HPLC/MS tělních tekutin nový rozměr v medicinální diagnostice

Transkript

1 HPLC/MS tělních tekutin nový rozměr v medicinální diagnostice Lukáš Chytil Ústav organické technologie VŠCHT Praha

2 Medicinální diagnostika a hmotnostní spektrometrie Medicinální diagnostika: - Klasické biochemické metody - Metody zobrazovací - HPLC, GC/MS Hmotnostní spektrometrie: - Kvalitativní a kvantitativní metoda - Citlivost detekční limit (fmol/µl) - Hmotnostní rozsah ( Da) HPLC/MS Medicína METDA PR MEDICINÁLNÍ DIAGNSTIKU Hmotnostní spektrometrie počet přístrojů v různých odvětvích: 2004 Biochemie 2010 Biochemie Chemie Chemie Fyzika Medicína Fyzika

3 Hlavní separační techniky pro MS Plynová chromatografie - GC Plyny, těkavé nízkomolekulární látky (< 600 Da) Kapalinová chromatografie - HPLC Vysokomolekulární (netěkavé) látky ( až Da) regulace tlaku nástřik vzorku zásobník mobilní fáze dávkovač vzorku pomocí ventilů regulace průtoku kolona pro plynovou chromatografii vstup do MS manometr kolona pro HPLC tlumič tlakových nárazů čerpadlo termostat filtr vstup do MS

4 Ionizace při analýze HPLC/MS biomolekul Podmínka pro MS analýzu:mlekula V PLYNNÉ FÁZI (!) V INIZVANÉM STAVU MLEKULA S MLEKULVU HMTNSTNí > 600 Da: Termické zplynění (CI nebo EI) nelze Vývoj nových metod: ESI, APCI, MALDI!!! EI W nebo Re katoda vakuum ESI sprejovací kapilára oxidace Taylorův kužel vstup vzorku anoda M. Zdroj vysokého napětí redukce

5 Analyzátory iontů INTVÁ PAST uzavírací elektrody KVADRUPL kvadrupolové tyče - prstencové elektrody -

6 Biologický vzorek DBĚR VZRKU PŘÍPRAVA VZRKU MS ANALÝZA KVALITATIVNÍ KVANTITATIVNÍ INFRMACE MARKERU DIAGNÓZA DEBRANÝ VZREK Cesta HPLC/MS Cesta GC/MS EXTRAKCE MNITRVANÝCH LÁTEK EXTRAKCE MNITRVANÝCH LÁTEK IMUNAFINITNÍ REAKCE DERIVATIZACE VLASTNÍ HPLC/MS ANALÝZA VLASTNÍ GC/MS ANALÝZA

7 ASTHMA BRNCHIALE Bronchiální astma pakované epizodické stavy dušnosti způsobené bronchokonstrikcí na základě zánětu dýchacích cest Civilizační onemocnění rostoucí počet případů snižující se věk první incidence (2-3 roky života) btížná diagnostika opakované vyvolávání umělého astmatického záchvatu pro atmatického pacienta stresující INVAZIVNÍ VYŠETŘENÍ DECHVÉ BTÍŽE DIAGNSTIKA SPRÁVNÁ DIAGNÓZA TERAPIE HPLC/MS

8 Dechový kondenzát Kondenzát aerosolových částic obsažených ve vydechovaném vzduchu Složení Dechového kondenzátu odráží složení bronchoalveolární extracelulární plicní tekutiny, které koresponduje s ději odehrávajícími se v plicích Složení Dechového kondenzátu : - Plynná fáze - těkavé látky (C, N) - Kapalná fáze vodní fáze, H 2 2 a netěkavé látky (eikosanoidy MARKERY zánětlivé reakce) ZAŘÍZENÍ K ZÍSKÁNÍ DECHVÉH KNDENZÁTU :

9 Leukotrieny a 8-izoprostany v lidském organismu Markery oxidativního stresu a asthma bronchiale C H 2 H 2 C arachidonát C P R H 2 fosfolipid mastná kyselina peroxoskupina nebo radikál C H 2 mastná kyselina H 2 C peroxokyselina C P R H 2 1. přestavba 2. redukce peroxidázou C H 2 mastná kyselina H 2 C isoprostan C P R H 2 metabolismus cestou 5 - lipoxygenázy fosfolipáza A2 H CH H S CH 2 CH CH 2 NH 2 C C NH CH 2 CH CH 2 CH 2 CH CH H H 8 - isoprostan Leukotrien C4 NH 2

10 Příprava vzorku pro HPLC Imunoafinitní extrakce izoprostanů a leukotrienů dechový kondenzát roztok k HPLC/MS

11 Výsledky měření LTE4 LTD4 LTC4 8-isoprostan Mez detekce: 0,05 pg/µl Mez kvantifikace: 0,1 pg/µl

12 Hmotnostní spektrometrie v diabetologii Diabetes mellitus závažné onemocnění Aplikace insulinu komplikace v pozdních fázích života (poruchy vidění, atd.) Studium dějů po aplikaci insulinu kombinace MRI a MS

13 Krevní plazma ACN -proteiny odpaření HCl/BuH vzorek plazmy SPE ACN HPLC/MS estrifikované AMK Metoda neutrální ztráty Využívá schopnosti skupin látek odštěpovat při fragmentaci stejný elektroneutrální fragment Scan 14 from c:\varianws\data\my files\mk\aminokyseliny\ile-bu01.xms Scan 142 from c:\varianws\data\my files\mk\aminokyseliny\ile-bu01.xms MS spektrum Spectrum 1A BP 64 (4.325e6=100%) ile-bu01.xms % 75% min. Scan: 14 Channel: Merged Ion: NA RIC: 2.610e8 (BC) 188 MS/MS spektrum Spectrum 1A BP 85 (4.654e6=100%) ile-bu01.xms 100% 75% min. Scan: 142 Channel: Merged Ion: NA RIC: 7.599e7 (BC) 50% 50% % % % 0% m/z m/z

14 Shrnutí Byly vyvinuty metody pro detekci leukotrienů jako markerů pro asthma bronchiale, pro detekci markeru oxidativního stresu v organismu-8 isoprostanu a pro sledování hladiny aminokyselin a neurotransmiterů v krevní plazmě. Metody jsou připraveny pro klinické využití, které bude probíhat v následujících dvou letech na 1.LF UK případně v IKEM. KVALITA BILGICKÝ VZREK HPLC/MS KVANTITA