Klíčivá slova: léčiva, vodní prostředí, sediment, čistírna odpadních vod, kapalinová chromatografie, hmotností detekce Bečanová, J., Prokeš, R., Přibylová, P. Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí (RECETOX) Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Kamenice 126/3, Brno, 62500 www.recetox.muni.cz
OBSAH: 1. ÚVOD...2 2. SLEDOVANÉ EMERGENTNÍ POLUTANTY...3 2.1 VLASTNOSTI CÍLOVÝCH POLUTANTŮ...3 2.1.1 Charakteristika léčiv...3 2.1.2 Klasifikace léčiv...3 2.1.3 Charakteristika produktů osobní péče...4 2.2 ZDROJE PPCP...4 2.3 VÝSKYT A OSUD POLUTANTŮ VE VODNÍM PROSTŘEDÍ...5 2.4 TOXIKOLOGICKÉ VLASTNOSTI PPCP...5 2.5 VYBRANÉ PPCP...6 3. VZORKOVÁNÍ A ANALÝZA POLUTANTŮ V ŘECE DYJE VE MĚSTĚ BŘECLAV...8 3.1 POPIS ODBĚROVÝCH LOKALIT A VZORKOVACÍ PLÁN...8 3.2 PARAMETRY VZORKOVANÝCH MÉDIÍ...9 3.3 LABORATORNÍ ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ... 10 3.3.1 SPE extrakce... 10 3.3.2 Ultrazvuková extrakce... 11 3.4 POSTUP ANALÝZY VZORKŮ... 12 4. VÝSLEDKY... 14 4.1 VZORKY VOD... 14 4.2 VZORKY PLAVENINY... 16 4.3 VZORKY SEDIMENTŮ... 16 5. DISKUSE A ZÁVĚR... 18 6. LITERATURA... 19 7. PŘÍLOHY... 22 7.1 ODBĚROVÝ PROTOKOL... 22 7.2 FOTODOKUMENTACE POSTUPU PŘÍPRAVY VZORKŮ... 23 7.3 VÝSLEDKY... 26
1. ÚVOD Cílem této studie uskutečněné v dubnu 2014 byla realizace klíčových aktivit v projektu Podpora přírodovědného a technického vzdělávání na středních školách v Jihomoravském kraji č. CZ.1.07/1.1.00/44.0006 v rámci Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost. V rámci těchto aktivit byly uskutečněny: - jednorázové kvalifikované odběry sedimentů a vod z řeky Dyje - analytická stanovení vybraných emergentních polutantů ve vodách metodou kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí - vyhodnocení a interpretace výsledků 2
2. SLEDOVANÉ EMERGENTNÍ POLUTANTY Tato studie byla zaměřena na stanovení koncentrací emergentních polutantů ve vzorcích vod a sedimentů. Mezi sledované látky patřila léčiva a přípravky osobní péče, což je relativně nová skupina látek, která je aktuálně monitorována ve vodním prostředí. Důvodem je především jejich narůstající spotřeba a trvalejší výskyt v prostředí díky nízké biodegradabilitě. Dalšími 2.1 Vlastnosti cílových polutantů 2.1.1 Charakteristika léčiv Obecně jsou léčiva v humánní a veterinární oblasti nezbytná a důvody, proč se používají, jsou tři - preventivní, terapeutické a diagnostické. Jsou to jakékoliv látky nebo směsi využívané k odstranění nemoci a léčbě jejich příznaků či bolesti, pro ovlivnění funkcí organismu, určení diagnózy a předcházení vzniku nemoci. Problematika léčiv je v České republice ošetřena legislativně, Zákon o léčivech č. 378/2007 Sb. Léčivé látky jsou látky nebo směsi látek nerostného, rostlinného, živočišného a syntetického původu. Většina běžně používaných léčiv má syntetický původ. Farmakologickou úpravou léčivých látek vznikají léčivé přípravky (vakcíny, séra, extrakty). Jako léky se označují léčivé látky a přípravky upravené k použití a vydávané pacientům. 2.1.2 Klasifikace léčiv Klasifikaci léčiv pak lze provádět dle nejrůznějších hledisek, nejčastěji se dělení provádí podle anatomicko - terapeuticko - chemické klasifikace (tzv. ATC kód). Pro určení do které skupiny bude léčivo patřit je potřeba určit jeho mechanismus účinku. Analgetika Podávání analgetik v malých dávkách vede k potlačení nebo alespoň snížení vnímání bolesti. Podle síly účinku se dělí na dvě podskupiny, opioidní analgetika (silný účinek) a analgetikaantipyretika (slabší) snižující také zvýšenou tělesnou teplotu a mající protizánětlivé účinky. Mezi opioidní analgetika se řadí například morfin, kodein a tilidin. Antipyretika jsou kyselina acetylsalicylová (aspirin), paracetamol, ibuprofen, ketoprofen nebo naproxen. Antibiotika Jedná se o mimořádně významnou a široce využívanou skupinu léčiv sloužící k léčbě a prevenci infekčních chorob. Jsou to látky, které zastavují růst bakterií nebo jiných mikroorganismů. Dle mechanismu působení na cílové bakterie se tyto látky dělí do dvou skupin: baktericidní (usmrcující bakterie) a bakteriostatické (inhibují růst). Zástupcem baktericidních antibiotik je penicilin a vankomycin, bakteriostatických tetracyklin (ten můžeme též zařadit do skupiny širokospektrálních antibiotik), erythromycin a sulfamethoxazol. Znalost mechanismu účinku pak napomáhá při výběru kombinací antibiotik. 3
Beta-blokátory Slouží k léčbě kardiovaskulárních chorob, jako je ischemická choroba srdeční nebo chronické selhání srdce, protože snižují srdeční frekvenci, periferní cévní odpor a kontraktilitu myokardu. Používají se též při léčbě hypertenze. Zástupcem této skupiny látek je např. atenolol. Diuretika Jsou látky, které způsobují zvýšení vylučování vody a elektrolytů v moči. Tento močopudný účinek má dopad při léčbě nemocí spojených s hromaděním tekutin v organismu. Patří sem např. selhávání srdce, cirhóza jater, vysoký tlak a podkožní otoky. Zástupce této skupiny je hydrochlorothiazid. Mezi speciální skupiny léčiv patří antihistaminika, která pomáhají překonávat příznaky vyvolané histaminem uvolněným při alergických reakcích a nadměrné žaludeční sekreci. Dále pak antikoagulancia, která ovlivňují srážlivost krve a působí jako prevence vzniku krevních sraženin. Ke zmírnění příznaků epilepsie se pak využívají antiepileptika, mezi které patří hojně využívaný karbamazepin (tzn. antiepileptikum 2. generace). Aktuálně hojně využívanou skupinou farmak jsou hypolipidemika, což jsou látky snižující koncentraci cholesterolu, nebo triglyceridů v organismu. Mezi tyto látky patří i deriváty kyseliny klofibrové. 2.1.3 Charakteristika produktů osobní péče Produkty osobní péče bývají velmi často součástí velké skupiny látek společně s farmaky, souhrnně nazývané zkratkou PPCP, Pharmaceuticals and personal care products. Jedná se o látky a přípravky, které jsou součástí každodenního života člověka. Takové látky mohou být součástí kosmetických a opalovacích přípravků, repelentů, vůní, či různých doplňků stravy a vitamínů. Patří sem UV filtry, které obsahují sloučeniny schopné pohlcovat UV záření. Bývají součástí krémů na opalování, či krémů ošetřujících pokožku. Dále to jsou repelenty proti hmyzu, kde nejčastěji zastoupenou je DEET. Velkou skupinou jsou syntetické vůně, které obsahují širokou škálu látek, jako polycyklické, makrocyklické a aromatické sloučeniny s nitro skupinou. Poslední skupinou jsou antimikrobiální produkty osobní péče, kde jsou hlavními zástupci triclosan a triclocarban. Tyto látky se nacházející v mýdlech, zubních pastách, deodorantech a krémech ošetřujících pokožku. 2.2 Zdroje PPCP Léčiva se do vodního prostředí obecně dostávají prostřednictvím bodových nebo difúzních zdrojů znečištění. Bodové znečištění pochází z jednoho určitého místa a je snadno identifikovatelné. Mezi nejdůležitější bodové zdroje znečištění patří skládky komunálního odpadu, odpadní vody z průmyslu, zemědělství, nemocnic a domácností a čistírny odpadních vod (ČOV). Ve srovnání s bodovými zdroji jsou zdroje difúzního znečištění nesnadno 4
identifikovatelné, avšak zatížení vodního prostředí je menší. Příkladem difúzního zdroje je aplikace kalů z ČOV na zemědělskou půdu. V případě produktů osobní péče je největším rizikem jejich nadužívání, což je způsobeno tím, že dlouhou dobu nebyly považovány za potenciálně nebezpečné. Do prostředí se mohou dostat přímo z rekreačních vod v případě UV filtrů a repelentů, nebo těkáním do ovzduší v případě syntetických vůní. Stejně jako u léčiv mohou být jejich zdrojem odpadní vody a to jak z čistíren odpadních vod, tak především ty volně vypouštěné do vodního prostředí. To platí především pro antibikrobiální produkty, které jsou hojně využívány v domácnostech, firmách i veřejných institucích (nemocnice, školy). 2.3 Výskyt a osud polutantů ve vodním prostředí Přítomnost léčiv a přípravků osobní péče ve vodním prostředí byla potvrzena v řadě studií. Např. léčiva acetaminofen, ciprofloxacin, diklofenak, ibuprofen, karbamazepin, ketoprofen, kofein, naproxen, a sulfamethoxazol byla naměřena v povrchových vodách i v ČOV v nejen v Evropě, ale především v USA a v asijských zemích. Osud těchto látek v prostředí závisí na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech, zejména rozpustnosti ve vodě a rozdělovacímu koeficientu oktanol voda (log Kow). Ten určuje, na kolik budou mít léčiva tendenci setrvávat ve vodním prostředí a na kolik budou sorbována na sediment. Platí, že léčiva s vyšší molekulovou hmotností a log Kow > 5 se snadněji sorbují na sedimenty, zatímco léčiva s log Kow < 2,5 zůstávají ve vodě. Léčiva a přípravky osobní péče mohou ve vodním prostředí podléhat biotransformaci, fotolýze, sorpci, těkání či disperzi, což ovlivňuje jejich výslednou koncentraci ve vodním prostředí. Na druhou stranu, některá léčiva, jako například acetaminophen, atenolol, ibuprofen a karbamazepin, jsou odolná vůči mikrobiální degradaci, a proto ve vodě setrvávají po delší dobu. O tom, že znečištění vod léčivými látkami představuje závažný problém, svědčí i ustanovení pro farmaka článku 8c Směrnice 2013/39/EU. Podle tohoto článku má Evropská komise do roku 2015 vypracovat strategický přístup ke znečištění vody způsobeného léčivými látkami. Tento strategický přístup má zahrnovat návrhy, jako v rámci postupu uvedení léků na trh v potřebném rozsahu účinnější zohlednit jejich environmentální důsledky. Komise má následně do roku 2017 navrhnout opatření, které se v případě potřeby vykonají na úrovni Unie nebo členských států, aby se řešily možné environmentální důsledky léčivých látek, s cílem snížit vypouštění, emise a úniky těchto látek do vodného prostředí. 2.4 Toxikologické vlastnosti PPCP Ačkoliv nově vyvinuté PPCP podléhají při schválení a uvedení na trh řadě legislativních požadavků, farmakologických a klinických testů nevyjímaje, ekotoxikologické účinky je velmi těžké předvídat. Bylo prokázáno, že i při stopových množstvích mohou mít nepříznivé účinky na prostředí. Toxické účinky PPCP spočívají v jejich schopnosti transformace, a protože jsou do prostředí zaváděny kontinuálně, jsou jim organismy vystaveny po dlouhý 5
čas, někdy i po celý život. Vzhledem k různorodým chemickým vlastnostem a terapeutickým účinkům PPCP mohou být dopady na vodní organismy různé a je potřeba jim věnovat zvýšenou pozornost. 2.5 Vybrané PPCP Jedním z hlavních kritérií pro výběr cílových léčiv byla spotřeba farmak v České republice, mezi nejprodávanější léčiva podle SÚKL patří paracetamol, ibuprofen a omeprazol. Dalším kritériem výběru cílových látek je, že se jedná o potenciálně nebezpečné látky vyskytující se ve vodním prostředí. Zvolaná cílová PPCP i s fyzikálně chemickými vlastnostmi jsou uvedena v tabulce 1. Jejich strukturní vzorce jsou uvedeny na obr.. Tab. 1: Fyzikálně chemické vlastnosti vybraných léčiv a přípravků osobní péče. Léčivá látka Farmakologická skupina CAS Mr [g/mol] log K Rozpustnost ve vodě [mg/l] atenolol beta blokátor 29122-68-7 266,3 16 13300 acetaminophen (paracetamol) analgetikum, antipyretikum 103-90-2 151,1 46 14000 ciprofloxacin antibiotikum 85721-33-1 331,3 28 30000 DEET (N,Ndiethyl- m- toluenamid) repelent proti hmyzu 134-62-3 191,2 202 1000 diklofenak analgetikum, antipyretikum 15307-86-5 296,1 451 2.37 hydrochlorothiazid diuretikum 58-93-5 297,7-722 ibuprofen analgetikum, antipyretikum 15687-27-1 206,3 397 21 karbamazepin antiepileptikum 298-46-4 236,3 245 18 ketoprofen kofein analgetikum, antipyretikum stimulant centrálního nervového systému 22071-15-4 254,3 312 51 58-08-2 194,2-7 21600 kyselina klofibrová lipidemikum 882-09-7 214,6 290 - naproxen analgetikum, antipyretikum 22204-53-1 230,2 318 16 6
sulfamethoxazol antibiotikum 723-46-6 253,3 89 610 triclocarban antiseptikum 101-20-2 315,6 490 0.0024 triclosan antiseptikum 3380-34-5 289,5 476 10 Obr. 1: Strukturní vzorce vybraných léčiv a přípravků osobní péče. 7
3. VZORKOVÁNÍ A ANALÝZA POLUTANTŮ V ŘECE DYJE VE MĚSTĚ BŘECLAV Cílem studie bylo provést odběry vody a sedimentu z řeky Dyje 5 lokalitách ve městě Břeclav a jeho nejbližším okolí a analyticky stanovit obsahy emergentních polutantů ve vodním prostředí. 3.1 Popis odběrových lokalit a vzorkovací plán Odběry byly jednorázově provedeny v dubnu 2014. Odebrán byl 2 litry vody do tmavých skleněných zábrusových lahví na pěti odběrových lokalitách a cca 1,5kg sedimentů ze tří lokalit. Fotografie jednotlivých lokalit jsou na obrázku 2 a-f. A B C D 8
E F Obr. 2 Fotografie odběrových lokalit: A) čistírna odpadních vod; B) nad městem (NM); C) nad čistírnou odpadních vod (NV); D) pod čistírnou odpadních vod (PV); E) nad soutokem (NS) a F) pod soutokem (SD). Lokality byly zvoleny tak, aby pokryly úroveň znečištění v řece Dyji nad městem Břeclav, nad a pod čistírnou odpadních vod a pod soutokem Dyje a Staré Dyje. Umístění lokalit na mapě je vyznačeno na obrázku 3. Obr. 3: Mapa odběrových lokalit. 3.2 Parametry vzorkovaných médií Při odběrech vody byly stanoveny hodnoty ph, teploty, vodivosti a obsah rozpuštěného kyslíku. Tyto parametry jsou standardně stanovovány u odběrů povrchových vod a slouží při vyhodnocení naměřených výsledků. Tyto parametry, včetně GPS souřadnice a času odběru 9
byly zaznamenány do odběrových protokolů, jejichž ukázka je uvedena v příloze zprávy. Hodnoty fyzikálně-chemických parametrů z jednotlivých lokalit jsou uvedeny v tabulce 2. Tab. 2: Fyzikálně chemické vlastnosti vybraných léčiv a přípravků osobní péče. Název/označení lokality Teplota vody ( C) ph vodivost (µs/cm) rozpuštěný O 2 (mg/l) nad městem / NM 16,3 8,3 682 6,32 nad ČOV / NV 17,6 7,9 762 5,73 pod ČOV / PV 16,5 8,2 683 6,17 nad soutokem / NS 18,3 7,8 705 6,30 pod soutokem / SD 16,7 8,2 688 6,16 3.3 Laboratorní zpracování vzorků Po odběru byly vzorky vod a sedimentů označeny a uloženy v mrazicím boxu (-18 C) až do jejich vlastního zpracování. Vzorky sedimentů byly zpracovávány ultrazvukovou extrakcí. Vzorky vod byly po rozmrazení filtrovány přes filtry ze skleněných vláken o průměru ok 0,45 µm. Poté byla zvlášť zpracována plavenina (filtr) a voda (filtrát). 3.3.1 SPE extrakce Vzorky vody byly po filtraci okyseleny na ph 2 až 3 přídavkem kyseliny mravenčí (viz tabulka 3). K zakoncentrování léčiv a přípravků osobní péče bylo využito extrakce na pevnou fázi (solid phase extraction SPE) na kolonkách Oasis HLB (s obsahem 60 mg adsorbentu). Kolonky umístěné na vakuovém zařízení pro SPE (viz obrázek 4) byly nedříve kondicionovány methanolem, vodou a na závěr okyselenou vodou o ph 2-3. Po kondicionaci byl na SPE kolonku dávkován 1 litr vzorku filtrátu o přesném objemu (viz tabulka 3), čímž došlo k zakoncentrování analytů. Po nadávkování celého objemu vzorku byly kolonky propláchnuty cca 10 ml okyselené vody a byly 10 minut sušeny pod mírným vakuem. Poté byly vzorky gravitačně eluovány methanolem a směsí acetonu v methanolu v poměru 1:1. Objem každého z elučních činidel byl 2 ml. Eluáty byly odpařeny do poslední kapky proudem dusíku. Před vlastní analýzou byly odparky ředěny methanolem na objem 500 µl. Pro určení kontaminace postupu přípravy vzorků byly paralelně se vzorky zpracovávány přístrojové a laboratorní blanky. Pro určení výtěžností byly vzorky obohacovány značenými vnitřními standardy (IS). Fotografická dokumentace postupu zpracování vzorku je v příloze zprávy. 10
Obr. 4: Zařízení pro zakoncentrování polutantů z vod na pevnou fázi (solid phase extraction - SPE). 3.3.2 Ultrazvuková extrakce Filtráty a vzorky sedimentů byly zpracovány ultrazvukovou extrakcí. Sedimenty byly před vlastním zpracováním vysušeny do konstantní hmotnosti za laboratorní teploty. Fotografie jednotlivých vzorků sedimentů po jejich vysušení jsou znázorněny na obrázku 5. Známé množství sedimentu o hmotnosti cca 2g bylo naváženo do centrifugační zkumavky, do které bylo přidáno 10 ml methanolu. Přesné hmotnosti navážek jsou uvedeny v tabulce 3. Tab. 4: Navážky vzorků sedimentů, hodnoty ph a objemy vod upravené před extrakcí: označení vzorku navážka (g) ph objem (ml) nad městem / NM 2,25 2,42 1120 nad ČOV / NV - 2,47 1040 pod ČOV / PV - 2,54 1060 nad soutokem / NS 2,11 2,48 1080 pod soutokem / SD 2,23 2,55 1100 Vzorek byl ultrazvukován 10 min, centrifugován a byl odebrán supernatant. Postup byl proveden 3x. Všechny tři roztoky byly spojeny, odfoukány pod proudem dusíku do poslední kapky a převedeny do 500 µl methanolu. Stejným postupem byly zpracovány vzorky filtrátu. V tomto případě byl do centrifugační zkumavky vložen celý filtrační papír i se zachycenou pevnou fází. Postup je zachycen na fotografiích, které jsou součástí přílohy zprávy. 11
A B C Obr. 5: Vysušené sedimenty z řeky Dyje před vlastním zpracováním ultrazvukovou extrakcí: A) lokalita nad soutokem (NS), B) lokalita soutok Dyje (SD) a C) lokalita nad městem (NM). 3.4 Postup analýzy vzorků Separace a analýza vybraných léčiv a produktů osobní péče byla provedena s použitím ultra účinné kapalinové chromatografie (UPLC) ve spojení s hmotností detekcí (MS-MS) optimalizovaná dle metody Americké agentury pro životní prostředí (US EPA) č. 1694. Analyzované látky byly děleny do dvou skupin, k analýze obou skupin látek byl použit kapalinový chromatograf Acquity UPLC (Waters, USA). Pro skupinu A (viz. tabulka 5a) byl vybavený vysoce účinnou kolonou Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm; 2,1 x 100 mm (Waters, USA). Jako mobilní fáze byla použita voda a metanolem, oboje s přídavkem 0,01% kyseliny mravenčí a 0,1M octanu amonného. Pro separaci látek byla použita gradientová eluce s 90% vodné složky na počátku separace. Vzorky měřené touto metodou byly před vlastní analýzou ředěny redestilovanou vodou tak, aby obsahovaly 90% vodné složky. Pro separaci léčiv ve skupině B (viz tabulka 5b) byla jako stacionární fáze použita kolona Xterra C18 3,5 µm 2,1 x 100 mm (Waters, USA). Jako organická složka mobilní fáze byla použita směs methanolu a acetonitrilu v poměru 1:1. Vodnou fázi tvořila voda s přídavkem 0,1% kyseliny octové a 0,1% octanu amonného. Mobilní fáze pro separaci léčiv ze skupiny B obsahovala na počátku 60% vodné složky. Vzorky měřené touto metodou byly před vlastní analýzou ředěny tak, aby obsahovali 50% vodné složky. K detekci cílových analytů je využit hmotnostní detektor na bázi trojitého kvadrupólu Xevo TQ S (Waters, USA) vybavený iontovým zdrojem s elektrosprejem (ESI) operujícím v positivním (skupina léčiv A) i negativním (skupina léčiv B) módu. Kapilární napětí v iontovém zdroji při detekci látek skupiny A i B je nastaveno na hodnotu 2,5 kv/-2,5 kv. Desolvatační teplota je během ionizace stabilní na hodnotě 350 C a průtok desolvatačního plynu (dusíku) je 700 l/hod. Pro kvalitativní určení analyzovaných léčiv a přípravků osobní péče byly optimalizovány a vyhodnoceny 2 multiple reaction monitoring (MRM) přechody. Pro kvantitativní analýzu byly změřeny kalibrační závislosti v rozsahu 0.005-100 pg/μl. Z nich byly vypočítány instrumentální detekční limity metody pro každé léčivo (IDL). Dále byly z metody přípravy vzorků a změřených laboratorních blanků vypočítání limity kvantifikace metody SPE-LC-MS/MS (MQL). Tyto parametry spolu s parametry kalibračních závislostí jsou uvedeny v tabulkách 5a a 5b. 12
Tab. 5a: Parametry kalibračních závislostí a vypočítané limity detekce pro PPCP ve skupině A: Název PPCP IDL (pg/ul) rovnice kalibrační závislosti korelační koeficient (R2) MQL (ng/l) acetaminophen 0,01 6490,47x + 1675,51 0,9976 0,5 DEET 0,03 3035,3x + 5144,16 0,9993 3,0 kofein 0,1 2021,36x + 15011,6 0,9948 7,2 karbamazepin 0,006 38855,7x + 2534,8 0,9992 0,01 sulfamethoxazol 0,04 5293,5x + 244,6 0,9995 0,5 atenolol 0,04 3052,25x + 441,53 0,9990 0,06 diklofenak 0,08 668,26x + 373,73 0,9995 0,7 ciprofloxacin 0,2 838,29x + 1382,3 0,9973 15,1 Tab. 5b: Parametry kalibračních závislostí a vypočítané limity detekce pro PPCP ve skupině B: Název PPCP IDL (pg/ul) rovnice kalibrační závislosti korelační koeficient (R2) MQL (ng/l) ibuprofen 1,0 56,348x + 9,032 0,9998 2,5 ketoprofen 0,8 38,219x + 87,921 0,9999 10,6 naproxen 0,06 405,55x + 21,079 0,9998 0,4 triklokarban 0,004 32956,2x + 9771,6 0,9999 0,007 kyselina klofibrová 0,05 690,38x + +31,39 0,9998 0,3 hydrochlorothiazid 0,2 8,682x + 0,282 0,9952 0,5 triklosan 0,05 0,146x + 0,011 0,9961 1,1 13
4. VÝSLEDKY 4.1 Vzorky vod Odebrané vzorky vod ze šesti lokalit (NM, NV, PV, NS a SD) na řece Dyji byly zpracovány a změřeny dle výše uvedeného postupu. Výsledky byly vyhodnoceny softwarem MassLynx a zpracovány do tabulek, které jsou v příloze zprávy. U vzorků byly vypočítány výtěžnosti extrakčních postupů, které se pohybovali v rozmezí 85-102 %. Koncentrace léčiv a přípravků osobní péče ve vodách byly přepočítány na objem extrahované vody, jsou vyjádřeny na 1 litr a zobrazeny v grafu 1. Jak je z grafu vidět, koncentrace některých látek (ciprofloxacin, ketoprofen a kyselina klofibrová) byly na všech lokalitách pod limitem detekce. Ostatní látky byly detekovány buď jen na některých lokalitách (atenolol, acetaminophen), nebo ve všech vzorcích (např. karbamazepine, kofein). Graf 1: Koncentrace léčiv (ng/l) ve vzorcích vod z řeky Dyje na lokalitách nad městem (NM), nad ČOV (NV), pod ČOV (PV), nad soutokem (NS) a soutok s řekou Stará Dyje (SD) Z grafu 1 je vidět, že u některých látek je konstantní koncentrace po celém toku Dyje (např. DEET, karbamazepin, nebo sulfomethoxazol), ale pro většinu analytů je nejvyšší koncentrace v okolí čistírny odpadních vod (odběrové lokality NV a PV). Obecně lze říct, že se naměřené koncentrace pohybují maximálně v desítkách nanogramů na litry vody. Tyto koncentrace lze považovat za nižší, především v porovnání s koncentracemi 14
ve vodách řek ve velkých městech, popř. na výtocích z velkých čistíren odpadních vod. Např. karbamazepin, diklofenac a naproxen se v České republice na přítoku na čistírnu odpadních vod pohybují až v jednotkách mikrogramů na litry. Na výstupu to pak mohou být i stovky nanogramů v litru. Nejvyšší naměřenou koncentraci ve všech vzorcích měl kofein, který patří mezi nejpoužívanější aditiva do léků proti bolesti a zároveň se vyskytuje i v jiných, než léčebných aplikací. Další léčiva, která byla ve vzorcích ve vyšších koncentracích, jsou to ibuprofen, karbamazepin a naproxen. Tyto látky jsou častou součástí léků proti bolesti (ibuprofen a naproxen), nebo se používají při léčba nervových poruch. Jejich vyšší koncentrace mohou být způsobeny tím, že jsou persistentní (karbamazepin), nebo se sice částečně rozkládají, ale jejich přísun do životního prostředí je kontinuální, proto se řadí do skupiny pseudopersistentních látek. Látkou, která se vyskytovala na všech lokalitách v poměrně vysokých koncentracích (5ng/l) je DEET (N,N-diethyl- m-toluenamid), což je látka, která se přidává do přípravků osobní péče s repelentním účinkem. Tato sloučenina je poměrně persistentní a její vyšší koncentrace bude pravděpodobně způsobena vyšším používáním těchto přípravků ve vzorkované lokalitě. Nicméně stanovená koncentrace, je nízká, oproti maximálním koncentracím této látky, které byly naměřeny ve světě (3 µg/l). Graf 2: Porovnání kontaminace vzorků vod léčivy na jednotlivých lokalitách 15
Při porovnání vzorkovaných lokalit (graf 2) je vidět, že se celková koncentrace stanovovaných léčiv po toku Dyje ve městě Břeclavi mění. Na první vzorkované lokalitě (NM, nad městem) je koncentrace nejnižší. Na další lokalitě (nad výtokem z čistírny odpadních vod, NV) je koncentrace oproti první lokality vyšší, což může být způsobeno buď přítokem nečištěných odpadních vod z města do řeky, nebo výtokem z čistírny a promícháním vod z řeky i proti jejímu proudu. Nejvyšší naměřená koncentrace je na další vzorkované lokalitě (pod výtokem z čistírny odpadních vod, PV), kde byl zaznamenán znatelný nárůst celkové koncentrace PPCP. To ukazuje, že pro většinu látek, je jejich zdrojem do vodního prostředí čistírna odpadních vod. Na dalších dvou vzorkových lokalitách (nad soutokem, NS a soutok Dyje, SD) je koncentrace oproti předchozí lokalitě nižší, což je pravděpodobně způsobeno naředěním přítomných látek v toku řeky a jejich částečnou degradací. U těchto dvou lokalit je celková koncentrace léčiv přibližně stejná, ale je zřejmý mírně jiný poměr přítomných látek. To může být způsobeno tím, že pro některé látky jsou i jiné zdroje, lokalizované na řece Stará Dyje. 4.2 Vzorky plaveniny Po analýze plaveniny (filtru) ze vzorkovaných lokalit byly koncentrace všech látek pod limitem detekce. To je způsobeno především tím, že stanovované látky mají nižší rozdělovací koeficient oktanol voda (Kow). To znamená, že ve vodním prostředí mají vyšší afinitu k vodě, kde byly stanoveny ve větší míře. 4.3 Vzorky sedimentů Odebrané vzorky sedimentů ze tří lokalit (NM, NS, SD) na řece Dyji byly zpracovány a změřeny dle uvedeného postupu. Výsledky byly vyhodnoceny softwarem MassLynx a zpracovány do tabulek, které jsou přílohou zprávy. Výsledky jsou zobrazeny v grafu 3. Z grafu je vidět, že se ve vzorcích vyskytovaly čtyři z měřených látek a maximálně ve stovkách nanogramů na kilogram sedimentu. To je způsobeno tím, že stanovované látky mají vyšší afinitu k vodě (nižší rozdělovací koeficient Kow) a v sedimentech se kumulují pouze výjimečně. Naměřené hodnoty jsou v porovnání se sedimenty z řek v okolí velkých měst a aglomerací nízké. V těchto vzorcích byla některá léčiva a přípravky osobní péče naměřena v koncentracích desítek až stovek mikrogramů na kilogram sedimentů. 16
Graf 3: Koncentrace léčiv (ng/kg) ve vzorcích sedimentů z řeky Dyje na lokalitách nad městem (NM), nad soutokem (NS) a soutok s řekou Stará Dyje (SD) Z naměřených látek se v nejvyšší koncentraci opět vyskytuje kofein, což poukazuje na jeho vyšší výskyt ve vodách, který je pravděpodobně dlouhodobý. U této látky je také vidět, že ve vzorcích sedimentů odebraných na lokalitách za městem jsou až dvojnásobně vyšší koncentrace oproti vzorku sedimentů nad městem. Z toho lze usuzovat, že odpadní vody z města jsou zdrojem kofeinu v sedimentech. To potvrzují i výsledky měření kofeinu ve vzorcích vod. 17
5. DISKUSE A ZÁVĚR V rámci spolupráce na realizaci projektu Podpora přírodovědného a technického vzdělávání na středních školách v Jihomoravském kraji č. CZ.1.07/1.1.00/44.0006 v rámci Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost bylo uskutečněno vzorkování řeky Dyje v dubnu 2014 ve městě Břeclav. Studenti Gymnázia a Jazykové školy Břeclav se toho vzorkování zúčastnili a byli seznámeni s technikami odběru bodových vzorků vod a sedimentů. Celkem bylo odebráno šest vzorků vod a tři vzorky sedimentů pokrývající lokality nad městem Břeclav, v okolí čistírny odpadních vod a pod vlastní městskou aglomerací. Tyto vzorky byly zpracovány v laboratořích Centra pro výzkum toxických látek v životním prostředí (RECETOX) a byly v nich analyzovány vybrané přípravky osobní péče a léčiva. Výsledky analýz jsou uvedeny v této zprávě a studentům Gymnázia a Jazykové školy Břeclav budou presentovány v prostorách centra RECETOX spolu s ukázkami technik použitých při přípravě vzorků a vlastních analýzách. Z výsledků vyplývá, že cílové látky se v monitorované lokalitě vyskytují ve vodách i sedimentech v nízkých koncentracích, což může být způsobeno především tím, že je zde nižší počet obyvatel a tím i menší objem zdrojů těchto látek. Z měřených látek se v nejvyšších koncentracích vyskytoval kofein a to jak ve vodách, tak i sedimentech. Tato látka se ovšem nepoužívá pouze jako léčebný přípravek, proto jsou zdroje tohoto analytu i jiné, než v případě ostatních léčiv. Z naměřených dat je zřejmé, že město a především výpusť z čistírny odpadních vod přispívá ke zvýšení koncentrace měřených látek, ale dále po toku jsou již koncentrace PPCP opět nižší. To je diskutováno výše a je to pravděpodobně způsobeno jak zředěním těchto látek v toku řeky, tak i degradací těchto látek ve vodním prostředí. Obecně lze říct, že neměřené koncentrace cílových látek v řece Dyji jsou v koncentracích, které odpovídají jiným malým městům v České republice a nepředstavují pro danou lokalitu významné riziko. 18
6. LITERATURA Al Aukidy, M., et al., Monitoring release of pharmaceutical compounds: Occurrence and environmental risk assessment of two WWTP effluents and their receiving bodies in the Po Valley, Italy. Science of The Total Environment, 2012. 438(0): p. 15-25. Buchberger, W.W., Current approaches to trace analysis of pharmaceuticals and personal care products in the environment. Journal of Chromatography A, 2011. 1218(4): p. 603-618. Bueno, M.J.M., et al., Occurrence and persistence of organic emerging contaminants and priority pollutants in five sewage treatment plants of Spain: Two years pilot survey monitoring. Environmental Pollution, 2012. 164(0): p. 267-273. Calderón-Preciado, D., V. Matamoros, and J.M. Bayona, Occurrence and potential crop uptake of emerging contaminants and related compounds in an agricultural irrigation network. Science of The Total Environment, 2011. 412 413(0): p. 14-19. Corporation, W. Pharmaceuticals and personal care products in water, soil, sediment and biosolids by HPLC-MS/MS, EPA method 1694. 2008. Costanzo, S.D., Watkinson, A.J., Murby, E.J., Kolpin, D.W., Sandstrom, M.W., Is there a risk associated with the insect repellant DEET (N,N-diethyl-mtoluamide) commonly found in aquatic environments? Sci. Total Environ., 2007. 384: p. 214-220. Daughton, C.G., Ternes, T. A., Pharmaceuticals and personal care products in the environment: agents of subtle change? Environ. Health Perspect, 1999. 107: p. 907-939. Díaz-Cruz, M.S. and D. Barceló, Trace organic chemicals contamination in ground water recharge. Chemosphere, 2008. 72(3): p. 333-342. Drugbank. Dostupné na: http://www.drugbank.ca/ Eggen, T., M. Moeder, and A. Arukwe, Municipal landfill leachates: A significant source for new and emerging pollutants. Science of The Total Environment, 2010. 408(21): p. 5147-5157. EPA. Method 1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water, Soil, Sediment, and Biosolids by HPLC/MS/MS. Dostupné na: http://water.epa.gov/ scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/2008_01_03_methods_method_1694.pdf EPA/PPCP. Dostupné na : http://www.epa.gov/ppcp/ Ferrer, I., J.A. Zweigenbaum, and E.M. Thurman, Analysis of 70 Environmental Protection Agency priority pharmaceuticals in water by EPA Method 1694. Journal of Chromatography A, 2010. 1217(36): p. 5674-5686. Gurr, C.J., Reinhard, M., Harnessing natural attenuation of pharmaceuticals and hormones in rivers. Environ. Sci. Technol, 2006. 40: p. 2872-2876. Heberer, T., Tracking persistent pharmaceutical residues from municipal sewage to drinking water. Journal of Hydrology, 2002. 266(3 4): p. 175-189. 19
Huerta-Fontela, M., M.T. Galceran, and F. Ventura, Fast liquid chromatography quadrupolelinear ion trap mass spectrometry for the analysis of pharmaceuticals and hormones in water resources. Journal of Chromatography A, 2010. 1217(25): p. 4212-4222. Kingston G.A. Mills, G.M. Morrison, B.L. Persson, Development of novel passive sampling system for time averaged measurement of a range of organic pollutants in aquatic environment. J. Environ. Monit., 2000. 2: p. 487. Kümmerer, K., Pharmaceuticals in the Environment: Sources, Fate, Effects and Risk. 2008; Springer. Lapworth, D.J., et al., Emerging organic contaminants in groundwater: A review of sources, fate and occurrence. Environmental Pollution, 2012. 163(0): p. 287-303. Lavén, M., et al., Serial mixed-mode cation- and anion-exchange solid-phase extraction for separation of basic, neutral and acidic pharmaceuticals in wastewater and analysis by highperformance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2009. 1216(1): p. 49-62. Li, H.-s., et al., Advanced treatment of landfill leachate by a new combination process in a full-scale plant. Journal of Hazardous Materials, 2009. 172(1): p. 408-415. 80 López-Serna, R., M. Petrović, and D. Barceló, Occurrence and distribution of multi-class pharmaceuticals and their active metabolites and transformation products in the Ebro River basin (NE Spain). Science of The Total Environment, 2012. 440(0): p. 280-289. Maldaner, L. and I.C.S.F. Jardim, Determination of some organic contaminants in water samples by solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry. Talanta, 2012. 100(0): p. 38-44. Martin, J., et al., Occurrence of pharmaceutical compounds in wastewater and sludge from wastewater treatment plants: Removal and ecotoxicological impact of wastewater discharges and sludge disposal. Journal of Hazardous Materials, 2012. 239 240(0): p. 40-47. McAvoy, D.C., Schatowitz, B., Jacob, M., Hauk, A., Eckhoff, W.S., Measurement of triclosan in wastewater treatment systems. Environ. Toxicol. Chem., 2002. 21: p. 1323-1329. Mills, G.A., et al., Trends in monitoring pharmaceuticals and personal-care products in the aquatic environment by use of passive sampling devices. Analytical and bioanalytical chemistry, 2007. 387(4): p. 1153-1157. Mompelat, S., B. Le Bot, and O. Thomas, Occurrence and fate of pharmaceutical products and by-products, from resource to drinking water. Environment International, 2009. 35(5): p. 803-814. Murray, K.E., S.M. Thomas, and A.A. Bodour, Prioritizing research for trace pollutants and emerging contaminants in the freshwater environment. Environmental Pollution, 2010. 158(12): p. 3462-3471. NORMAN network. Dostupné na: http://www.norman-network.net/?q=node/19 20
de Oliveira, A.R.M., F.J.M. de Santana, and P.S. Bonato, Stereoselective determination of the major ibuprofen metabolites in human urine by off-line coupling solid-phase microextraction and high-performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta, 2005. 538(1 2): p. 25-34. Pal, A., et al., Impacts of emerging organic contaminants on freshwater resources: Review of recent occurrences, sources, fate and effects. Science of The Total Environment, 2010. 408(24): p. 6062-6069. Petrović D., B., M.,, Comprehensive analytical chemistry, Analysis, Fate and Removal of pharmaceuticals in the water cycle. Vol. 50. 2007: Elsevier. Pubchem. Dostupné na: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ Seethapathy, S., T. Górecki, and X. Li, Passive sampling in environmental analysis. Journal of Chromatography A, 2008. 1184(1 2): p. 234-253. Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2000/60/ES. Dostupné na: http://eurlex.europa.eu/legal-content/cs/txt/?uri=celex:32000l0060 Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2008/105/ES. Dostupné na: http://eurlex.europa.eu/lexuriserv/lexuriserv.do?uri=oj:l:2008:348:0084:0097:cs:pdf Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2013/39/EU. Dostupné na: http://faolex.fao.org/docs/pdf/eur36180.pdf Snyder, S.A., Occurrence, treatment, and toxicological relevance of EDCs and pharmaceuticals in water. Ozone Sci. Eng., 2008. 30: p. 65-69. SUKL. Dostupné na: www.sukl.cz Ternes, T.A., Occurrence of drugs in German sewage treatment plants and rivers. Water Research, 1998. 32(11): p. 3245-3260. Ternes, T., M. Bonerz, and T. Schmidt, Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2001. 938(1 2): p. 175-185. Vieno, N.M., Härkki, H., Tuhkanen, T., Kronberg, L., Occurrence of pharmaceuticals in river water and their elimination in a pilot-scale drinking water treatment plant. Environ. Sci. Technol, 2007. 41: p. 5077-5084. Vulliet, E. and C. Cren-Olivé, Screening of pharmaceuticals and hormones at the regional scale, in surface and groundwaters intended to human consumption. Environmental Pollution, 2011. 159(10): p. 2929-2934. Yamamoto, H., et al., Persistence and partitioning of eight selected pharmaceuticals in the aquatic environment: Laboratory photolysis, biodegradation, and sorption experiments. Water Research, 2009. 43(2): p. 351-362. Zákon o léčivech 378/2007 Sb. Dostupné na: http://portal.gov.cz/app/zakony/zakon.jsp?page=0&nr=378~2f2007&rpp=15#seznam 21
7. PŘÍLOHY 7.1 Odběrový protokol 22
7.2 Fotodokumentace postupu přípravy vzorků A C D B E Obr. 6.: příprava a zpracování vodných vzorků z řeky Dyje: A) ph metr měření a úprava ph vzorku vody před zpracováním, B) filtrační aparatura pro oddělení plaveniny od vzorku vody, C) křemenné filtry použité pro oddělení plaveniny, D) plavenina zachycená z cca 1l vzorku vody a E) vzorek plaveniny připravený k uchování před dalším zpracováním 23
A B C D Obr. 7.: zpracování vzorků sedimentů a plaveniny: A) odvážení cca 2g půdy do plastové centrifugační zkumavky, B) extrakce v ultrazvukové lázni, C) centrifuga a D) vzorky sedimentů a filtrů s plaveninou po centrifugaci 24
A B C Obr. 8.: extrakce vzorků vody na pevnou fázi (SPE): A) manifold - zařízení na podtlakovou extrakci na tuhé fázi opatřené pumpou a promývačkou, B) SPE kolonka pro zachycení cílových analytů z vodných roztoků se sorbentem HLB (m-divinylbenzen a N-vinylpyrrolidon kopolymer) a C) beztlaková eluce vzorků methanolem 25
7.3 Výsledky Tabulka 6a: Naměřené koncentrace PPCP ve vzorcích vod v ng/l koncentrace ng/l atenolol acetaminophen ciprofloxacin DEET diklofenak hydrochlorothiazid ibuprofen NM_v <MQL <MQL <MQL 4.68 <MQL 0.76 <MQL NV_v 0.06 <MQL <MQL 4.75 2.33 3.15 7.10 PV_v 0.09 0.50 <MQL 5.02 1.93 2.93 7.24 NS_v <MQL 0.76 <MQL 5.94 0.79 1.26 0.00 SD_v <MQL <MQL <MQL 5.07 0.71 1.03 4.19 Tabulka 6b: Naměřené koncentrace PPCP ve vzorcích vod v ng/l koncentrace ng/l karbamazepin ketoprofen kofein kyselina klofibrová naproxen sulfamethoxazol triklokarban triklosan NM_v 3.89 <MQL 7.29 <MQL 1.70 1.13 0.51 0.94 NV_v 4.53 <MQL 3.25 <MQL 3.50 1.32 0.53 1.78 PV_v 3.91 <MQL 13.49 <MQL 2.88 1.14 0.73 1.08 NS_v 3.52 <MQL 10.47 <MQL 4.26 1.03 0.58 3.88 SD_v 3.91 <MQL 12.93 <MQL 2.21 1.14 0.42 0.00 26
Tabulka 7a: Naměřené koncentrace PPCP ve vzorcích plaveniny v ng/l koncentrace ng/l atenolol acetaminophen ciprofloxacin DEET diklofenak hydrochlorothiazid ibuprofen NM_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL NV_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL PV_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL NS_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL SD_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL Tabulka 7b: Naměřené koncentrace PPCP ve vzorcích plaveniny v ng/l koncentrace ng/l karbamazepin ketoprofen kofein kyselina klofibrová naproxen sulfamethoxazol triklokarban triklosan NM_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL NV_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL PV_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL NS_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL SD_v <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL 27
Tabulka 8a: Naměřené koncentrace PPCP ve vzorcích sedimentů v ng/kg koncentrace ng/l atenolol acetaminophen ciprofloxacin DEET diklofenak hydrochlorothiazid ibuprofen NM_s <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL 76.91 <MQL NS_s <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL 79.08 <MQL SD_s <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL 45.57 <MQL Tabulka 8b: Naměřené koncentrace PPCP ve vzorcích sedimentů v ng/kg koncentrace ng/l karbamazepin ketoprofen kofein kyselina klofibrová naproxen sulfamethoxazol triklokarban triklosan NM_s <MQL <MQL 217.67 <MQL <MQL <MQL <MQL <MQL NS_s 172.77 <MQL 375.96 <MQL <MQL 50.34 <MQL <MQL SD_s 37.48 <MQL 354.92 <MQL <MQL 10.92 <MQL <MQL 28