Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253"

Leoš Němeček
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 4 - Nástřik vzorku Dávkovače vzorků/injektory Dávkování vzorků je jednou z klíčových záležitostí v HPLC. Ani nejlepší kolona neposkytne dobrou separaci, pokud není proveden správně nástřik vzorku. Teoreticky by objem nastřikovaného vzorku měl být nekonečně malý a měl by být nanesen do středu začátku kolony bez toho, aby se do kolony dostal vzduch. Existují různé možnosti provedení nástřiku vzorku, ale dnes se prakticky výhradně užívá nástřik pomocí dávkovací smyčky, a je realizován buď manuálně nebo automaticky. Obrázky níže znázorňují funkci smyčkového dávkovače. Smyčka (realizovaná buď jen zářezem v rotoru nebo vnější kapilárou) je naplněna roztokem vzorku, a pak je rotor otočen tak, že se vzorek dostane do proudu mobilní fáze směřující na kolonu. 1

Teoreticky by objem nastřikovaného vzorku měl být nekonečně malý a měl by být nanesen do středu začátku kolony bez toho, aby se do kolony dostal vzduch.

2 Injektor s vnitřní smyčkou. (a) plnění smyčky, (b) nástřik na kolonu Injektor s vnější smyčkou. (a) plnění smyčky, (b) nástřik na kolonu Smyčka může být použita dvěma způsoby: 1) Kompletní plnění. Při plnění smyčky vzorkem dochází k částečnému míchání se solventem ve smyčce. Pokud má být obsah smyčky dokonale nahrazen vzorkem je nutné smyčku přeplnit, nadávkovat asi 5x více vzorku než odpovídá objemu smyčky (tj. 100 µl vzorku do 2

Při plnění smyčky vzorkem dochází k částečnému míchání se solventem ve smyčce.

3 20 µl smyčky), pak je zbytek solventu ve smyčce menší než 1% při externí kalibraci (samozřejmě, menší množství stačí pokud se kvantifikace provádí interním standardem). 2) Částečné plnění. Pokud je nutné neztratit ani část vzorku, smyčka by měla být plněna maximálně do poloviny (podle návodu výrobce). Tím způsobem dojde díky parabolickému profilu vzorku ve smyčce jen k velmi malé ztrátě vzorku. Tomu se dá navíc zamezit vytvořením bubliny na začátku dávkovaní vzorku: ponechá se malá bublina na začátku dávkovaného vzorku. V každém případě by měla mobilní fáze dávkovačem při nástřiku proudit opačně než při jeho plnění, viz obrázek. Takto je potlačeno rozmývání píků při přesunu vzorku na kolonu i při částečném plnění smyčky. Smyčky jsou k dispozici v různých objemech většinou od 5 do 2000 µl. Jsou snadno připojitelné k injektoru a zároveň jsou i lehce vyměnitelné. Těsnění v rotoru je obvykle z Vespelu majícího nejlepší mechanické vlastnosti a lze užít v rozsahu ph od 0 do 10. Pokud mobilní fáze má hodnotu ph nad 10 a do 14, je nutné použít Tefzel těsnění. Tefzel není tak dokonale hladký jako Vespel a nemá se používat, pokud to není z důvodu ph nutné. Do dávkovacího cyklu autosampleru bývá zařazen promývací krok. Různé kapaliny (vzorek, mobilní fáze, promývací roztok) mohou být od sebe odděleny vzduchovou bublinou. Automatické dávkovače používají různé techniky dávkování: (a) Nasátí vzorku do smyčky, pull-loop injection (obrázek níže (a)). Vzorek je natažen stříkačkou z mikrozkomavky/vialky do smyčky. Pokud je třeba nastřikovat více vzorků, musí být pohyblivé buď vialky nebo stříkačka. Tato technika je jednoduchá, ale vyžaduje dostatek vzorku, neboť kapilára mezi vialkou a smyčkou je také naplněna vzorkem, který není následně při dávkování aplikován na sorbent. Nasátí kapaliny může být náchylné ke kavitaci, tj. vzniku bublin z důvodu sníženého tlaku, a tak může vést k nesprávnosti dávkování. (b) Vtlačení vzorku do smyčky, push-loop injection (obrázek (b)). Technika podobná manuálnímu nástřiku mikrostříkačkou, protože vzorek je nasát do stříkačky a následně vytlačen do smyčky přes nízkotlaké těsnění. Stříkačka musí být pohyblivá, podobně mohou být pohyblivé i vialky, záleží na konstrukci autosampleru. Toto uspořádání je flexibilní spojené s jen malou ztrátou vzorku a umožňuje nastřikovat různé objemy. (c) Nástřik s integrovanou smyčkou, integral-loop injcetion (obrázek (c)). Kapilární smyčka je přemisťována mezi vialkami a vysokotlakým těsněním šesticestného ventilu. Není ztracena žádná část vzorku a problém přenosu vzorku (viz dále) je téměř vyřešen. Vysokotlaké těsnění může představovat slabinu této techniky. 3

Tím způsobem dojde díky parabolickému profilu vzorku ve smyčce jen k velmi malé ztrátě vzorku.

4 Autosampler nemusí být schopen nastříknout poslední kapku vzorku z vialky, neboť jehla musí do vialky vždy zasahovat tak, aby byla nepatrně nad dnem. Množství vzorku, které zbude ve vialce je možné snížit pomocí vložení insertu (mikrozkumavky) s pružinkou do vialky. Autosampler představuje součást HPLC systému. Je třeba to brát v úvahu pokud je zásadně změněna velikost smyčky, např. z 50 µl na 1 ml. V takovém případě někdy musí následovat úprava profilu gradientu zejména při složitých separacích. Promývacím roztokem je obvykle mobilní fáze, ale bez solí pufru. Musí mít vyborné vlastnosti pokud se jedná o rozpouštěcí schopnost vzorku ulpívajícího na jehle a na kapilárách. Podstatným rysem autosamplerů je přesnost dávkování a přenos vzorku, carryover (přítomnost stop vzorku z předchozího vzorku v chromatogramu). Přesnost by měla být lepší než 0.35 RSD. Carryover by měl být do 0.05%. Tak nízké hodnoty jsou dosažitelné jen u dobře ošetřovaného instrumentu s pravidelnou výměnou těsnění rotoru a jehly; navíc vzorek musí být dobře rozpustný a nesmí mít tendenci adsorbovat se na těsněních nebo na vnitřním povrchu kapilár. Rozpouštědlo použité pro vzorek a objem vzorku Příprava vzorku bývá někdy velký problém, zejména v klinické chemii a chemii životního prostředí. Obecné postupy jsou filtrace (někdy přes speciální membrány zadržující selektivně dané látky), extrakce na pevné fázi na jednorázových kolonkách (také se určitou selektivitou), 4

Je třeba to brát v úvahu pokud je zásadně změněna velikost smyčky, např. z 50 µl na 1 ml. V takovém případě někdy musí následovat úprava profilu gradientu zejména při složitých separacích.

5 srážení bílkovin a odsolování. Speciálním případem je příprava vzorků pro analýzu biopolymerů. Často musí být rozpuštěný vzorek zfiltrován, pro odstranění pevných látek. Pokud je to možné, je vždy nejlépe vzorek rozpustit v mobilní fázi (extrémně nízká rozpustnost v mobilní fázi může vést ke chvostování a ucpání kolony, v tom případě je nutné zvolit odlišný solvent). Počet teoretických pater dosažený na koloně může být větší, pokud je vzorek nastřikován v solventu s menší eluční silou než mobilní fáze, protože dojde k jeho zkoncentrování na začátku kolony. Když je solvent vzorku mnohem silnějším elučním činidlem než mobilní fáze, může dojít k rozmývání vzorku na koloně a deformaci píku. Pokud je vzorek rozpuštěn v roztoku s vyšším obsahem acetonitrilu (to znamená vyšší eluční schopností na RP koloně), je prvním důsledkem rozšíření píku a s dalším nárůstem koncentrace, zvětšující se deformace píku. Množství vzorku, které může být nadávkováno na kolonu je závislé na rozpustnosti vzorku. Objem vzorku by měl být pokud možno malý, aby co nejméně přispíval k rozšiřování píku. Na druhou stranu, někdy může být dobré objem nastřikovaného roztoku zvětšit pro snížení nebezpečí přetížení stacionární fáze. Ovšem je třeba uvažovat horní limit pro tento objem, protože šířka píku na výstupu z kolony je vždy minimálně stejně velká jako na vstupu na kolonu. Takže nastřikovaný objem by měl být menší než míra rozšiřování píku na koloně (měřeno jako eluční objem) k zamezení velkého poklesu počtu teoretických pater. 5

Počet teoretických pater dosažený na koloně může být větší, pokud je vzorek nastřikován v solventu s menší eluční silou než mobilní fáze, protože dojde k jeho zkoncentrování na začátku kolony.

Podobné dokumenty

Problémy u kapalinové chromatografie

Problémy u kapalinové chromatografie Troubleshooting 1 Problémy v HPLC Většinu problémů, které se vyskytují při separaci látek na chromatografické koloně můžeme vyčíst již zpouhého průběhu základní linie,