N Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie

Transkript

1 ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Kultivační stanovení: Stanovení intestinálních enterokoků Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování:

2 Kultivační stanovení: Stanovení intestinálních enterokoků Oblast použití: Tato metoda platí pro stanovení intestinálních enterokoků v pitné a povrchové vodě. Není vhodná pro vzorky s vysokým obsahem nerozpuštěných látek nebo s mnoha interferujícími mikroorganismy. Mez detekce a mez stanovitelnosti: Teoretická mez detekce je 1 KTJ/100 ml, tj. nález jedné kolonie na ploše membránového filtru při filtraci 100 ml vzorku. Mez stanovitelnosti jsou 3 KTJ/100 ml pro 95% pravděpodobnost kladného výsledku za podmínek filtrace 100 ml. Pracovní rozsah: Pracovní rozsah je od 0 KTJ/100 ml (dáno požadavkem vyhlášky č. 252/2004 Sb.). Shora pracovní rozsah není omezen, lze filtrovat menší objem vzorku nebo použít desetinné ředění vzorku. Stanovený ukazatel: Intestinální enterokoky jsou gram-pozitivní koky vyskytující se v párech nebo řetízcích. Vyskytují se ve střevním traktu člověka a zvířat. Enterokoky lze považovat za indikátory fekálního znečištění. Avšak některé enterokoky nalezené ve vodě mohou občas pocházet i z jiných zdrojů. Mají schopnost redukovat 1,3,5-trifenyltetrazoliumchlorid na formazan a hydrolyzovat aeskulin při teplotě 44 C na specifických médiích. Podstata zkoušky: Zkoušený podíl vzorku nebo zředěného vzorku se filtruje přes membránový filtr, který se přenese na pevné kultivační medium obsahující azid sodný a bezbarvý 2,3,5-tri-fenyltetrazolimchlorid (TTC), který je činností enterokoků redukován na červený formazan. Kultivace se uskutečňuje při teplotě 36 C ± 2 C po dobu (44 ± 4) hodin. Po kultivaci se počítají jako presumptivní enterokoky všechny vyrostlé kolonie, které jsou kaštanové, červené či růžově zbarvené. Pokud se vyskytují typické kolonie, přenese se celý membránový filtr na misku s pevným konfirmačním žluč-aeskulin-azidovým agarem. Médium s bakteriemi se inkubuje při teplotě 44 C ± 2 C po dobu 2 h. Enterokoky hydrolyzují aeskulin na 6,7-dihydroxikumarin, který s železitými ionty dává tříslově hnědou až černou sloučeninu, která difunduje do média. Přístroje a pomůcky: Analytické váhy citlivost 0,01 g. Autokláv (121 ± 3) C. Bunsenův kahan. Erlenmayerovy láhve, lahve DURAN 45 se šroubovým uzávěrem. Filtrační zařízení s vývěvou SARTORIUS. Membránové filtry o průměru 50 mm a velikosti pórů 0,45 m. 2

3 Pinzety. Pipety s možností aplikace objemu 1 a 10 ml (popř. 0,1 ml dle povahy vzorku a potřeby), jednorázové špičky. Sterilní plastové Petriho misky o průměru 60 mm. Termostat 36 C ± 2 C a termostat 44 C 2 C. Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Tato voda se používá i pro potřeby ředění vzorku. Médium dle Slanetz Bartley (m-enterokokový agar, HiMedia M612I) Žluč-aeskulin-azidový agar (HiMedia M493I). Ředící roztok (fyziologický roztok). Postup zkoušky: Temperace vzorku: Před vlastním rozborem se vzorek, pokud je odebírán za nízkých teplot nebo uchováván v lednici, nechá vytemperovat na laboratorní teplotu 20 C až 25 C. K vytemperování obvykle stačí doba nutná pro přípravu pracovní plochy a všech pomůcek nutných ke zpracování vzorku. Promíchání vzorku: Vzorek se musí dokonale promíchat intenzivním protřepáním, aby se bakterie rovnoměrně rozptýlily v celém objemu vzorku. Volba vhodného objemu vzorku: Zkoušený objem vzorku nebo zředěného vzorku má být volen tak, aby na membránovém filtru o průměru 5 cm vyrostlo nejvýše 100 kolonií. Pro pitné vody je stanoven objem filtrovaného vzorku 100 ml. U surových vod povrchových, kde je předpoklad vyššího mikrobiálního znečištění se použije přiměřeně menší objem filtrovaného vzorku, případně vzorek zředěný. Stupeň zředění se určuje podle zkušenosti z předchozích rozborů, u vzorků neznámého složení se připravuje stupňů ředění více. Pro každý stupeň zředění se užívá zřeďování v poměru 1:10. Zřeďování se provádí v lahvičkách se zábrusovým uzávěrem obsahujících 9 ml nebo 90 ml sterilního ředícího roztoku přidáním 1 ml nebo 10 ml vzorku neředěného nebo již zředěného v nižším stupni. Lahvička se uzavře a promíchá intenzivním protřepáním. Filtrace: Zapojí se filtrační přístroj a vývěva. Plamenem kahanu se vysterilizuje pevný, porézní disk spodní části filtrační nálevky. Sterilní pinzetou se na něj umístí sterilní membránový filtr a upevní se sterilní nálevka. Při zavřeném kohoutu vývěvy se nalije nebo odpipetuje do nálevky požadovaný objem vzorku. Následuje otevření výpustného kohoutu spodní části nálevky a pomocí vakua vývěvy se vzorek přefiltruje. Kultivace: Po odsátí celého objemu vody se odstraní nálevka a membránový filtr se přenese sterilní pinzetou na pevné kultivační médium (Slanetz Bartley agar) v Petriho misce. Filtr se klade pozvolna tak, aby nevznikly mezi kultivačním médiem a filtrem vzduchové bubliny. Takto připravené misky se obrácené dnem vzhůru uloží do termostatu a kultivují se při teplotě 36 C ± 2 C po dobu 44 h ± 4 h. Konfirmace: Po kultivaci se za typické považují všechny vyrostlé kolonie červeně, kaštanově nebo růžově zbarvené, a to celé, nebo i takové, které jsou zbarvené pouze ve středu. Pro potvrzení enterokoků se filtr se všemi koloniemi otiskne na žluč-aeskulinazidový agar a toto médium se kultivuje, spolu s přenesenými koloniemi, při 44 C ± 2 C po dobu 2 h. Počítají se kolonie vykazující tříslově hnědé až černé zbarvení média v bezprostředním okolí. 3

4 Obr. 1. Stanovení enterokoků, vzhled kolonií na enterokokovém médiu (fotografie nahoře), kolonie podrobené konfirmaci otiskem filtru na žluč-aeskulin-azid agar (fotografie uprostřed), potvrzené kolonie enterokoků po odstranění membránového filtru (fotografie dole). 4

5 Vyhodnocení zkoušky: Počet kolonií potvrzených konfirmačním testem se vyjadřuje u nezředěných vzorků (pitná voda) na zpracovaný objem vzorku, tj. na 100 ml. U vzorků filtrovaných z menšího objemu a u zředěných vzorků se přepočítává na 100 ml. V nezředěném vzorku se udává celkový počet kolonií i v tom případě, že vyrostlo méně než 10 kolonií na misce. Ve zředěném vzorku se uvádějí výsledky pouze z ředění, kde na miskách vyrostlo 10 až 100 kolonií. Misky, na kterých vyrostlo v důsledku nesprávné volby ředění více než 100 kolonií, se označují jako nepočitatelné a nevyhodnocují se. Obr. 2. Stanovení enterokoků, vlevo kolonie před konfirmací a vpravo kolonie po otisknutí na žluč-aeskulin-azidový agar. Uvádění výsledků: Výsledky se uvádí jako počet KTJ na zpracovaný objem vzorek, např. 100 ml vzorku. V případě ředěného vzorku je nutné použité ředění ve výsledku zohlednit. Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN (2. přepracované vydání), AA 26,32 ČSN EN ISO Jakost vod Stanovení intestinálních enterokoků v povrchových a odpadních vodách - Část 1: Miniaturizovaná metoda stanovení v tekutém médiu (stanovení MPN) ČSN EN ISO Jakost vod Stanovení intestinálních enterokoků - Část 2: Metoda membránových filtrů 5