3. Stanovení glukosaminu ve výživových doplňcích pomocí kapilární elektroforézy Glukosamin (2-amino-2-deoxyglukózamonosacharid je široce distribuován ve tkáních lidského organismu jako složka je klíčovou složkou chrupavky. Tento glykosaminoglykanů. Některé studie prokázaly, že glukosamin je účinný při zmírnění bolesti při osteoartróze a zmírňuje artritidu. Výrobky obsahující glukosamin jsou komerčně dostupné po celém světě jako doplňky stravy, a proto je důležité kontrolovat jejích obsah a kvalitu. Obr. 1. Struktura glukosaminu. HPLC se spektrofotometrickou, fluorescenční detekcí a detekcí pomocí indexu lomu jsou často využívány pro analýzu glukosaminu v potravinových doplňcích. Stanovaní pomocí kapilární elektroforézy nabízí kratší čas analýzy a nižší náklady. Nicméně, pro použití UV detekce je nezbytná derivatizace, jelikož glukosamin neobsahuje žádný UV-absorbující chromofor. Mezi běžné derivatizační činidla patří o-ftalaldehyd, N-(9-fluorenylmethoxykarbonyloxy) fluorenylmethoxykarbonyloxy)sukcinimid a kyselina anthranilová. O-ftalaldehyd má vysokou reaktivitu vůči primárním aminům, reakce probíhá rychle už při pokojové teplotě a dá se snadno automatizovat. Obr. 2. Struktura o-ftalaldehydu.
Kapilární elektroforéza je separační technika založena na elektroforetické migraci iontů v elektrickém poli, k separaci dochází na základě různé pohyblivosti jednotlivých látek. Separace je uskutečňována v kapiláře, která je vyrobena z taveného křemene a je pokryta vrstvou polyimidu, který zabezpečuje mechanickou odolnost. Polyimid je opticky nepropustný, proto v místě detekce je potřeba jeho vrstvu odstranit. Konce kapiláry jsou umístěny v nádobkách se separačním elektrolytem a do nádobek jsou vloženy platinové elektrody. Separace analytů probíhá vložením vysokého napětí, které je používáno v rozmezí od 0 do 30 kv. Separované analyty jsou poté sledovány pomocí detektoru, který je umístěn na opačném konci kapiláry než dávkovaný vzorek. Nejčastěji využívaný detektorem je spektrofotometrický založený na měření absorbance v detekčním okénku na kapiláře. Při průchodu látky absorbující záření při zvolené vlnové délce je zaznamenán úbytek intenzity záření, signál je sledován v závislosti na čase a výsledný záznam se nazývá elektroferogram. Sledovány jsou obvykle látky, které obsahují chromofor; je však možné využít nepřímé spektrofotometrické detekce, kdy elektrolyt obsahuje vhodnou absorbující látku pro sledování látek, které neabsorbují záření při zvolené vlnové délce. Druhou možností je derivatizovat sledované látky činidlem, které obsahuje chromofor. Derivatizaci je možné provádět během úpravy vzorku, avšak pokud jsou podmínky derivatizační reakce nenáročné na teplotu a reakce je rychlá, je možné tento krok provést přímo v kapiláře během vlastní separace. Výhodou tohoto provedení je úspora počtu kroků při úpravě vzorku, zejména času, ale také materiálu; tento proces je možné snadno automatizovat, čímž se významně zvyšuje prostupnost vzorků. Derivatizace může být provedena nadávkováním zón vzorku a derivativního činidla vedle sebe a působením difuze nebo vlivem migrace v elektrickém poli dojde k promíchání jednotlivých zón. Jinou možností je použití základního elektrolytu, jehož součástí je i derivatizační činidlo. Pokud analyzovaný produkt absorbuje záření při jiné vlnové délce než samotné činidlo, lze tento přístup použít pro zlepšení výtěžku derivatizační reakce, jelikož je zaručeno, že derivatizační činidlo je v nadbytku oproti stanovované látce. V případě derivatizace glukosaminu pro analýzu kapilární elektroforézou je nutné zvolit derivatizační podmínky tak, aby výsledný produkt obsahoval jednak chromofor, ale také funkční skupinu schopnou disociace, aby vzniklý produkt migroval v elektrickém poli. Z tohoto důvodu je do základního elektrolytu přidána kyselina merkaptopropionová; produkt této reakce (obr. 3.) nese karboxylovou funkční skupinu, v zásaditém základním elektrolytu tedy bude migrovat jako aniont.
Obr. 3. Derivatizační reakce o-ftalaldehydu v přítomnosti primárního aminu a kyseliny merkaptopropionové. Praktická část Vybavení: Agilent HP 3D CE s UV detektorem, vypalovač detekčních okýnek, ultrazvuk, centrifuga, váhy Pomůcky: Kádinky, odměrné baňky, odměrný válec, nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, křemenná kapilára (s vnitřním průměrem 50 µm a celkové délky 48,5 cm), řezátko, vialky, centrifugační zkumavky, eppendorfky Chemikálie: Boritá kyselina, NaOH, o-ftalaldehyd, merkaptopropionová kyselina, standard glukosaminu, deionizovaná voda
Pracovní postup Příprava elektrolytu: - 20 mm boritá kyselina + 5 mm merkaptopropionová kyselina NaOH ph 9,2 - odpovídající množství borité kyseliny rozpusťte v deionizované vodě - přidejte merkaptopropionovou kyselinu, aby její koncentrace byla 5 mm - přidejte odpovídající množství NaOH pro přípravu pufru o ph 9,2 - v plastové nádobce připravte 10 ml 5 mm roztoku o-ftalaldehydu v připraveném roztoku borité a merkaptopropionové kyseliny a NaOH Příprava standardů: - ze zásobního roztoku odpipetujte odpovídající množství pro přípravu standardu glukosaminu o koncentraci 20, 40, 60, 100 a 150 µg/ml Příprava vzorku: - navažte 100 mg přípravku a rozpusťte v 10 ml deionizované vody - umístěte do ultrazvuku na 5 minut - roztok přeneste do centrifugačních zkumavek, centrifugujte 5 min při 10000 rpm - supernatant 10x zřeďte a přeneste do vialky pro analýzu Příprava separační kapiláry: - podle pokynů vedoucího cvičení uřízněte potřebnou délku separační kapiláry - ve vzdálenosti 8,5 cm odstraňte pomocí vypalovače vrstvu polyimidu a okénko otřete gázou navlhčenou v metanolu - podle pokynů vedoucího cvičení umístěte kapiláru do interface a vložte kapiláru do přístroje
- kapiláru promyjte 5 minut 1M NaOH, 5 minut vodou, a následně separačním elektrolytem; nastavte parametry metody (25 kv, detekce při 340 nm, nástřik 50 mbar 5 sekund) Měření vzorků: - proměřte kalibrační roztoky glukosaminu - proměřte vzorek, v případě potřeby vzorek nařeďte - pomocí kalibrační křivky stanovte množství glukosaminu v přípravku Vyhodnocení: Vyhodnoťte plochy píků z měření roztoků glukosaminu o různých koncentracích. Vytvořte kalibrační závislosti plochy glukosaminu na jeho koncentraci. Porovnejte záznamy standardního roztoku a vzorku, na základě migračních parametrů rozhodněte, který ze signálů patří glukosaminu a vypočítejte jeho množství v přípravku (mg/g). Otázky k prozkoušení: 1. Proč je nutné glukosamin derivatizovat? Nakreslete strukturu produktu. 2. Jaké jsou výhody derivatizačního kroku přímo v kapiláře? 3. Proč je nutné odstranit polyimid z kapiláry v místě detekce? Doporučená literatura: 1. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 2. Analytické separační metody, Karolinum Praha 2004, Štulík K. a kol. 3. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy, 91 (1997) 320 329, V. Kašička. 4. Winter R.: A Consumer's Dictionary of Food Additives, 7 th Edition, 2009.