LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ Stanovení celkového dusíku a výpočet obsahu bílkovin (Kjeldahlova metoda) Garant úlohy: Ing. Zbyněk Džuman, Ph.D.
OBSAH ÚVOD... 3 1. Základní požadované znalosti... 3 2. Kritéria hodnocení práce... 3 3. Náplň úlohy... 3 ČASOVÝ HARMONOGRAM PRÁCE... 4 A STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU DUSÍKU METODOU PODLE KJELDAHLA... 5 A-1 Použitelnost metody... 5 A-2 Princip metody... 5 A-3 Používané přístroje, zařízení a laboratorní sklo... 5 A-4 Chemikálie a roztoky... 5 A-5 Pracovní postup... 6 A-5.1 Mineralizace... 6 A-5.2 Destilace (UDK 129)... 6 A-5.2.1 Příprava aparatury... 6 A-5.2.2 Destilace vzorku... 7 A-5.3 Vypláchnutí aparatury... 7 A-5.4 Vypnutí přístroje... 7 A-5.5 Titrace... 7 A-5.5.1 "Slepá" titrace... 7 A-5.5.2 Titrace vzorku... 8 A-5.6 Výpočet výsledků... 8 B STANOVENÍ AMONIAKÁLNÍHO DUSÍKU METODOU PODLE KJELDAHLA... 9 B-1 Použitelnost metody... 9 B-2 Princip metody... 9 B-3 Používané přístroje, zařízení a laboratorní sklo... 9 B-4 Chemikálie a roztoky... 9 B-5 Pracovní postup... 9 B-5.1 Příprava vzorku... 9 B-5.2 Destilace I (aparatura Parnase-Wagnera)... 9 B-5.3 Promytí aparatury Parnase-Wagnera... 10 B-5.4 Destilace II (UDK 129)... 10 B-5.5 Titrace destilátu... 10 B-5.6 Výpočet výsledků... 10
ÚVOD 1. Základní požadované znalosti Bílkoviny - definice pojmů hrubá, čistá a travitelná bílkovina. Princip Kjeldahlovy metody stanovení amoniakového a celkového dusíku v potravinách (Davídek a kol.: Laboratorní příručka analýzy potravin, SNTL, 1977, str. 181 183). Mineralizace na mokré cestě. Titrační metody: princip odměrné analýzy, základní pojmy, pravidla provádění titračních stanovení, příslušné výpočty. Příprava roztoků, základní výpočty. 2. Kritéria hodnocení práce Prokázané teoretické znalosti Praktické provedení práce Dodržení pravidel pro práci v laboratoři (bezpečnost, pořádek, čistota) Protokol - ucelenost experimentálních údajů, výpočet výsledků a jejich diskuse 3. Náplň úlohy A. Stanovení celkového obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla pomocí systému UDK 129 (podle ČSN ISO 1871; adaptováno pro potřeby výuky a použití přístroje UDK 129) Každý student provádí mineralizaci jednoho vybraného vzorku (mouka, proteinový prášek ap.). Do protokolu se uvede stanovený obsah dusíku a hrubé bílkoviny. Zjištěný obsah hrubé bílkoviny se porovná s deklarovanou hodnotou, je-li uvedena na obale výrobku. B. Stanovení amoniakálního dusíku metodou podle Kjeldahla s využitím aparatury Parnase-Wagnera a systému UDK 129 Každá dvojice studentů analyzuje jeden vzorek bílkovinného hydrolyzátu a pracuje nezávisle na ostatních studentech. Vzorek je zpracován nejprve s využitím aparatury Parnase-Wagnera a poté systému UDK 129. Do protokolu se uvede obsah amoniaku stanovený oběma systémy a výsledky se porovnají.
ČASOVÝ HARMONOGRAM PRÁCE Krok č. A. Stanovení celkového dusíku B. Stanovení amoniakálního dusíku 1. Úvodní výklad a zkoušení (30 min) 2. Navážení a příprava vzorků pro mineralizaci (30 min) Výklad k aparatuře Parnase-Wagnera 3. (10 min) Mineralizace a chlazení mineralizátu 4. (120 min) Navážení a příprava vzorků (10 min) Stanovení s využitím aparatury 5. Probíhá automaticky, paralelně je Parnase-Wagnera (70 min) 6. stanovován amoniakální dusík (aparatura Výklad k systému UDK 129 (10 min) Parnase-Wagnera, přístroj UDK 129) Stanovení pomocí systému UDK 129 7. (20 min) 8. Stanovení celkového dusíku pomocí systému UDK 129 (40 min) 9. Úklid (15 min)
A STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU DUSÍKU METODOU PODLE KJELDAHLA (systém UDK 129) A-1 Použitelnost metody Metoda má univerzální použití pro vzorky potravin a potravinářských surovin, u nichž není obsah dusíku příliš nízký, a pro vzorky neobsahující větší množství dusitanů a dusičnanů. A-2 Princip metody Dusíkaté látky přítomné ve vzorku jsou nejprve převedeny na amonné ionty (síran amonný) mineralizací varem v kyselině sírové za přítomnosti katalyzátoru. Z těchto iontů se alkalizací uvolní amoniak, který se po vydestilování s vodní parou jímá do předlohy s přebytkem kyseliny sírové za vzniku síranu amonného. Množství nezreagované kyseliny sírové se stanoví titračně, vypočítá se obsah dusíku a následně s využitím příslušného přepočítávacího faktoru obsah hrubé bílkoviny. A-3 Používané přístroje, zařízení a laboratorní sklo Analytické váhy Mineralizační jednotka VELP DK 6 Mineralizační trubice (250 ml) Stojan na mineralizační trubice (6 pozic) Destilační jednotka UDK 129 se zásobním kanystrem na 30% (w/w) roztok hydroxidu sodného Odsávač par s teflonovým těsněním připojený na vodní vývěvu Běžné laboratorní sklo A-4 Chemikálie a roztoky Destilovaná voda Kyselina sírová (96% - koncentrovaná!) - na mineralizaci Směsné katalyzační tablety pro mineralizaci (KJELTABS S/3,5; 3,5 g K2SO4 + 0,0035 g Se) Hydroxid sodný (30% roztok, w/w) - na uvolnění amoniaku z mineralizátu Tashirův indikátor Kyselina sírová (do předlohy), roztok o koncentraci c = 0,05 mol/l, připraven z normanalu Hydroxid sodný (na titraci), roztok o koncentraci c = 0,1 mol/l, připraven z normanalu Pozn.: Používají se chemikálie čistoty p.a.
A-5 Pracovní postup A-5.1 Mineralizace Do mineralizační trubice se umístí 2 tablety pro mineralizaci. Do lodičky se s přesností na 2 desetinná místa naváží 0,25 1 g (upřesní asistent) vybraného vzorku dle povahy, který se pak pomocí 12 ml koncentrované kyseliny sírové kvantitativně převede do mineralizační trubice. Důležité upozornění: S koncentrovanou kyselinou sírovou manipulujte pouze v digestoři k tomu určené a s nasazenými gumovými rukavicemi a ochranným štítem!!! Kyselinu nejprve nalijte ze zásobní lahve do kádinky k tomu určené a z této pak přelévejte do odměrného válce. Vzorek přesypte z lodičky do mineralizační trubice tak, abyste pokud možno neznečistili její stěny, a lodičku pak opatrně opláchněte do mineralizační trubice pomocí kyseliny z válečku. Laboratorní sklo důkladně popisujte fixem, aby nedošlo k záměně chemikálií a vzorků. Obsah mineralizační trubice se opatrně krouživým pohybem zamíchá a následně se trubice umístí do stojanu na trubice umístěného v plechovém stojanu. Stojan na trubice se poté přesune do spalovacího bloku, na trubici se nasadí odsávač par, pustí se vodní vývěva a zapne se spalovací blok s přednastaveným programem P01 ( Start P01 ). Tento program je nastaven na teplotu spalování 420 C po dobu 85 min, což zahrnuje cca 25 minut nutných k vyhřátí bloku a 60 min vlastní mineralizace. Průběh mineralizace je možno sledovat vyjmutím plechové krytky umístěné na stojanu s mineralizačními trubicemi (s černým madlem). Konec mineralizace je indikován zvukovým signálem (pípnutí), po němž se spalovací blok vypne a stojan s mineralizačními trubicemi se nechá zchladnout v plechovém stojanu (mimo spalovací blok) po dobu min. 15 minut. Důležité upozornění: Trubice umisťuje do spalovacího bloku, vyjímá je z něj a zapíná ho POUZE ASISTENT!! Před započetím mineralizace je nutno zapnout nejen vodní vývěvu, ale také odvod par v digestoři!! Pozn.: Z časových důvodů je doba mineralizace zkrácena. V praxi je nutné pokračovat v mineralizaci po vyčeření obsahu trubice ještě cca 60 minut v závislosti na analyzované matrici, aby se zabezpečil rozklad rezistentních sloučenin (např. lysin, tyrosin). A-5.2 Destilace (UDK 129) A-5.2.1 Příprava aparatury Přístroj se zapojí do sítě a stiskem zeleného tlačítka (vpravo) se uvede do provozu. Přístroj se začne po zapnutí předehřívat (cca 2-3 min), provozní stav je indikován hlasitým signálem (pípnutí). Dále se pustí vodovodní kohoutky pod přístroji jakožto zdroj chladicí vody. Do přístroje se umístí čistá mineralizační trubice do poloviny naplněná destilovanou vodou a uzavře se přední plexisklový kryt. Pro správné umístění mineralizační trubice do polohy pro destilaci je nutné pomocí modré páčky nad trubicí snížit pozici stojanu, vložit trubici do přístroje a poté ji pomocí páčky uvést zpět do původní polohy. Vpravo pod ústí chladiče se umístí Erlenmayerova baňka s vodou pro jímání destilátu, přičemž hladina vody musí být cca 1 cm nad ústím kapiláry. Na displeji vpravo nahoře se nastaví čas 3 minuty a po stisknutí tlačítka START se uvede přístroj do provozu, tzn. zapne se chlazení, automaticky se nadávkuje NaOH a začne probíhat destilace. Tímto krokem se též odstraní eventuální zbytky chemikálií z předchozích pokusů.
Přístroj se po předehřátí automaticky vypne. Poté se manuálně otevře přední plexisklový kryt, mineralizační trubice i Erlenmayerova baňka se vyndají z přístroje a jejich obsah se vylije do výlevky. Vnitřní kapilára pro vývoj vodní páry musí být vždy umístěna v drobném kovovém držáku ve spodní části destilačního přístroje. Důležité upozornění: Mineralizační trubici vyjímejte z přístroje koženými rukavicemi - je horká!!! Proplachování aparatury je nutné provádět před každým vzorkem. A-5.2.2 Destilace vzorku Vychladlý mineralizát v mineralizační trubici se velmi opatrně zředí cca 30 ml destilované vody a umístí se do přístroje dle popisu výše (A-5.2.1). Důležité upozornění: Mějte na paměti, že manipulujete se silně koncentrovanou kyselinou sírovou, navíc budete přilévat vodu do kyseliny!!! Přídavek vody provádějte opět v digestoři s nasazenými gumovými rukavicemi a ochranným štítem!!! Pod ústí chladiče se vloží jímací titrační baňka (předloha) s 25 ml kyseliny sírové o koncentraci c = 0,05 mol/l a 3 kapkami Tashirova indikátoru. Objem roztoku v jímací baňce se dle potřeby upraví vodou tak, aby konec chladiče zasahoval cca 1 cm pod hladinu. Po stisknutí tlačítka START je do mineralizační trubice automaticky nadávkován roztok hydroxidu sodného (30%, w/w) a spuštěn generátor vodní páry. Po uplynutí přednastaveného časového limitu (3 min) se destilace automaticky ukončí. Přední plexisklový kryt se otevře a konec chladiče se opláchne destilovanou vodou do jímací baňky. Poté se baňka vyjme a destilát se titruje podle kap. A-5.5.2. Mineralizační trubice se z přístroje vyjme a pomocí střičky se do ní opláchne dávkovací hadička. Obsah trubice se pak vylije opatrně do výlevky za současného zřeďování proudem vody. A-5.3 Vypláchnutí aparatury Po skončení destilace vzorku se destilovanou vodou opláchnou a vlhkým hadříkem otřou všechny části aparatury, které přišly do styku s koncentrovaným hydroxidem či kyselinou - zvláště gumová objímka sloužící k utěsnění mineralizačních trubic. Poté se provede čištění aparatury podle postupu uvedeného výše. V případě, že dojde k vylití roztoků v destilačním přístroji, lze jeho přední část otevřít černým uzávěrem (otočením o 90 ) a ze spodní části dvířek vyjmout odpadní vaničku černé barvy. Ta se opláchne vodou, otře a umístí zpět do přístroje. A-5.4 Vypnutí přístroje Po skončení destilace všech vzorků a vypláchnutí aparatury se do přístroje umístí čistá mineralizační trubice a Erlenmayerova baňka, uzavře se přední kryt a vypne se přívod vody. Přístroj se vypne hlavním spínačem a odpojí od elektrické sítě. A-5.5 Titrace A-5.5.1 "Slepá" titrace Do titrační baňky se nadávkuje 10 ml kyseliny sírové o koncentraci c = 0,05 mol/l, 3 kapky Tashirova indikátoru a přidá se cca 20 ml destilované vody, aby bylo usnadněno sledování barevného přechodu v bodě ekvivalence. Takto připravený roztok se titruje odměrným roztokem hydroxidu sodného o koncentraci c = 0,1 mol/l. Spotřeba by měla být 10 ml.
Pozn.: Slepá titrace slouží pro vyzkoušení barevného přechodu Tashirova indikátoru a kontrolu koncentrace odměrných roztoků. Tashirův indikátor je směsí methylenové modři s methylčervení. S postupným přidáváním odměrného roztoku NaOH dochází ke světlání fialové barvy, v bodě ekvivalence se roztok téměř odbarví a dostane šedavý nádech, další kapka (= přetitrováno) změní barvu na zelenou. Zbarvení Tashirova indikátoru: kyselá oblast: fialová neutrální oblast: šedavá/bezbarvá zásaditá oblast: zelená A-5.5.2 Titrace vzorku Destilát v jímací titrační baňce se titruje odměrným roztokem hydroxidu sodného (c = 0,1 mol/l). Titrace je ukončena jakmile dojde k odbarvení roztoku. Spotřeba se zaznamená a využije se pro výpočet (kap. A-5.6) A-5.6 Výpočet výsledků Při vlastní titraci hydroxidem sodným (0,1 mol/l) jde o titraci přebytku kyseliny (zpětná titrace), tedy kyseliny, která nezreagovala s amoniakem ze vzorku. Spotřeba NaOH (VNaOH) při titraci je tedy při daných koncentracích ekvivalentní množství nezreagované kyseliny sírové (VK2) podle rovnice: H2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 H2O. Pro výpočet množství dusíku ve vzorku musíme nejprve zjistit množství kyseliny, které zreagovalo s amoniakem (VKN) - musíme tedy odečíst nezreagované množství kyseliny od původního množství kyseliny v předloze (VK1): VKN = VK1 VK2 = VK1 VNaOH Obsah dusíku ve vzorku (mn) se pak vypočte podle úměry vycházející ze stechiometrie: 1 ml H2SO4 o koncentraci 0,05 mol/l odpovídá 1,4 mg dusíku, tzn. mn = 1,4 VKN Výsledek se přepočte na 100 g vzorku a dále se vyjádří jako obsah "hrubé bílkoviny" ve 100 g vzorku vynásobením přepočítávacím faktorem pro daný analyzovaný materiál: Pšenice, ječmen, oves, žito (celá zrna): 5,83 Kukuřice: 6,25 Rýže: 5,95 Pšenice (endosperm): 5,70 Cizrna, fazole: 6,25 Sójové boby: 5,71 Mléko: 6,38 Ostatní potraviny: 6,25 (univerzální)
B STANOVENÍ AMONIAKÁLNÍHO DUSÍKU METODOU PODLE KJELDAHLA (aparatura Parnase-Wagnera a systém UDK 129) B-1 Použitelnost metody Metoda je použitelná pro vzorky bílkovinných hydrolyzátů. B-2 Princip metody Amoniak se ze vzorku uvolní zalkalizováním, předestiluje se s vodní parou a po najímání do kyseliny sírové se stanoví zpětnou titrací. B-3 Používané přístroje, zařízení a laboratorní sklo Analytické váhy Destilační aparatura Parnase-Wagnera Mineralizační trubice (250 ml) Destilační jednotka UDK 129 se zásobním kanystrem na 30% (w/w) roztok hydroxidu sodného Běžné laboratorní sklo B-4 Chemikálie a roztoky Destilovaná voda Hydroxid sodný nebo draselný, pevný pro přípravu 30% (w/w) roztoku (na uvolnění amoniaku z mineralizátu) Tashirův indikátor Kyselina sírová (do předlohy), roztok o koncentraci c = 0,05 mol/l, připraven z normanalu Hydroxid sodný (na titraci), roztok o koncentraci c = 0,1 mol/l, připraven z normanalu Pozn.: Používají se chemikálie čistoty p.a. B-5 Pracovní postup B-5.1 Příprava vzorku Do odměrné baňky (50 ml) se odváží (s přesností na 2 desetinná místa) 5 g bílkovinného hydrolyzátu (např. polévkové koření, sójová omáčka) a doplní se po rysku destilovanou vodou. B-5.2 Destilace I (aparatura Parnase-Wagnera) Aparaturu je nejprve nutné utěsnit promazáním zábrusů vazelínou a uzavřením dostupnými zátkami. Následně se zapálí kahan, aparatura se zahřeje a vypláchne destilovanou vodou. Pod konec chladiče se poté umístí titrační baňka s 25 ml H2SO4 o koncentraci 0,05 mol/l a 3 kapkami Tashirova indikátoru tak, aby konec chladiče zasahoval pod hladinu. Do aparatury se odpipetuje
10 ml zředěného vzorku (viz kap. 5.1), po opláchnutí nálevky destilovanou vodou se přidá odměrným válcem 25 ml 30% roztoku NaOH a nálevka se opět opláchne destilovanou vodou. Uvolněný amoniak se destiluje vodní parou po dobu 15 minut (od začátku probublávání vodní páry vzorkem). Poté se opláchne konec chladiče destilovanou vodou do jímací baňky, baňka se vyjme a destilát se ztitruje podle kap. B-5.4. Po zhasnutí kahanu vznikne uvnitř aparatury chladnutím podtlak a vzorek se automaticky přesaje tak, že je možné jej vypustit do odpadní kádinky/baňky. Z aparatury se odstraní zbytky vzorku a aparatura se vypláchne destilovanou vodou. Důležité upozornění: Je-li nejprve odstaven plamen a poté vyjmuta předloha s nezreagovaným odměrným roztokem kyseliny sírové, obsah jímací baňky se může nasát do chladiče!!! B-5.3 Promytí aparatury Parnase-Wagnera Promytí aparatury Parnase-Wagnera je realizováno stejným postupem, jako je destilován vzorek, avšak místo vzorku a hydroxidu sodného je do aparatury dávkována pouze destilovaná voda (20 30 ml), stejně tak v předloze je jen destilovaná voda. Po započetí destilace je aparatura několik minut promývána, poté se vyjme předloha, zhasne kahan a oplachová voda se vypustí do odpadní baňky a vylije. Celý tento postup se ještě dvakrát zopakuje. Důležité upozornění: Po zchlazení aparatury Parnase-Wagnera je nutné vyjmout zábrusové zátky a kohout, odmastit je acetonem a otřít buničinou, jinak by mohlo dojít k jejich zatuhnutí v aparatuře!!! B-5.4 Destilace II (UDK 129) Vzorek hydrolyzátu (10 ml) je napipetován do čisté mineralizační trubice a obsah zředěn přibližně 20 ml destilované vody. Destilace s využitím přístroje UDK 129 poté probíhá stejným způsobem jako v případě mineralizátu vzorku mouky, proteinového prášku či jiné zvolené matrice z pracovní části A. B-5.5 Titrace destilátu Množství nezreagované kyseliny sírové v předloze se stanoví titrací odměrným roztokem NaOH o koncentraci 0,1 mol/l. Titrace je ukončena, jakmile dojde k odbarvení roztoku. Spotřeba se zaznamená a využije se pro výpočet (kap. B-5.6) B-5.6 Výpočet výsledků Spotřeba NaOH (VNaOH) při titraci je při daných koncentracích podle rovnice (viz. níže) ekvivalentní množství nespotřebované kyseliny sírové (VK2). Po odečtení nespotřebovaného množství kyseliny sírové od původního množství kyseliny sírové v předloze (VK1) zjistíme množství kyseliny sírové, které zreagovalo s amoniakem ze vzorku (VKN): H2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 H2O VKN = VK1 VK2 = VK1 VNaOH
Obsah amoniaku ve vzorku (mnh3) se pak vypočte podle následující úměry vycházející ze stechiometrie: 1 ml H2SO4 o koncentraci 0,05 mol/l odpovídá 1,7 mg amoniaku, tzn. mnh3 = 1,7 * VKN Výsledky se vyjádří jako hmotnostní procenta amoniaku v původním neředěném vzorku, tj. gramy amoniaku ve 100 gramech vzorku. V protokolu se výsledky získané oběma systémy srovnají a kriticky zhodnotí.