) - nízké ztráty iontů (1-2 % na cyklus) - malé rozměry mobilní přístroje MULTUM-S II Anal. Chem. 2010, 82, 8456 8463; J. Mass Spectrom. 2003; 38: 1125 1142 TOF s vícenásobným otočením iontového svazku SpiralTOF ion optic system Konstrukční řešení: 4 toroidní elektrostatické sektory s otvory, iontový svazek se několikrát otočí celková dráha iontů ~ 17 m - refokusace iontového svazku během každého cyklu nedochází k disperzi vysoké rozlišení Parametry: -vysoké rozlišení 60 000-80 000 -vysoká přesnost určení m/z:1 ppm s vnitřní kalibrací, 10 ppm s vnější kalibrací -dobrá citlivost -malé rozměry ( benchtop přístroje) - součást MALDI-TOF/TOF Jeol

Fragmentace za zdrojem (post source decay, PSD) laser pulzní selektor (deflektor) rozpad metastabilního iontu v oblasti mezi deflektorem a reflektronem: PSD + m m 1 m 2 v v v m m E E - napěťový puls aplikovaný na selektor umožňuje výběr prekurzoru (okno až 1 Da) - prekurzory s vyšší energií se samovolně rozpadají v letové trubici - fragmenty mají stejnou rychlost jako prekurzor, ale jinou energii - reflektron se využije pro separaci iontů podle kinetické energie: těžší ion s vyšší E k pronikne hlouběji do reflektronu a tím se zpozdí - omezená schopnost lineárního reflektronu pokrýt velké rozdíly v E k : spektrum se skládá z více měření při různém potenciálu reflektronu - kvadratický reflektron umožňuje změřit celé PSD spektrum najednou TOF/TOF analýza Dvě odlišná řešení: TOF/TOF s CID kolizní celou TOF/TOF s CID kolizní celou: Po výběru prekurzoru selektorem jsou ionty fragmentovány v kolizní cele (CID). Produkty jsou následně akcelerovány do reflektronu. TOF/TOF s LIFT celou: Nedochází k CID, ale detekují se ionty vzniklé samovolným rozpadem prekurzorů za iontovým zdrojem (postsource decay, PSD). Prekurzory i PSD fragmenty mají stejnou rychlost (vznikly až po urychlení).v LIFT cele jsou ionty urychleny napěťovým pulsem a získají tak různé rychlosti. Dále procházejí reflektronem a jsou detekovány. TOF/TOF s LIFT celou

Hmotnostní analyzátory TOF: shrnutí - velký (teoreticky neomezený) hmotnostní rozsah - záznam celého spektra pro každý pulz (neskenující zařízení) - velká rychlost záznamu dat (možnost spojení s rychlými separacemi) - vysoká citlivost díky velké propustnosti iontů - lze dosáhnout vysokých rozlišení a přesností měření m/z