Studie syntéz nesymetrických aryloxy substituovaných azaftalocyaninů

UIVEZITA KALVA V PAZE FAMACEUTICKÁ FAKULTA V HADCI KÁLVÉ KATEDA FAMACEUTICKÉ CHEMIE A KTLY LÉČIV D I P L M V Á P Á C E Studie syntéz nesymetrických aryloxy substituovaných azaftalocyaninů Hradec Králové, 2010 Šárka Franzová

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. V Liberci, 25.3. 2010

Děkuji Mgr. Veronice ovákové a PharmDr. Petru Zimčíkovi Ph.D. za umožnění vzniku této diplomové práce a za odborné a cenné rady při práci v laboratoři. Další díky patří grantové agentuře Univerzity Karlovy (GA UK 41107/BB2007) za finanční podporu a nesmím zapomenout ani na celý kolektiv naší laboratoře - děkuji za příjemné pracovní prostředí.

bsah 1. Seznam zkratek...6 2. Cíl práce...7 3. Teoretická část...8 3.1 Úvod...8 3.2 Historie PDT...9 3.3 Princip PDT... 11 3.3.1 Fotosenzitizéry... 13 3.3.2 Světelné záření... 15 3.3.3 Molekulový kyslík... 15 3.4 Biologická odpověď na PDT... 16 3.4.1 Přímý efekt... 16 3.4.2 Změny v cévním zásobení... 16 3.4.3 Aktivace imunitní odpovědi... 17 3.5 ežádoucí účinky PDT... 17 3.6 Přehled fotosenzitizérů... 18 3.6.1 ozdělení PS dle základní struktury... 18 3.6.2 ozdělení PS dle generací... 19 4. Metodická část... 27 4.1 Azaftalocyaniny... 27 4.1.1 Periferní řetězec AzaPc... 29 4.2 Aryloxyderiváty azaftalocyaninů... 31 4.2.1 btíže při cyklizaci aryloxyderivátů pyrazin-2,3-dikarbonitrilu... 32 5. Experimentální část... 35 5.1 Příprava prekurzorů... 39 5.1.1 Příprava 5,6-bis[4-(3-hydroxypropyl)fenoxy]pyrazin-2,3-dikarbonitrilu (1)... 39

5.1.2 Příprava 5,6-bis[4-(hydroxymethyl)fenoxy]pyrazin-2,3-dikarbonitrilu (2)... 41 5.1.3 Příprava 3,3'-[4,4'-(5,6-dikyanopyrazin-2,3-diyl)bis(oxy)bis(4,1-fenylen)] dipropanové kyseliny (3)... 43 5.2 Příprava aryloxy substituovaných derivátů azaftalocyaninů... 45 5.2.1 Příprava 2,3,9,10,16,17,23,24-oktakis[4-(hydroxymethyl)fenoxy]-1,4,8,11,15,18, 22,25-oktaazaftalocyaninato zinečnatého komplexu (4)... 45 5.2.2 Příprava 2,3,9,10,16,17,23,24-oktakis[4-(2-karboxyethyl)fenoxy]-1,4,8,11,15,18, 22,25-oktaazaftalocyaninato zinečnatého komplexu (5)... 47 5.2.3 Příprava {[2,3-bis[4-(hydroxymethyl)fenoxy]-9,10,16,17,23,24-hexakis(2,6-diis opropylfenoxy)-1,4,8,11,15,18,22,25-(octazaftalocyaninato)]} zinečnatého komplexu (6)... 49 6. Diskuze... 50 7. Závěr... 58 8. Použitá literatura... 61

1. SEZAM ZKATEK ALA AzaPc DB DBU Hp HpD i.v. Pc PDT PS S THF TLC ZnQ 2 Cl 2 5-aminolevulinová kyselina azaftalocyanin (z angl. azaphthalocyanine) 1,5-diazabicyclo[4,3,0]non-5-en 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en hematoporfyrin deriváty hematoporfyrinu intravenózně ftalocyanin (z angl. phthalocyanine) fotodynamická terapie (z anglického photodynamic therapy) fotosenzitizér (z angl. photosensitizer) reaktivní formy kyslíku (z angl. reactive oxygen species) tetrahydrofuran tenkovrstvá chromatografie (z angl.thin layer chromatography) chlorid bis(chinolináto)zinečnatý 6

2. CÍL PÁCE Příprava aryloxy substituovaných derivátů azaftalocyaninů (AzaPc) je v principu dosti problematická, o čemž svědčí poměrně malé množství publikací na toto téma. Úspěšně se tímto úkolem zabývala pouze pracovní skupina kolem Makhseeda, které se podařilo připravit symetrické deriváty aryloxy substituovaných AzaPc 1, a pracovní skupina kolem Mørkved, popisující syntézu AzaPc vycházející mj. i z nesymetrických prekurzorů 2. Cílem mojí práce bylo zaměřit se na přípravu aryloxysubstituovaných derivátů AzaPc, které by měly na periferii funkční skupinu (hydroxylovou či karboxylovou) (obr. 1) pro lepší zacílení v organismu. áplní práce byla tedy nejprve syntéza prekurzorů (pyrazin-2,3-dikarbonitrilů) substituovaných aryloxysubstituenty nesoucími funkční skupiny hydroxylové a karboxylové. ásledně byly testovány různé postupy tetramerizace těchto prekurzorů za vzniku příslušných AzaPc. Výsledkem mojí práce měly být azaftalocyaniny symetrické (vzniklé z jednoho prekurzoru) i nesymetrické (vzniklé ze dvou různých prekurzorů). Součástí mé diplomové práce byla i rešerše na téma dosavadních pokroků v oblasti syntéz aryloxysubstituovaných AzaPc. Zn = H H H br.1/ Cílová struktura symetrických aryloxy substituovaných AzaPc 7

3. TEETICKÁ ČÁST 3.1 Úvod ádorová onemocnění nebo také rakovina je nemoc postihující různé orgány či části lidského těla a způsobující nekontrolované dělení buněk, čímž zapříčiní patologické zvětšení orgánu a ztrátu jeho funkce. ásledky pak mohou být banálního (bradavice) či fatálního (leukemie) charakteru 3. Statistické údaje ukazují na vážnost tohoto onemocnění, jehož nové případy stále přibývají 4. Fotodynamická terapie (photodynamic therapy, PDT) se řadí mezi možnosti terapie tohoto onemocnění. Doplňuje tedy klasickou léčbu chirurgickou, chemoterapii a ozařování, přičemž se snaží zachovat rovnováhu mezi destrukcí buněk nádorových a udržením životaschopnosti buněk zdravých. Jedná se o perspektivní metodu se selektivním působením a vysokou účinností na nádorové buňky 5. Jak vyplývá už ze samotného názvu PDT, jednou z účinných složek metody je světlo. prospěšnosti světelné energie se přesvědčili již v dávných dobách v Egyptě, Indii nebo také v Číně 6. Jednalo se zde převážně o formu tzv. helioterapie či fototerapie, což poprvé definoval Herodotus ve starověkém Řecku jako terapii, kde hlavní účinnou složkou je právě světlo 7. ozvoj této oblasti pokračoval především ve 20. století, kdy iels Finsen obdržel obelovu cenu (1903) za vyléčení kožních forem tuberkulózy a neštovic pomocí červeného světla 8, 9. Pokud spojíme světelnou energii s podáním chemické fotosenzitizující látky mluvíme o fotochemoterapii. pět jsou její začátky spojeny s Egyptem, kde se za fotosenzitizéry považovaly rostliny s obsahem psoralenů. V kombinaci se slunečním zářením se osvědčily v léčbě např. vitiliga 10. V druhé polovině 20. století pak byla uznána tzv. PUVA terapie, která využívala k léčbě lupénky psoraleny aktivované UV A světlem. Dnes je využívána i v imunoterapii 11, 12. Fotodynamická terapie taktéž při svém působení využívá spolupůsobení světla a fotosenzitizéru (photosensitizer, PS). Za výsledný efekt zničení nádorové buňky však odpovídají reaktivní formy kyslíku, které při procesu vznikají z tkáňového kyslíku, který je třetí nutnou složkou PDT. Ani jedna ze složek není sama o sobě toxická. Až po ozáření fotosenzitizéru, který se tak dostává do excitovaného stavu (stav o vyšší energii), dojde k předání energie nutné pro přeměnu molekulového kyslíku na kyslík singletový, který má cytotoxický účinek 5 (obr. 2). 8

světlo fotosenzitizér tkáňový kyslík eaktivní formy kyslíku zodpovědné za smrt buňky br.2/ Základní složky a princip PDT 3.2 Historie PDT První zmínky o fotodynamické terapii jsou datovány do roku 1900, kdy v Mnichově student medicíny scar aab při své práci pro profesora von Tappeinera objevil letální účinek akridinového barviva (obr. 3) na protozoa z rodu Paramecium 13. Stalo se tak náhodně při bouřce vlivem blesku, jehož světlo se podílelo na smrtícím efektu 14. Profesor von Tappeiner tento objev rozvinul a v roce 1903 úspěšně použil pro léčbu kožního nádoru topicky eozin (obr. 3) a bílé světlo 15. etrvalo dlouho a profesor von Tappeiner poukázal na třetí důležitou složku PDT, a to na kyslík. V roce 1907 pak zavedl pojem fotodynamický efekt 16. V polovině 19. století byla objevena účinnost dnes nejznámějších fotosenzitizérů. Už v roce 1911 poprvé rakouský vědec Hausmann podal myším hematoporfyrin (Hp) (obr. 3) a po expozici světlem pozoroval fotodynamickou aktivitu, která se projevila kožní reakcí 17. Letální efekt zjistil pak u prvoků z rodu Paramecium a červených krvinek 11. dvážnější při svých pokusem byl jeho německý kolega Friedrich Meyer- Betz, který sám sobě podal 200 mg Hp injekčně. Místo vpichu poté nechal vystavené světlu a bolestivá reakce a otok se dostavily poměrně brzy 18. Hematoporfyriny se staly předmětem dalšího studia 8. V roce 1955 přinesli výsledky Schwartz a Lipson, kteří pokračovali v práci Friedricha Meyer-Betze vyvinout čistější a mnohem aktivnější formu Hp. Připravili jeho derivát (hematoporphyrin derivate, HpD), který vynikal vyšší účinností 14, 19, 20. Látka našla své uplatnění, i když při samotné syntéze vzniká směs mono-, di- a oligomerů, která se nedá oddělit, a stala se jednou z předloh pro další dnes využívané PS, např. Photofrin 5, 11. Deriváty 9

hematoporfyrinu mají schopnost kumulovat se v nádorových tkáních, a proto byly z počátku hojně používány u fotodetekce tumorů. Až v roce 1972 byly provedeny testy in vivo a in vitro Diamondem u krys, který se takto snažil poukázat na možnost využití PDT při usmrcování nádorových buněk a tudíž při léčbě rakoviny 21. Po dlouhém sledování účinků při léčbě nádorů u myší následovala aplikace PDT do humánní medicíny. Jako první je v této souvislosti známý Kelly, který pomocí PDT vyléčil pacienta trpícího rakovinou močového měchýře, jehož stav se nelepšil při použití dosud užívaných léčebných metod u nádorových onemocnění 5, 22. Další rozvoj a zdokonalení PDT je připisováno Thomasovi Doughertymu. Je autorem první rozsáhlejší studie, kde popisuje po aplikaci PDT ze 113 nádorových ložisek 98 plně zhojených, 13 s částečnou odpovědí a pouhé 2 bez reakce 23. Jeho studium vedlo ke zlepšení způsobu přípravy HpD, s čímž souvisela možnost průmyslové výroby PS. V neposlední řadě se také postaral v roce 1977 o mezinárodní symposium, které bylo zaměřené pouze na PDT 24. Vše nakonec vyvrcholilo v Kanadě v roce 1993 zavedením HpD do klinické praxe pod obchodním názvem Photofrin. Další bádání ukazuje na to, že vlastnosti Photofrinu nejsou zcela kompatibilní s vlastnostmi ideálního fotosenzitizéru, proto se v hledání vhodných látek stále pokračuje a mohou tak vznikat tzv. fotosenzitizéry druhé generace. Z klinické praxe můžeme znát např. kyselinu aminolevulinovou, verteporfin či temoporfin. Výzkumy dále prokázaly možnost využití PDT nejen u léčby rakoviny, ale i v oftalmologii při léčbě senilní makulární degenerace 11. Ačkoli historii má PDT poměrně bohatou, myslím, že stále její možnosti nejsou vyčerpány a do budoucna poodkryje ještě spoustu dalších zajímavostí. H H Br Br H H Br CH Br H HC CH akridin eosin hematoporfyrin br.3/ Akridin, eosin, hematoporfyrin 10

3.3 Princip PDT Pro účinnost fotodynamické terapie jsou potřeba tři složky fotosenzitizér, látka, která se podává pacientovi a je schopna absorbovat světlo určitých vlnových délek a přetvářet jej na užitečnou energii, dále pak záření daných vlnových délek, které PS absorbuje a molekulový kyslík produkující reaktivní formy kyslíku ( reactive oxygen species, S) 25. (obr.4) Aplikace Kumulace záření Fotosenzitizér br.4/ Průběh fotodynamické terapie 26 Přeměnu energie, ke které v celém procesu PDT dochází, dobře vystihuje modifikovaný Jablonského diagram. (obr. 5) br.5/ Modifikovaný Jablonského diagram 11

PS při ozáření absorbuje světelné kvantum, což ho posune ze základního singletového stavu S o do excitovaného singletového stavu S 1. V tomto stavu zůstává velice krátkou dobu (nanosekundy) 27. Uvolnění z této energické hladiny probíhá formou fluorescence, vnitřní konverzí nebo mezisystémovým přechodem (tzv. intersystem crossing). V procesu vnitřní konverze se jedná prakticky o uvolnění energie ve formě tepla, čehož se může také využívat při samotném účinku na buňky (tzv. photothermal therapy) 28. Při mezisystémovém přechodu dochází ke změně spinového stavu PS na tripletový (T 1 ). Z tohoto stavu se PS do základního stavu může dostat opět několika způsoby. Buď pomocí vyzáření fotonu ve formě fosforescence nebo tzv. fotoprocesy typu I a II. ba probíhají současně, poměr mezi nimi udává použitý PS, substrát a koncentrace kyslíku. Za vlastní fotodynamický účinek odpovídá zejména fotoproces typu II, kdy vzniká singletový kyslík 29. Fotoproces typu I Při fotoprocesu typu I se odštěpuje vodík nebo dochází k přesunu elektronu mezi excitovaným fotosenzitizérem v tripletovém stavu (PS*) a substrátem, rozpouštědlem nebo jiným PS. Vznikají tak vysoce reaktivní radikály a radikálové ionty, které s molekulárním kyslíkem poskytují S (např. superoxid kation radikál) nebo ireverzibilně poškozují biologický substrát 30 (br. 6). PS* + PS PS + + PS - PS* + sub sub + + PS - sub - substrát PS - - + 2 PS + 2 PS - fotosenzitizér - sub + 2 oxidace sub br.6/ eakce probíhající při fotoprocesu typu I 8 Fotoproces typu II Při fotoprocesu typu II se přenáší energie z tripletového stavu PS na základní stav molekulárního kyslíku ( 3 2 ), u kterého tím dochází k inverzi spinu, což vede ke vzniku singletového kyslíku ( 1 2 ). Tato forma kyslíku napadá různé biomolekuly a způsobuje jejich oxidaci 31. (br. 7) PS* + 3 2 PS + 1 2 X - biomolekula 1 2 + X oxidace PS - fotosenzitizér 12

br.7/ eakce probíhající při fotoprocesu typu II 8 ejdříve se předpokládalo, že ke zničení nádoru dojde pouze působením S na jednotlivé buňky nádoru, avšak dnes už je jisté, že se jedná o spolupůsobení třech hlavních mechanizmů 32, tj. : 1. přímé působení na maligní buňky pomocí singletového kyslíku a S 2. změny v cévním zásobování nádorové tkáně 3. aktivace imunitního systému Předpokládá se, že hydrofobní PS upřednostňuje přímé působení na nádorové buňky a hydrofilní se soustředí spíše na poškození cév, ovšem toto rozdělení není striktní. Vždy působí všechny tři mechanizmy současně. a konečný efekt má vliv nejen použitý PS, ale i typ nádoru a způsob ozáření 5. 3.3.1 Fotosenzitizéry Jak již bylo řečeno, jedná se o látky schopné absorbovat světlo charakteristické vlnové délky a tuto energii využít k produkci cytotoxických agens. Jedná se převážně o přírodní a syntetická barviva 33, která se vyznačují schopností kumulovat se v nádorové tkáni a umožňují po ozáření indukovat potřebné biologické procesy, které vedou k jejímu zničení 30. bjevena byla už celá řada látek, dnes nejpoužívanější jsou ty, které obsahují porfyrinový cyklus 33. Jejich vlastnosti využitelné v PDT stále nejsou ideální a proto se hledají nové PS, které by se co nejvíce blížily svým chováním ideálnímu fotosenzitizéru. Vlastnosti ideálního PS Ideální PS se vyznačuje svou čistotou a známou strukturou. Tomuto požadavku nevyhovují především již používané HpD, jež se skládají ze směsi mono-, di- a oligomerů derivatizovaného Hp. Z novějších PS tento požadavek nesplňují sulfonované ftalocyaniny (např. Photosens) používané v klinické praxi v usku. Jedná se totiž o směs několika ftalocyaninových makrocyklů lišících se rozsahem a polohou sulfonace 14. Požadavkem je také minimální toxicita ve tmě, tj. bez ozáření světlem specifických vlnových délek. PS mající biologické účinky i bez aktivace potřebným zářením je vždy nežádoucí 33. Mezi další vlastnosti zcela jistě patří tzv. targeting, neboli zacílení do nádorových tkání. PS by se měl hromadit právě v postižené tkáni. Pokud k tomu nedochází, využívá se např. specifických ozařovacích schémat jako je tomu 13

např. u talaporfinu. Důležité je také vyloučení PS z těla, které by mělo být co možná nejrychlejší. ěkteré PS mají sklon hromadit se v kůži, to způsobí fotosenzitivitu, která může trvat až několik týdnů. Pacient se pak musí chránit před přímým slunečním zářením. Za ideální se také považují kvalitní fotochemické vlastnosti, čímž se rozumí především vysoká produkce singletového kyslíku. K výhodám také patří vysoká fluorescence, kterou lze využít k detekci tumoru 14. Dobré spektrální vlastnosti jsou také jednou z podmínek ideálního PS. Řadí se sem především silná absorpce s vysokými extinkčními koeficienty při vyšších vlnových délkách (650 až 800 nm). V této oblasti je zaručena maximální penetrace světla živými tkáněmi a energie potřebná pro produkci singletového kyslíku je taktéž dostatečná 33. Samozřejmostí by pak měla být určitě dostupnost, modifikatelnost a cena. ěkteré z těchto vlastností odpovídají i vlastnostem ideálního léčiva, za které PS určitě považujeme. Vše shrnuje tabulka 1. Vzhledem k tomu, že PS se řadí mezi barviva, vyskytuje se u nich také jev zvaný photobleaching či vyblednutí. V podstatě se jedná o postupnou ztrátu schopnosti PS absorbovat světlo. Příčinou bývají různé chemické reakce, nejčastěji oxidace PS. Pro PDT to potom znamená, že PS propouští světlo do hlubších vrstev (nedochází k tzv. samostínění). a druhou stranu ale vzhledem k neaktivnosti rozloženého PS je vyloučena i možnost dalšího cytotoxického poškození. Uplatnění photobleachingu je také při vylučování PS z těla 34. Tab 1/ Vlastnosti ideálního PS 8 Vlastnosti specifické pro PS Vlastnosti ideálního léčiva kumulace v neoplastické tkáni minimální toxicita nejvyšší absorpce při 680-800 nm krátký biologický poločas vysoký kvantový výtěžek tripletového stavu vysoký kvantový výtěžek singletového kyslíku fluorescence možnost modifikovat kinetiku snadná syntéza dostupnost, cena 14

minimální toxicita ve tmě chemická čistota 3.3.2 Světelné záření Světlo správné vlnové délky je pro PDT dosti limitující. Záření nižší vlnových délek neproniká živými tkáněmi do hlubších vrstev, a tak zasažené oblasti jsou velmi malé. Světlo je pohlceno endogenními chromofory (hemoglobin, myoglobin). aopak světlo vyšších vlnových délek nedosahuje takové energie, která by stačila pro účinnou aktivaci PS. ptimální rozpětí vlnových délek, nazývané jako optické okno se pohybuje v oblasti 680-800 nm 5. Přičemž trend je co nejvíce se přiblížit 800 nm, protože s vyšší vlnovou délkou se zvyšuje průnik tkáněmi. Tomu odpovídají např. naftalocyaniny (776 nm) 35 a bakteriochloriny (780 nm) 36. 3.3.3 Molekulový kyslík Moan a Sommer již v minulém století dokázali, že PDT je bez přítomnosti kyslíku neúčinná. Hlavním cytotoxickým účinkem na neoplastické tkáně se vyznačují zejména singletový kyslík 1 2 a S, které vyvolávají nekrózu a apoptózu. Během PDT dochází k poškození cévního zásobení krví a ke větší spotřebě kyslíku, což vede k lokální hypoxii. Pacientům se proto při léčbě PDT v některých případech podává čistý kyslík 37. Podrobnější studie singletového kyslíku, kterými se Moan zabýval, ukazují jak krátké existence je 1 2 schopný (řádově setiny mikrosekund). S tím souvisí i krátká vzdálenost, kterou za svého života urazí (0,01 0,02 μm). V praxi to znamená, že pokud vznikne 1 2 v extracelulárním prostoru, nestihne proniknout do buňky. Proto se připravují PS, které jsou schopny proniknout do intracelulárních prostor, 1 2 pak vzniká přímo uvnitř buňky a výsledkem je poškození organel či DA buňky 38, 39 vedoucí k nekróze či apoptóze zasažené buňky. Účinek singletového kyslíku je tak omezen jen na místo, kde vznikl a nedochází k destrukci okolní zdravé tkáně. 15

3.4 Biologická odpověď na PDT PDT vyvolává v organismu odezvu sestávající se ze tří základních složek, tj. přímé zničení buňky, změny v cévním zásobování a vyvolání imunitní odpovědi. a výsledném efektu se podílejí tyto mechanismy vždy současně, avšak jejich zastoupení je dáno bližšími podmínkami, za kterých PDT probíhá 5. 3.4.1 Přímý efekt Za přímé zničení buňky jsou zodpovědné PS, které jsou schopny se do ní inkorporovat. Vlastnosti PS jsou určující pro jeho finální lokalizaci v buňce. Lipofilní PS najdeme s největší pravděpodobností začleněné do membrány. Jejich efekt spočívá ve fotoperoxidaci, samotném poškození membrány a inaktivaci zde přítomných enzymů. Hydrofilní PS se kumulují naopak v lysozómech, kde způsobují uvolnění hydrolytických enzymů a tím aktivaci kaskády vedoucí k zániku buňky 40. Hodně diskutabilní byla i otázka vazby PS na DA buňky. d předpokladu, že se jedná o jedno z hlavních center působení PDT, bylo však nakonec ustoupeno. Studie ukázaly, že schopnost PS poškodit DA je velmi malá 41. Změny DA jsou považovány za důležitý proces až při aktivaci apoptotické odpovědi 42. Důležitý pro přímý efekt na buňky je dostatečný přísun kyslíku do ničených tkání. Jeho rychlá spotřeba při fotochemických reakcích vede k jeho lokálnímu nedostatku. Řešení této situace je snížit dávku světla, čímž se zpomalí spotřebovávání kyslíku, nebo dávkovat světlo po částech, kdy umožníme tkáni se v mezidobí znovu okysličit 43. 3.4.2 Změny v cévním zásobení Každá buňka, i ta nádorová, potřebuje ke svému životu živiny a kyslík z cévního řečiště. Je tedy logické, že léčba rakoviny by měla vést k přerušení vazby mezi buňkou a cévami. I na tom se PDT podílí. Efekt je zapříčiněn především změnou v poměrech vazoaktivních a vazokonstrikčních faktorů projevujících se okamžitou konstrikcí cév 42. Za několik hodin je efekt podpořen navíc tvorbou trombů 44. Změny v cévním zásobení se považují za výrazný přínos k dlouhodobé kontrole nádoru. Jako jeden z hlavních mechanismů způsobujících smrt buňky se ukazují především u PS, které jsou ozářeny světlem v krátkém intervalu od jeho podání. Díky nedostatku času se PS nestihne inkorporovat do buňky a většina se ho nachází v cévním 16

řečišti. Delší intervaly mezi podáním PS a ozářením pak vedou spíše k přímému poškození buněk 5. 3.4.3 Aktivace imunitní odpovědi V místech aplikace PDT byla prokázána aktivace imunitního systému a zároveň indukce zánětlivého procesu 43. a začátku této kaskády je uvolnění buněčných zbytků ze zničených buněk. apadená tkáň dále produkuje cytokiny a další prozánětlivé faktory. To vede k aktivaci neutrofilů, které je možno vidět již po několika minutách od ozáření, jak se včleňují do poškozených míst. Smrt neutrofilů vede k uvolnění jejich obsahu, což je další chemotaktický signál. eutrofily v poškozené tkáni vystřídají žírné buňky, které taktéž produkují cytokiny a granule s vazoaktivními složkami. Své místo zde mají i monocyty a makrofágy, které se podílejí na likvidaci zbytků buněk a ničení kapes nádorových buněk, které přežily 45. Z uvedeného vyplývá, že se jedná o nespecifickou imunitní reakci. Při studiích ovlivnění imunitního systému PDT byla zjištěna (i když jen v menšině) nejen jeho aktivace, ale i jeho suprese. Tohoto působení se dá využít při léčení autoimunitních chorob (arthritis 46 ), může však omezit efekt specifické imunitní odpovědi na PDT 5. 3.5 ežádoucí účinky PDT ejčastěji se vyskytujícím nežádoucím účinkem, vyplývajícím z vlastností PS, je kožní fotosenzitivita. Pobyt na přímém slunci může způsobit vlivem zbytkového množství PS v kůži až popáleniny I. a II. stupně. Úplné vyloučení PS z těla trvá různou dobu, což je dáno především jeho strukturou. Můžou to být hodiny, ale i týdny. Proto se pacientům doporučuje v tomto rozmezí dostatečně chránit před slunečním zářením 47. Další nežádoucí účinky jsou spojovány především s injekční aplikací PS i.v. Vlastní podání látky je bezbolestné, ale několik hodin po aplikaci již pacienti potřebují poměrně silná analgetika k potlačení bolesti (např. fentanylové náplasti). Při PDT nejsou vyloučeny ani otoky nebo svědění v místě podání, či alergické reakce, které se v malé míře mohou objevit u všech dostupných léčiv 8. 17

3.6 Přehled fotosenzitizérů ozdělení PS není jednotné. ěkteří autoři ve svých publikacích dávají přednost členění dle struktury PS, jiní zase uvádějí rozdělení dle tzv. generací, které zahrnují i časovou posloupnost a zdokonalení vlastností PS. Ve své práci jsem shrnula to nejdůležitější z každého dělení. 3.6.1 ozdělení PS dle základní struktury Mezi nejpoužívanější PS v PDT patří látky odvozené strukturně od porfyrinu (br.8). Sestává se ze čtyř pyrrolových jader spojených methylenovými můstky do kruhu. edukcí jedné z dvojných vazeb, tak aby nebyla narušena aromaticita základního anulenového kruhu, dojdeme ke struktuře chlorinu. (br.8). Isosterické nahrazení uhlíku v methylenovém můstku u porfyrinu za dusík a přikondenzování benzenového kruhu k pyrrolovým jádrům vede k dobře známé struktuře syntetických barviv ftalocyaninů (br.8). Mezi další používané struktury patří tricyklická barviva 14. Každá z těchto základních struktur umožňuje tvorbu jejich derivátů různými obměnami. Tak vznikají jednotlivé PS, které se dají zařadit ke svým mateřským strukturám. Jejich přehled je uveden v tabulce 2. H H H H H H porfyrin chlorin br.8/ Základní struktury PS f talocyaniny Struktura porfyrinu Porfimer sodný Hematoporfyrin monomethyléter 5-aminolevulinová kyselina (ALA) Tab 2/ Příklady PS dle struktury Struktura chlorinu Verteporfin Struktura ftalocyaninu zinečnatý komplex ftalocyaninu Struktura tricyklických barviv Methylenová modř Lemuteporfin Photosens Toluidinová modř Temoporfin aftalocyanin hodaminy 18

3.6.2 ozdělení PS dle generací V současnosti existují tři skupiny, tzv. generace, do kterých se v praxi používané PS dají zařadit. Ta první je nejstarší a řadí se sem pouze HpD. Výzkumem látek, které by měly lepší vlastnosti než HpD, vznikla druhá generace zahrnující celou škálu sloučenin různých struktur. Spojením PS druhé generace s některými biomolekulami vedlo ke vzniku generace třetí, která se vyznačuje především cílenější distribucí v těle 33. První generace HpD (porfimer sodný, Photofrin, Photohem, Photosan ) Jedná se o směs produktů (obr.9) pocházejících z hematoporfyrinu, který byl izolován z hemu. Do praxe byl zaveden v roce 1993 v Kanadě 8. Dnes patří stále mezi nejrozšířenější PS. Jeho použití je zejména u prekancerózních stavů jako je např. Barretův jícen nebo cervikální dysplazie, ale i u vlastních kanceróz např. karcinom jícnu, močového měchýře, žaludku či děložního čípku 43. Jeho použití ještě není konečné. Stále probíhají studie, které testují jeho další použití např. u rakoviny hlavy, krku, střev, kůže či prsu. V úvahu připadá i možná léčba nekancerózních onemocnění např. prevence arteriální restenózy nebo léčba psoriázy 48. Mezi vlastnosti, které řadí HpD do první generace PS, patří zejména nízká vlnová délka vhodná pro jeho aktivaci (630 nm) a nízký extinkční koeficient při tomto maximu. V praxi to znamená použití vyššího množství jak PS, tak světla, což je vzhledem k jeho nízké selektivitě vychytávání v nádorové tkáni dosti nežádoucí efekt. Hromadění PS v kůži, kde přetrvává až 6 týdnů, vede k výrazné fotosenzitivitě 49. edokonalost této látky vedla k syntéze nových PS, které by byly od nežádoucích vlastností oproštěny. H HC HC H H HC H H H H H CH H br.9/ příklad části HpD 8 CH 19

Druhá generace PS této generace jsou oproti HpD zdokonaleny. Jedná se o chemicky jednotné a přesně definované látky různých typů struktur. Pro jejich aktivace je potřeba světlo vyšší vlnových délek, což umožňuje jeho hlubší průnik do tkání 33. Patří sem látky odvozené od porfyrinů, chlorinů, ftalocyaninů i tricyklických barviv. Zaměřila jsem se především na skupinu látek týkající se mé diplomové práce a přehled ostatních shrnula v tabulce 3. Ftalocyaniny (Pc) Pc (obr.10) jsou syntetická barviva používaná hojně v průmyslu 50. Jejich struktura je spřízněna s porfyriny, avšak uhlíky v methynových můstcích zde nahradily atomy dusíku. avíc jsou také na pyrrolová jádra přikondenzována jádra benzenová. To má za následek zesílenou absorpci chromoforu v oblasti bližší infračervenému záření 51. Pro využití v PDT je důležitá přítomnost chelatovaných centrálních kationtů kovů (M = Zn, Al, Si), které zapříčiní delší setrvání PS v tripletovém stavu, čímž se úměrně zvyšuje i účinnost PDT 14. H H M porfyrin f talocyanin br.10/ Srovnání struktur Pc a porfyrinu evýhodou těchto látek je jejich velká schopnost agregace, způsobená planárním makrocyklickým systémem 52. Tím jsou samozřejmě ovlivněny spektrální, fotofyzikální, elektrochemické i vodivé vlastnosti Pc. Projeví se to i snížením rozpustnosti ve vodě a v organických rozpouštědlech 14, což vede k problémům např. při čištění těchto látek, ale i problémům při jejich aplikaci 33. Agregace Pc může být potlačena několika strukturními modifikacemi. Patří mezi ně chelatace centrálního atomu s více koordinačními vazbami (např. Si, Al, Ga) s následujícím substituováním centrálního atomu 53, zavedení alifatického objemného 20

substituentu na periferii ftalocyaninového makrocyklu 54, zavedení osmi anionických či osmi kationických substituentů na periferii, které zapříčiní kompletní monomerizaci především ve vodném prostředí. Použití méně než 4 těchto nabitých skupin na periferii vede pouze k částečné monomerizaci 14. Skupina ftalocyaninů je nadějnou skupinou PS, uvádím několik příkladů užívaných v klinické praxi nebo testovaných. Zinečnatý komplex nesubstituovaného ftalocyaninu (ZnPc, CGP55847) Zn Jedná se o nejjednodušší Pc 14. Je poměrně špatně rozpustný, protože neobsahuje žádné objemné substituenty na periferii, které by potlačovaly agregaci. Ve formě lipozómů, které zlepšily jeho dostupnost v organismu, se účastnil CGP55847 klinických zkoušek I/II fáze pro léčbu karcinomu skvamózních buněk kůže (Švýcarsko, Kanada) 48. Photosens (Aluminium tetrasulfophtalocyanine, Al-PcTs, AlPcS4) S - 3 a + S 3 - a + S - 3 a + Cl Al S - 3 a + Photosens Tento typ Pc obsahuje na své periferii 2-4 sulfonové skupiny, které způsobují nižší agregaci a vyšší rozpustnost látky ve vodném prostředí. d roku 2001 se pod obchodním názvem Photosens používá jako PS pro PDT v usku. Význam má především pro léčbu rakoviny kůže 55, prsu 48, dutiny ústní 56, plic 57 a gastointestinálního traktu 48. Látka se vyznačuje poměrně dlouhou fotosenzitivitou, pacientům se doporučuje vyhýbat se kontaktu s přímým slunečním zářením po dobu 4 až 6 týdnů 14. V roce 2007 byl připraven další sulfonovaný derivát (tetrasulfonovaný), centrálním atomem kovu je v tomto případě zinečnatý kation. Látka je v I fázi klinického zkoušení použití jako PS v PDT u psů 58. 21

Křemičitý komplex ftalocyaninu (Pc4, SiPc IV) H Si Pc4 CH 3 Si H 3 C CH 3 CH 3 U Pc4 byla zjištěna schopnost zabíjet HIV virus 14, proto byl podroben zkouškám vedoucím ke sterilizaci krevních produktů (V.I.Technologies, Melville, Y, USA) 48. V současné době probíhají fáze I klinického zkoušení léčby kutánních a subkutánních lézí způsobených solidními nádory 43. Při dalších výzkumech bylo zjištěno také potlačení buněčné imunity u myší, což by mohlo vést v budoucnu k dalšímu využití látky, tentokrát jako imunosupresiva 59. aftalocyaniny (cs) M naftalocyaniny Tyto Pc vznikly přidáním dalšího benzenového jádra na periferii. Toto rozšíření konjugovaného systému vazeb vede k absorpci při velice dlouhých vlnových délkách (až 800 nm), což zvyšuje terapeutickou hloubku účinku. Proto lze tyto látky použít mj. i pro vysoce pigmentované nádory, jako jsou melanomy. Další použití cs brzdí jejich nevýhodné vlastnosti pro PS v PDT. Jde hlavně o nízkou chemickou i fotochemickou stabilitu, vyšší tendenci agregovat než u předchozích Pc a s tím souvisí i horší rozpustnost. avíc cs se vyznačují poměrně velikou molekulou, což snižuje schopnost této látky pronikat biologickými membránami 51. 22

8, 14, 33 Tab 3/ Přehled dalších významných PS 2. generace (obr.11a,b) ázev Visudyne TM Foscan Levulan Metvix Hexvix Benzvix Purlityn Laserphyrin Antrin, Lutex Methylenová modř Theraftal TH9402 Toluidinová modř Photoclor Látka Zákl.struktura Verteporfin porfyrin Temoporfin chlorin ALA porfyrin methylester-ala porfyrin hexylester-ala porfyrin benzylester-ala porfyrin ostaporfin chlorin Talaporfin chlorin Motexafin lutecitý texafyrin Methylenová modř tricyklické barvivo (der.fenothiazinu) bromovaný analog rhodaminů tricyklické barvivo Toluidinová modř tricyklické barvivo (der.fenothiazinu) Hexyleter feoforbidu chlorin nemocnění AMD, pat. myopie, karcinom kůže karcinom kůže na hlavě a krku karcinom kůže, fotodetekce moč. měchýře prekancerózy kůže, fotodetekce moč. měchýře fotodetekce moč. měchýře Aktivační vlnová délka [nm] 690 652 632 632 632 fotodetekce jícnu 632 karcinom prsu, prostaty, kůže, AIDS solidní tumory, AMD karcinom prostaty, hlavy, děl. čípku dekontaminace čerstvě zmrazené plazmy autotransplantační léčba myeloidní leukémie cystická fibróza, mykotické infekce u myší karcinom jícnu, kůže, plic,děl. krčku 664 664 732 668 511 625 665 23

H H 3 CC H 3 CC H H H H H H CH CCH 3 verteporf in H temoporf in H Sn H CH HC rostaporf in HC H talaporf in CH H 2 H H 2 CH 3 ALA methylester ALA H 2 H 2 (CH 2 ) 5 CH 3 CH 2 hexylester ALA benzylester ALA br.11a/ Významné PS 2. Generace 24

H H Lu H 3 C S + CH 3 Cl - CH 3 CH 3 methylénová modř C motexaf in lutecitý H 2 H Cl + - 2 Br Br bromovaný rhodamin H H CH 3 HC hexylether feoforbidu H 3 C H 2 Cl - CH 3 S + toluidinová modř br.11b/ Významné PS 2. Generace 25

Třetí generace Tato skupina zastřešuje látky, které mají schopnost cílenější distribuce v těle. Ta je dána vazbou PS na biomolekuly. Fotosenzitivní část tvoří převážně zástupci z řad porfyrinových PS, jako biomolekuly nejčastěji slouží steroidy, sacharidy, polynukleotidy a peptidy. Předpokládá se, že použití např. steroidu jako biomolekuly povede k selektivnímu navázání na steroidní receptory. Většina látek je teprve ve vývoji, až další testy prozradí, které z nich budeme v budoucnu využívat v PDT 8. 26

4. METDICKÁ ČÁST 4.1 Azaftalocyaniny Azaftalocyaniny (AzaPc) byly odvozeny obměnou základního makrocyklu Pc. Záměna proběhla na úrovni benzenového jádra, které je přikondenzováno ke každému pyrrolovému kruhu. Jedná se o substituci methynové skupiny (-CH=) za atomy dusíku. Dle rozsahu substituce rozeznáváme 3 základní struktury AzaPc (br.12). ftalocyanin tetrapyrazinoporfyrazin α-tetrapyridoporfyrazin β-tetrapyridoporfyrazin br.12/ Strukturní typy azaftalocyaninů 11 Zabudování atomu dusíku do molekuly změnilo fyzikálně-chemické vlastnosti. proti Pc mají AzaPc nižší lipofilitu. Produkce singletového kyslíku je srovnatelná s Pc. Jedná se o barevné krystalické látky rozkládající se při 550 C. Zklamáním ovšem byla vyšší schopnost agregace těchto látek, která je pro práci s nimi nežádoucí 8, 54. Díky podobné struktuře AzaPc a Pc je podobná také příprava těchto látek. Základem pro syntézu AzaPc jsou deriváty pyrazin-2,3-dikarbonitrilu (pyridin-2,3 dikarbonitrilu, pyridin-3,4-dikarbonitrilu), které jsou v polohách 5 a 6 různě substituovány. Tyto prekurzory při vhodných podmínkách podléhají cyklotetramerizaci, která vede ke vzniku známého makrocyklu AzaPc (br.13). 27

Deriváty AzaPc lze připravit buď jako bezkovové nebo lze do jejich centra chelatovat kationty různých kovů. Výrazně lze dále měnit vlastnosti AzaPc přípravou derivátů lišících se periferní substitucí 11. C C pyrazin-2,3-dikarbonitril H H C C pyridin-2,3 dikarbonitril H H C C pyridin-3,4-dikarbonitril H H br.13/ Prekurzory jednotlivých strukturních typů AzaPc a schéma syntéz příslušných AzaPc 28

4.1.1 Periferní řetězec AzaPc bjemnost substituentu periferního řetězce Vzhledem k velkému, rovinnému a konjugovanému systému (obr.14)., který AzaPc tvoří, je schopnost tvořit diméry až oligomery u těchto látek veliká. To vede ke špatné rozpustnosti látek, s čímž souvisí potíže při čistění. Agregací je ztížena i možnost správně charakterizovat látky především po jejich strukturní stránce 60. bjemné a dosti rozvětvené substituenty na periferii mají za úkol látky dostatečně monomerizovat a tím zjednodušit práci s nimi. Jsou zodpovědny za stérické bránění nasedání těchto rovinných molekul na sebe (obr.15). br.14/ Azaftalocyaninový makrocyklus bez objemného substituentu na periferii (prostorový model byl vymodelován v programu Hyper Chem TM 5.01) br.15/ Azaftalocyaninový makrocyklus s objemnými substituenty na periferii (prostorový model byl vymodelován v programu Hyper Chem TM 5.01) 29

Heteroatom v periferním řetězci Kromě derivátů AzaPc, které mají periferní řetězce navázány C-C vazbou si můžeme představit i deriváty, kde je periferní řetězec spojen se základním makrocyklem pomocí heteroatomu. Vliv zabudování heteroatomu do postranního řetězce AzaPc molekuly byl sledován v mnoha studiích. Cílem byla optimalizace fyzikálně-chemických vlastností těchto látek. ejčastěji se jedná o heteroatomy z VI A skupiny periodické soustavy prvků (kyslík, síra) a o dusík ze skupiny V A. Kromě samotných heteroatomů mohou být do molekuly zabudovány celé funkční skupiny, což se využívá především k lepšímu zacílení molekuly PS v organismu. Studie byly zaměřeny především na stabilitu látek během tetramerizace v butanolátu a produkci singletového kyslíku. Ukázalo se, že alkylamino deriváty AzaPc (obr.16) jsou sice nejstabilnější, avšak produkce singletového kyslíku je pro PDT nevýznamná. U méně stabilních alkylsulfanyl (obr.16) a alkoxy derivátů (obr.16) je naopak produkce 1 2 dostatečná 61. H H H H H H H H alkylamino deriváty AzaPc H H S S S S H H S S H H S S alkylsulfanyl deriváty AzaPc alkoxy deriváty AzaPc br.16/ Základní struktury AzaPc obsahující v periferním řetězci heteroatom 30

4.2 Aryloxyderiváty azaftalocyaninů Aryloxyderiváty AzaPc tvoří skupinu látek, jejímž základem je azaftalocyaninový kruh, ke kterému jsou připojeny periferní aromatické řetězce přes kyslík. Tento heteroatom se stává spojujícím článkem mezi samotným AzaPc kruhem a arylovým substituentem na periferii (br.17). Syntéza těchto látek je dvoustupňová. ejprve je nutné připravit si aryloxyderivát pyrazin-2,3-dikarbonitrilu a následně tento prekurzor podrobit tetramerizaci za vzniku AzaPc. Samotná příprava prekurzorů nebývá obtížná, principem bývá nejčastěji nukleofilní substituce, kdy jsou chlory výchozí látky (5,6-dichlorpyrazin-2,3- dikarbonitril) nahrazeny nukleofilní substitucí požadovanými arylovými substituenty vázanými přes kyslík (viz kapitola 8). btížná je především druhá část přípravy, tedy cyklotetramerizace. ejvíce se studiem přípravy těchto látek zabývá pracovní skupina kolem Makhseeda. Ar Ar Ar Ar H H Ar Ar Ar Ar br.17/ Základní struktura aryloxyderivátu AzaPc 31

4.2.1 btíže při cyklizaci aryloxyderivátů pyrazin-2,3-dikarbonitrilu Je známo několik principů tetramerizace. ejčastěji se jedná o reakci v prostředí alkoholátu, který připravíme z alkoholu a alkalického kovu (Li) 62 či kovu alkalických zemin (Mg) 63. Tohoto principu využila i E. Mørkved, které se podařilo nasyntetizovat 5,6-difenoxypyrazin-2,3-dikarbonitril, který podrobila cyklizaci (obr.18). C C Mg ; -H ref lux H H H = C 3 H 7 br.18/ Pokus o syntéza fenoxyderivátu AzaPc Jak je vidět ze schématu, pokus byl neúspěšný. Došlo k nežádoucí transeterifikaci, která se projevila dehtovým zápachem unikajícího fenolu 64. Další typ cyklizace, který byl popsán i u AzaPc, využívá silné baze pro tvorbu alkoholátu jako iniciátoru tetramerizace. Používá se především 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU) nebo 1,5-diazabicyclo[4,3,0]non-5-en (DB). Prekurzory se rozpustí v alkoholu (methanol, propanol) a zahřívají se při teplotě varu. V případě syntézy fenoxyderivátu však opět dochází k nežádoucí transeterifikaci 8. První, komu se úspěšně povedlo připravit aryloxyderivát AzaPc, byla v roce 2007 pracovní skupina soustředěná kolem Makhseeda. V článku vědeckých periodik popsal postup přípravy bezkovového i kovového derivátu AzaPc 1 (br.19). Výsledné molekuly blíže charakterizoval v publikaci v roce 2008 65. 32

33 M i nebo ii C C br.19/ Syntéza fenyloxyderivátu AzaPc dle Makhseeda i. pro AzaPc (1b-d) a (2b-d) : octan daného kovu, chinolin, 160 C, 24h ii. pro AzaPc (1a) a (2a) : chinolin, 160 C, 24h 1 : = i-pr; (a) M=2H, (b) M=Zn, (c) M=i (d) M=Co 2 : = Ph; (a) M=2H, (b) M=Zn, (c) M=i (d) M=Co

Další obměny aryloxyderivátů AzaPc na sebe nenechaly dlouho čekat. Ještě ten samý rok (2008) publikoval Fadi Ibrahim společně s Saadem Makhseedem syntézu derivátu obsahujícího navíc osm nitroskupin 66 (obr.20). 2 2 C C H Cl Cl i C C 2 ii 2 2 M 2 2 2 2 2 2 i. dioxan, ah, 100 C M = Zn, Co = isopropyl ii. chinolin, 160 C, příslušná bezvodá sůl kovu (octan zinečnatý, chlorid kobaltnatý) br.20/ Syntéza nitrovaného aryloxyderivátu AzaPc dle Ibrahima a Makhseeda ejnovější publikované studie potvrdily přípravu dalších možných derivátů aryloxyazapc. Mørkved v článku 2 popisuje syntézu čtyř monomerních derivátů AzaPc, obsahující pyridin-3-yloxy substituent. Jedná se o AzaPc vycházející z následujících prekurzorů: ze symetrického 5,6-di(pyridin-3-yloxy)pyrazin-2,3-dikarbonitril (a) a tří nesymetrických pyrazin-2,3-dikarbonitrilů substituovaných pyridin-3-yloxy substituentem v kombinaci s vodíkem (b), methylem (c) nebo fenylem (d), vždy v polohách 5 a 6. (obr.21) Iniciátorem cyklotetramerizace byl chlorid bis(chinolináto)zinečnatý. a : = = b : =H = Zn c : = Me = d : = Ph = (a-d) br.21/ Symetrický a nesymetrické AzaPc substituované pyridin-3-yloxylem 34

5. EXPEIMETÁLÍ ČÁST Teploty tání byly stanoveny na digitálním přístroji pro stanovování teplot tání ELECTTHEMAL IA9200 a jsou nekorigovány. Průběh reakcí a čistota produktů a meziproduktů byly kontrolovány tenkovrstvou chromatografií na deskách Merck Silikagel 60 F254. Detekce byla prováděna světlem vlnové délky 254 nm a 366 nm. Vyvíjecí soustavy jsou uvedeny u jednotlivých reakcí. Sloupcová chromatografie byla prováděna na silikagelu Merck Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm). Infračervená spektra byla měřena I spektrofotometrem icolet 6700 (v AT módu) na KACH FaF UK v Hradci Králové. Vlnočty jsou uvedeny v cm -1. Elementární analýza byla stanovena na přístroji Automatic Microanalyser EA1110CE (Fisons Instruments S.p.A., Milano, Italy) na KFCHKL FaF UK v Hradci Králové. M spektra byla měřena na přístroji VAIA MECUY VxBB 300 na KACH FaF UK v Hradci Králové. Měření bylo prováděno při frekvenci 299.95 MHz ( 1 H M) a 75.43 ( 13 C M). Posuny jsou vztaženy k vnitřnímu standardu Si(CH 3 ) 4. Spektrum ve viditelné oblasti bylo změřeno na přístroji SHIMADZU UV 240 1 PC: UV-VIS recording spectrophotometer (Shimadzu Europa, GmbH, Duisburg, Germany). Fluorescenční spektra byla získána na přístroji AMIC-Bowman Series 2 luminescence spectrometer (SLM-Aminco, Urbana, IL, USA). Hmotnostní spektra (MALDI-TF) byla měřena na přístroji Voyager-DE ST mass spectrometer (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). Přístroj byl kalibrován externě 5-ti bodovou kalibrační metodou pomocí Peptide Calibration Mix1 (LaserBio Labs, Sophia-Antipolis, France). oztok měřeného vzorku v dichlormethanu nebo pyridinu (přibližně 10 µm, 1.5 µl) byl smíchán s matricí (trans-2-[3-(4-tert-butylfenyl)-2-metyl-2-propenyliden]-malononitril) v dichlormethanu a nanesen na destičku. 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitril 67 a chlorid bis(chinolináto)zinečnatý 8, 68 byly připraveny již dříve na Katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv podle publikovaných postupů. 35

metody 3A, 3B Schéma prováděných reakcí H C Cl metody 1A, 1B C C C Cl (1) metody 2A, 2B H H CH C C C (2) C H (3) CH 36

37 Zn (4) (6) H H H H H H H H C C (2) H H Zn H H C C

CH C C (3) CH HC CH HC HC Zn CH CH HC CH (5) 38

5.1 Příprava prekurzorů 5.1.1 Příprava 5,6-bis[4-(3-hydroxypropyl)fenoxy]pyrazin-2,3-dikarbonitrilu (1) H C C (1) Mr = 430,47 H Metoda 1A: pomocí hydroxidu sodného Hydroxid sodný (100,5 mg, 2,5 mmol) byl rozpuštěn ve 20 ml vody a ke vzniklému roztoku byl pomalu přidán 4-(3-hydroxypropyl)fenol (382,4 mg, 2,5 mmol). Suspenze se poté nechala míchat na elektromagnetické míchačce 20 minut při pokojové teplotě. Za použití ultrazvuku a přídavku malého množství ethanolu se ze suspenze získal čirý roztok, ke kterému se postupně přikapával 5,6-dichlorpyrazin-2,3- dikarbonitril (200 mg, 1,0 mmol) rozpuštěný v 10 ml tetrahydrofuranu. Pomocí tenkovrstvé chromatografie bylo zjištěno, že reakce proběhla okamžitě. oztok byl zahuštěn na vakuové rotační odparce a pak vytřepán do ethylesteru kyseliny octové. Poté byla organická fáze vysušena bezvodým síranem sodným, přefiltrována a odpařena do sucha. Získala se tak olejovitá látka, která byla přečištěna pomocí sloupcové chromatografie. Z této reakce byly vyizolovány dvě frakce o retenčních faktorech 0,61 a 0,43, obě bílé krystalické látky. Sloučenina s f 0,43 odpovídá požadovanému produktu 1. Výtěžek : 99 mg (23 %) Teplota tání 117 120 C Vyvíjecí soustava : chloroform : aceton (10 : 1) 39

1 H M: (300 MHz, (CD 3 ) 2 C, 25 C): δ = 1,83 (p, 4 H, J = 7,1 Hz, CH 2 CH 2 CH 2 H); 2,74 (t, 4H, J = 8,0 Hz, CH 2 CH 2 CH 2 H), 3,56-3,58 (m, 4H, CH 2 CH 2 CH 2 H), 7,15 (dt, 4H, J 1 = 8,0 Hz, J 2 = 2,0 Hz, fenol H), 7,37 ppm (dt, 4H, J 1 = 8,0 Hz,, J 2 = 2,0 Hz, fenol H). 13 C M (75 MHz, (CD 3 ) 2 C, 25 C): δ = 32,09; 35,39; 61,50; 110,61; 120,87; 122,30; 131,42; 136,68; 141,56 a 152,80. IČ: (AT) ν max = 3259, 3100, 3036, 2928, 2854, 2763, 2596, 2233(C), 2122, 1901, 1732, 1584, 1551, 1503, 1484, 1451, 1383, 1362, 1303, 1278, 1254, 1203, 1163, 1130, 1105, 1041, 1011, 915, 891, 845 a 797 cm -1 Elementární analýza vypočteno (%) pro C 24 H 22 4 4 : C, 66,97; H, 5,15;, 13,02; nalezeno: C, 64,76; H, 4,34;, 9,69. Pozn.: Vzniklý vedlejší produkt ( f 0,61): 5,6-diethoxypyrazin-2,3dikarbonitril (potvrzen dle M) Výtěžek : 89 mg (41%) Metoda 1B: pomocí uhličitanu draselného Uhličitan draselný (833 mg, 6,0 mmol) byl rozdrcen na jemný prášek a smísen s 10 ml bezvodého tetrahydrofuranu za vzniku suspenze. Směs se ponechala 15 minut v ultrazvuku a následně se přidal 4-(3-hydroxypropyl)fenol (382 mg, 2,5 mmol). Poté byla suspenze zahřívána pod zpětným chladičem v olejové lázni při teplotě 90 C přibližně 1 hodinu, též za použití sušící rourky, aby bylo zachováno bezvodé prostředí. ásledovalo přidání druhé výchozí látky 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitrilu (200 mg, 1,0 mmol) a směs se nechala zahřívat při teplotě 90 C přes noc. Metodou tenkovrstvé chromatografie bylo zjištěno, že reakce proběhla v plném rozsahu a směs byla zahuštěna na vakuové odparce. Po přídavku vody se vysrážený produkt odfiltroval a přečistil sloupcovou chromatografií. a závěr byl produkt překrystalizován ze směsi ethanol/voda. Takto byla získána bílá krystalická látka. Výtěžek : 203 mg (47 %) Teplota tání : 117 120 C Vyvíjecí soustava : chloroform : aceton (10 : 1) 40

5.1.2 Příprava 5,6-bis[4-(hydroxymethyl)fenoxy]pyrazin-2,3-dikarbonitrilu (2) H C C (2) Mr = 374,36 H Metoda 2A: pomocí hydroxidu sodného 4-hydroxybenzylalkohol (1,56 g, 12,6 mmol ) byl rozmělněn a k němu přidán 1M vodný roztok hydroxidu sodného (V=12,5 ml, 12,5 mmol), směs se míchala 15 min při pokojové teplotě. Poté byl po kapkách přidán předem rozpuštěný 5,6-dichlorpyrazin- 2,3-dikarbonitril (1,0 g, 5 mmol) v tetrahydrofuranu. eakční směs se míchala při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Vznikl nažloutlý čirý roztok. Po odpaření rozpouštědel na vakuové rotační odparce byla směs extrahována do ethyl-acetátu. rganická část byla následně vysušena bezvodým síranem sodným, přefiltrována a odpařena do sucha. Produkt byl následně čištěn pomocí sloupcové chromatografie. Produktem byla bílá krystalická látka. Výtěžek : 895 mg (48 %) Teplota tání : 150-155 C Vyvíjecí soustava : ethyl-acetát : hexan (5 : 2) 1 H M (300 MHz, (CD 3 ) 2 C, 25 C): δ = 4,33 (t, 2 H, J = 5,8 Hz, H); 4.69 (d, 4 H, J = 5,8 Hz, CH 2 ); 7,31 (d, 4 H, J = 8,6 Hz, aromh) ppm. 13 C M (75 MHz, (CD 3 ) 2 C, 25 C): δ = 64,0; 114,3; 121,9; 124,5; 128,9; 142,1; 151,4 a 153,3 ppm. IČ (AT): ν max = 3303, 2936, 2873, 2233 (C), 1729, 1701, 1598, 1544, 1501, 1441, 1400, 1374, 1350, 1237, 1194, 1153, 1105, 1039, 1011, 941, 924, 858, 847 a 809 cm -1. 41

Elementární analýza vypočteno (%) pro C 20 H 14 4 4 : C, 64,17; H, 3,77;, 14,97; nalezeno: C, 62,45; H, 4,25;, 14,37. Metoda 2B: pomocí pyridinu 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitril (200 mg, 1,0 mmol) byl rozpuštěn v 10 ml tetrahydrofuranu, k roztoku byl přidán 4-hydroxybenzylalkohol (622 mg, 5,0 mmol) a pyridin (0,36 ml, 4,47 mmol). Směs byla míchána při pokojové teplotě a průběh reakce byl průběžně sledován pomocí tenkovrstvé chromatografie. eakce proběhla během 24 hodin. Produkt byl odpařen do sucha na vakuové rotační odparce za vzniku olejovité látky, která byla vytřepána směsí chloroform/voda. Chloroformová vrstva byla oddělena a po odpaření rozpouštědla zůstala žlutá krystalická látka, která byla přečištěna, pomocí sloupcové chromatografie za zisku bílé krystalické látky. Výtěžek : 245 mg (65 %) Teplota tání : 150-155 C Vyvíjecí soustava : ethyl-acetát : hexan (5 : 2) 42

5.1.3 Příprava 3,3'-[4,4'-(5,6-dikyanopyrazin-2,3-diyl)bis(oxy)bis(4,1-fenylen)] dipropanové kyseliny (3) CH C C (3) Mr = 458,40 CH Metoda 3A: pomocí hydroxidu sodného Hydroxid sodný (1,206 g, 30,2 mmol) byl rozdrcen a rozpuštěn ve 20 ml vody. K roztoku byla přidána kyselina 3-(4-hydroxyfenyl)-1-propanová (2,088 g, 12,6 mmol) a směs byla míchána na elektromagnetické míchačce 15 minut při pokojové teplotě. Mezitím byl rozpuštěn 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitril (1 g, 5,0 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu a poté byl tento roztok postupně přikapáván k reakční směsi. eakce proběhla okamžitě. Produkt byl zahuštěn na vakuové odparce, okyselen zředěnou kyselinou chlorovodíkovou do mírně kyselé reakce a vytřepán do ethylesteru kyseliny octové. Po oddělení organické fáze a jejím vysušení bezvodým síranem sodným byl produkt za sníženého tlaku odpařen do sucha. K následnému čistění produktu byla využita sloupcová chromatografie. Byla tak získána bílá krystalická látka. Výtěžek : 1,68 g (73 %) Teplota tání : 203-205 C Vyvíjecí soustava : chloroform : aceton : kyselina octová (10 : 10 : 1) 1 H M (300 MHz, (CD 3 ) 2 C, 25 C): δ = 2,68 (t, 4 H, J = 7,6 Hz, CH 2 ); 2,98 (t, 4 H, J = 7,6 Hz, CH 2 ); 7,27 (d, 4 H, J = 8.6 Hz, aromh) a 7,43 (d, 4 H, J = 8,5 Hz, aromh) ppm. 43

13 C M (75 MHz, (CD 3 ) 2 C, 25 C): δ = 35,6; 114,3; 122,0; 124,5; 130,8; 140,6; 150,9; 153,2, 173,8 a 205,5 ppm. IČ (AT): ν max = 3037, 2939, 2629, 2561, 2360, 2342, 2242, 1697, 1548, 1499, 1449, 1408, 1360, 1305, 1284, 1239, 1217, 1193, 1183, 1159, 1100, 1045, 1019, 964, 948, 928, 903, 853, 832 a 816 cm -1. Elementární analýza vypočteno (%) pro C 24 H 18 4 6 : C, 62,88; H, 3,96;, 12,22; nalezeno: C, 63,15; H, 4,19;, 12,28. Metoda 3B: pomocí pyridinu 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitril (200 mg, 1,0 mmol) byl rozpuštěn v 10 ml tetrahydrofuranu a k tomuto roztoku byla přidána kyselina 3-(4-hydroxyfenyl)-1-propanová (417,5 mg, 2,51 mmol) a pyridin (0,4 ml, 4,97 mmol). eakční směs byla míchána za pokojové teploty. Průběh reakce byl sledován pomocí tenkovrstvé chromatografie. Po 24 hodinách byla reakce ukončena a za sníženého tlaku byl odpařen tetrahydrofuran. Produkt byl rozpuštěn ve vodě a vodný roztok okyselen pomocí zředěné kyseliny chlorovodíkové do slabě kyselé reakce. Vysrážená volná kyselina byla extrahována do ethyl-acetátu, vysušena bezvodým síranem sodným a následně odpařena do sucha na vakuové rotační odparce. Látka byla podrobena tenkovrstvé chromatografii, která po srovnání se standardem připraveným dle výše popsaného postupu (Metoda 3A) nepotvrdila očekávaný produkt. 44

5.2 Příprava aryloxy substituovaných derivátů azaftalocyaninů 5.2.1 Příprava 2,3,9,10,16,17,23,24-oktakis[4-(hydroxymethyl)fenoxy]-1,4,8,11,15,18,22, 25-oktaazaftalocyaninato zinečnatého komplexu (4) Prekurzor 2 (5,6-bis(4-(hydroxymethyl)fenoxy)pyrazin-2,3-dikarbonitril) (220 mg, 0,59 mmol) byl smísen s chloridem bis(chinolináto)zinečnatým (231mg, 0,59 mmol). Směs byla rozdělena na 5 částí a převedena do zkumavek. Do každé ze zkumavek bylo přidáno malé množství čerstvě předestilovaného chinolinu a směs byla zahřáta horkovzdušnou pistolí. Byla zkoušena řada teplot 120-340 C a časových rozmezí zahřívání směsi (5-60 min), která by byla pro reakci nejoptimálnější. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5. Tab.5/ eakční podmínky a výsledky reakce teplota reakce čas reakce výsledek reakce 120 C 60 min neproběhla 140 C 60 min nízký výtěžek 180 C 5 min optimální 220 C 5 min produkt se začíná rozkládat 280 C 5 min produkt rozložen 340 C 5 min produkt rozložen Jako optimální byla zjištěna teplota 180 C a doba zahřívání 5 minut. Produkt zelené barvy byl důkladně promyt směsí methanol/voda (1 : 2) a ponechán proschnout do druhého dne. Produkt byl následně čištěn promytím různými organickými rozpouštědly, za tímto účelem byl použit tetrahydrofuran, chloroform, toluen, aceton, lékařský benzín. akonec byl produkt rozpuštěn v malém množství pyridinu (0,5 ml), 45

nakapán do kádinky s chloroformem (30 ml) a ponechán k opětovnému vysrážení přes noc při -25 C. Druhý den byl odfiltrován čistý produkt. Výtěžek : 35 mg (44 %) M analýza produktu není možná kvůli nízké rozpustnosti produktu v běžných rozpouštědlech. IČ (AT): ν max = 3335, 2931, 2864, 1735, 1670, 1655, 1648, 1604, 1578, 1570, 1541, 1528, 1500, 1388, 1382, 1218, 1158, 1106, 1055, 1013, 924, 817 a 745 cm -1. UV/Vis (pyridin): λ max (ε) = 633 (49 100), 579 (12 600), 372 nm (50 000 dm 3 mol -1 cm -1 ). Elementární analýza vypočteno (%) pro C 80 H 56 16 16 Zn+2H 2 : C, 60,10; H, 3,78;, 14,02; nalezeno: C, 59,64; H, 3,61;, 14,43. H H H H Zn H H H H (4) 46

5.2.2 Příprava 2,3,9,10,16,17,23,24-oktakis[4-(2-karboxyethyl)fenoxy]-1,4,8,11,15,18,22, 25-oktaazaftalocyaninato zinečnatého komplexu (5) Prekurzor 3 (kyselina 3,3'-(4,4'-(5,6-dikyanopyrazin-2,3-diyl)bis(oxy) bis(4,1-fenylen))dipropanová) (70 mg, 0,15 mmol) byl důkladně smísen s chloridem bis(chinolináto)zinečnatým (60 mg, 0,15 mmol) a směs byla rozdělena na 5 stejných částí do zkumavek. V každé zkumavce byla směs zakápnuta malým množstvím čerstvě předestilovaného chinolinu a zahřáta horkovzdušnou pistolí. Byla zkoušena řada teplot (120-300 C) a časových rozmezí (5-60 min) zahřívání směsi, která by byla pro reakci nejoptimálnější. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6. Tab.6/ eakční podmínky a výsledky reakce teplota reakce čas reakce výsledek reakce 120 C 60 min neproběhla 140 C 60 min žlutá látka 160 C 60 min nízký výtěžek 200 C 60 min nízký výtěžek 250 C 5 min optimální 300 C 5 min produkt rozložen Jako optimální byla zjištěna teplota 250 C a doba zahřívání 5 minut. Produkt zelené barvy byl smísen se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou a dekantován. Poté byl přidán vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného, čímž vznikla ve vodě rozpustná sodná sůl látky 5. ásledně byla přidána znovu kyselina chlorovodíková, aby došlo k vysrážení volné kyseliny, směs byla zfiltrována a ponechána k proschnutí do druhého dne. Za účelem čištění byla látka promyta organickými rozpouštědly. Byl použit tetrahydrofuran, chloroform, toluen, aceton, lékařský benzín. 47

Látka nemohla být kvůli nízké rozpustnosti v běžných organických rozpouštědlech charakterizována pomocí M spekter. Díky malému množství, jež bylo získáno, byla změřena pouze UV-vis spektra. Výtěžek : 3 mg (4 %) UV/Vis (pyridin): λ max = 632, 576, 374, 360 nm HC CH HC HC Zn CH CH HC CH (5) 48

5.2.3 Příprava {[2,3-bis[4-(hydroxymethyl)fenoxy]-9,10,16,17,23,24-hexakis(2,6-diisopro pylfenoxy)-1,4,8,11,15,18,22,25-(octazaftalocyaninato)]} zinečnatého komplexu (6) Prekurzor 2 (5,6-bis(4-(hydroxymethyl)fenoxy)pyrazin-2,3-dikarbonitril) (20 mg, 0,05 mmol) byl smísen s 5,6-bis(2,6-diisopropylfenoxy)pyrazin-2,3-dikarbonitrilem (77,4 mg, 0,15 mmol), který byl dříve připraven na katedře 8, a s chloridem (bischinolináto)zinečnatým (84,0 mg, 0,2 mmol). Tato směs byla zakápnuta malým množstvím čerstvě předestilovaného chinolinu a zahřáta horkovzdušnou pistolí na teplotu 240 C, kdy došlo ke zbarvení produktu do zelena. Produkt byl promyt směsí methanol/voda (1 : 1) a podroben tenkovrstvé chromatografii, která prokázala pouze dvě skvrny odpovídající standardům symetrických derivátů. čekávaný produkt 6 nevznikl. Vyvíjecí soustava : CHCl 3 : pyridin (20 : 1) H Zn H (6) 49

6. DISKUZE Výchozí látkou pro syntézy byl 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitril. Z této výchozí látky jsem připravila tři prekurzory (1-3) pro následnou syntézu aryloxysubstituovaných azaftalocyaninů. Principem přípravy zmíněných prekurzorů je nukleofilní substituce, kdy jsou atomy chloru výchozí látky nahrazeny požadovanými substituenty. C Cl C H (1) C Cl C = H (2) (3) Prekurzor 1 jsem připravovala za různých podmínek. Při použití hydroxidu sodného (metoda 1A) došlo ke vzniku vedlejšího produktu, který byl později identifikován jako 5,6-diethoxypyrazin-2,3dikarbonitril. Etanol, který byl v tomto postupu přidán kvůli zvýšení rozpustnosti 4-(3-hydroxypropyl)fenolu, reaguje nečekaně za těchto podmínek s výchozím 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitrilem a brání tak vyšším výtěžkům požadovaného produktu. Proto jsem zvolila jiné reakční podmínky (metoda 1B), při kterých byl jako rozpouštědlo použit pouze tetrahydrofuran a jako báze uhličitan draselný. Vedlejší produkt se již neobjevil a výtěžek se tak zvýšil na dvojnásobek. ůzným podmínkám jsem podrobila i přípravu prekurzoru 2. ejvyšších výtěžků bylo nakonec dosaženo pomocí pyridinu jako báze (metoda 2B). ptimalizace poměrů výchozích látek a podmínek reakce u této metody byla stanovena na základě výsledků z tenkovrstvé chromatografie, která byla prováděna po všech zásazích do reakčního schématu. Bylo patrné, že zvýšená teplota reakci nepodporuje. Výraznější změny ve prospěch reakce byly zaznamenány až v případě zvýšení poměru látkového množství výchozích látek z původních 1 : 2,5 : 2,2 na 1: 5 : 4,4 (5,6-dichlorpyrazin-2,3- dikarbonitril / 4-hydroxybenzylalkohol / pyridin). Prekurzor 2 jsem zkoušela připravit i bez přídavku jakékoli báze. Po rozpuštění 4-hydroxybenzylalkoholu a 5,6-dichlorpyrazin-2,3-dikarbonitrilu v tetrahydrofuranu bylo z tenkovrstevné chromatografie patrné, že požadovaný prekurzor 2 nevzniká. bjevila se pouze skvrna, 50 H

která pravděpodobně odpovídala monosubstituovanému derivátu 5-chlor-6-(4-(hydroxymethyl)fenoxy)pyrazin-2,3-dikarbonitrilu. Zvýšení reakční teploty ani delší doba reakce nevedla k požadované sloučenině 2. C Cl C Cl H H C C Cl H Při přípravě prekurzoru 3 bylo dosaženo vysokého výtěžku (73 %) již za prvních podmínek, tedy při využití hydroxidu sodného (metoda 3A). Další optimalizace již nebyla nutná. I přesto jsem vyzkoušela ještě přípravu za použití pyridinu (metoda 3B). Už v průběhu této metody se ale vyskytovaly potíže např. s rozpustností látek. Tenkovrstvá chromatografie nakonec nepotvrdila požadovaný produkt, proto jsem od této metody ustoupila. Výsledkem první části mé diplomové práce byla příprava prekurzorů pro následnou syntézu aryloxysubstituovaných zinečnatých komplexů azaftalocyaninů (ZnAzaPc). V druhé části jsem se věnovala jejich cyklotetramerizaci. AzaPc se běžně připravují cyklotetramerizací v alkoholech v přítomnosti alkoxidů kovů, nejčastěji hořečnatých a lithných. Tuto metodu však nelze použít kvůli známé transeterifikační reakci 64, kdy jsou aryloxy- substituenty nahrazeny alkyloxylovými řetězci použitého alkoxidu. Zkusila jsem proto metodu, kterou publikovali Mørkved a kol. 68 pro přípravu thiomorfolinyl-, pyrazol-1-yl a imidazol-1-yl AzaPc a která byla na naší katedře úspěšně použita na přípravu okta(2,6-diisopropylfenoxy) ZnAzaPc (7) 8. Jedná se o cyklotetramerizaci prekurzorů v tavenině chloridu bis(chinolináto)zinečnatého (ZnQ 2 Cl 2 ). Ve všech případech jsem volila stejný postup dle obecného schématu. 2,3 chinolin ZnQ 2 Cl Zn = 2 t H H (4) (5) 51

K cyklotetramerizaci byly použity prekurzory 2 a 3. U každé z látek jsem zkoušela určité rozmezí teplot a dobu zahřívání, a hledala tu nejoptimálnější kombinaci. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 1 a 2 v experimentální části. Cyklotetramerizace byla patrná při změně bílé barvy výchozích látek na tmavě zelenou, která odpovídá zbarvení takto substituovaných AzaPc. Příliš vysoké teploty nebo delší zahřívání u nižších teplot vedlo k černání, zuhelnatění a k rozkladu výchozích látek a nebo i produktů. ěkteré teploty byly naopak tak nízké, že ani po 60-ti minutovém zahřívání nestačily pro reakci. a základě následného měření absorpčních spekter v pyridinu byly stanoveny individuální podmínky. Každá z látek vyžadovala jinou optimální teplotu, doba zahřívání byla v obou případech shodná. Délka 5 minut byla stanovena poté, kdy delší časový interval vedl k rozkladu látky. Připravený symetrický derivát aryloxysubstituovaného AzaPc 4 se vyznačuje nízkou rozpustností v organických rozpouštědlech, čehož mohlo být využito při čištění této látky. Má to ale i negativní dopad pro další práci s látkou, např. nelze změřit M spektrum. Syntéza symetrického derivátu aryloxysubstituovaného AzaPc 5 vedla k malým výtěžkům. To přisuzuji především potížím, které se vyskytly při čištění produktu. Při vysrážení kyseliny pomocí kyseliny chlorovodíkové a po dekantaci produktu byl patrný bílý prášek ulpívající na stěnách kádinky, který jsem původně přisuzovala zbytkům ZnQ 2 Cl 2 z reakce. Ani po opětovném promytí směsí metanol/voda (1 : 1) však prášek nezmizel. Produkt jsem proto rozpustila v pyridinu, kde se bílý prášek nerozpustil a mohla jsem ho odfiltrovat. Produkt jsem následné odpařila do sucha na vakuové odparce. AzaPc mají díky planárnímu charakteru jejich základního makrocyklu tendenci k tvorbě dimérů a vyšších agregátů. Tomu lze zabránit zavedením objemných substituentů na periferii, které se orientují nad a pod rovinu základního makrocyklu AzaPc a brání tak nasedání molekul na sebe. Prostorové uspořádání obou připravených látek (4 a 5) nedovoluje plnou monomerizaci v roztoku, jako je obvyklé u jiných AzaPc (např. u látky 7). Je to patrné z naměřených absorpčních spekter (Graf 1). 52

Absorbance / a.u. 1.0 0.5 B-pás Q-pás Zn 0.0 400 500 600 700 Vlnová délka / nm (7) Graf 1.: ormalizovaná UV-vis spektra v pyridinu (7 černá, 4 modrá, 5 červená) Spektra byla měřena v pyridinu, který jako koordinační rozpouštědlo podporuje monomerizaci látek. Poloha Q pásu je u všech látek shodná (cca 630 nm), neboť je dána především shodným AzaPc skeletem a v menší míře pak charakterem periferních substituentů - kyslíkovými atomy spojujícími periferní řetězce se základním makrocyklem. Látka 7 8 nese na periferii prostorově objemné substituenty, které zaručují kompletně monomerní charakter látky ve všech rozpouštědlech díky striktně nekoplanárnímu uspořádání periferních aryloxy substituentů. Toto uspořádání bylo nedávno potvrzeno i krystalografickou TG analýzou 69 (br.22). Monomerní charakter látky v pyridinu je jednoduše patrný z absorpčního spektra ostrým náběhem Q-pásu. aopak látky 4 a 5, které nemají periferní substituenty tolik objemné (jak je vidět na modelech na (br.23) a jejich arylová jádra mohou být orientována spíše koplanárně, jeví známky slabé agregace, což je viditelné na pozvolnějším náběhu Q pásu v oblasti 690 nm a jeho širším charakterem (viz šipky v grafu 1). Agregace způsobuje nejen sníženou rozpustnost těchto látek, o které jsem se zmínila již výše v textu, ale i problémy s čištěním pomocí sloupcové chromatografie a snížení kvantových výtěžků singletového kyslíku i fluorescence (tabulka 7). Energie absorbovaná sloučeninou po excitaci světlem je totiž vyzářena převážně ve formě tepla, jen minimální část jde na produkci singletového kyslíku a fluorescence, což je pro fotodynamickou terapii nežádoucí. 53

a) pohled z příma na molekulu b) pohled z boku na molekulu c) pohled na šípovitou strukturu makrocyklu (směrem dolů na osu x krystalu) d) pohled podél osy krystalu ukazující neuspořádané rozpouštědlo mezi šípovitou strukturou br. 22/ Výsledky z krystalografické TG analýzy 69 54

(4) (7) br.23/ Prostorové modely látek 4 a 7 (vymodelovány v programu Hyper Chem TM 5.01) Tab 3/ Kvantové výtěžky sloučeniny 4 ve srovnání s látkou 7 změřené v pyridinu Sloučenina 4 7 Kvantový výtěžek singletového kyslíku 0,18 0,61 Kvantový výtěžek fluorescence 0,043 0,29 55