Prof. MUDr. Jaroslav Masopust, DrSc. 2. lékaøská fakulta UK Praha, Ústav klinické biochemie a patobiochemie ŽIVOT jako DÌDIÈNÉ SMRTELNÉ ONEMOCNÌNÍ pøenášené POHLAVNÍMI BUÒKAMI (Vývoj jedince a jeho patologie, oxidaèní stres, stárnutí, regenerace) - 1. èást 1. Úvod Lidský život mùžeme parafrázovat jako dìdièné smrtelné onemocnìní pøenášené pohlavní cestou s velmi rùznými projevy a s chronickým, subchronickým nebo též s akutním i perakutním prùbìhem. Prevencí a léèením mùžeme jen zmírnit doprovodné nepøíznivé nebo škodlivé stavy a pøíznaky. Pøes tuto zdánlivì smutnou vyhlídku stojí za to jej žít, protože má i svìtlé stránky, krásné prožitky a poznatky, které z nìj vytváøejí jedineènou a nejpodivnìjší existenci v celém vesmíru. Je tedy souèástí našeho vesmíru, prostoroèasového kontinua, které zaèalo velkým tøeskem asi pøed 13,7 miliardami let a které se prý vyvíjí podle jednoho programu z (n) 500 možných; jedním takovým programem je vznik èlovìka na naší planetì. Datuje se od vzniku primitivních forem života na Zemi. To je asi pøed 3,5 miliardou let, kdy vznikly udržitelné podmínky pro existenci a rozvoj dvou základních slouèenin - nukleových kyselin a bílkovin. Vlastní život èlovìka, kterého stavíme na vrchol vývoje živých tvorù, se pøipravuje seznámením a pøiblížením jedincù opaèného pohlaví, kteøí jsou nositeli zárodeèných bunìk (gamet) s potøebnou genetickou informací (programem). To je prodromální stádium života. Vlastní život jedince zaène až oplozením vajíèka spermií. Z oplozeného vajíèka se vyvine zárodek (embryo) a dále plod (fetus). Tato fáze se dìje v tìle matky (na existenci matky úzce závislá) a je zakonèena porodem (zrození). Nazývá se proto prenatální. Od tohoto data se mìøí vlastní délka života jedince (fáze postnatální). Konèí smrtí (exitus). Pøi chronickém prùbìhu to bývá v souèasné dobì 2-2,7 miliard sekund, maximálnì (zatím) 4 miliardy. Èlovìk, který je nadán mozkem umožòujícím abstraktní myšlení, je jedinou živou bytostí (alespoò na této planetì), která se zabývá myšlenkou, odkud pøišel a kam spìje on i celý vesmír a co je smysl života. V tomto sdìlení se nebudu zabývat filozofií nebo náboženským nazíráním na život (snad až na závìr), ale pokusím se velmi zjednodušenì popsat, co víme o molekulových mechanismech, které vznik života a vývoj lidského jedince provázejí a co jej mùže potkat a ovlivnit (po stránce medicínské). 2. Ontogeneze (vývoj jedince) Embryo Zaèíná splynutím zárodeèné buòky (gamety) ženské a mužské (vajíèka a spermie), tj. oplodnìním (fertilizací). Jde o složitý proces, pøi nìmž z asi 250 000 000 (!!!) spermií ve vaginální dutinì pøi pohlavním styku se do dìložní dutiny dostane v prùmìru 100 000 a jen ménì než 50 (!) až do vejcovodu, v nìmž protismìrnì putuje vajíèko, uvolnìné z vajeèníkù pøi ovulaci. Když vajíèko doputuje (za 1 až 2 dny po ovulaci) pùsobením kontrakcí svaloviny vejcovodu do prostoru mezi jeho zúžením a ampulou, dochází (obvykle jedinou spermií) k oplodnìní (životnost spermie po ejakulaci trvá 48-72 hodin). (Obr. 1). Ne každý muž, jinak zjevnì zdravý, vytváøí spermie schopné oplození. Jednou z mnoha pøíèin je kupø. hydroxylace DNA spermií volnými radikály za vzniku patologické oxydna. Jako biomarker tohoto poškození je prùkaz 8-oxoguaninu (Meseger M., 2008). Zpravidla pouze jediné spermii je umožnìno proniknout do nitra vajíèka. Hlavièka spermie adheruje nejprve na povrchovou membránu (zona pellucida). Dìje se tak interakcí komplementárních molekul na povrchu plazmatických membrán obou gamet. Byla identifikována øada faktorù pùsobících pøi této aktivitì, jako kupø. epididymální glykoprotein (DE), èlen rodiny CRISP (cystein-rich secretory protein), jehož inhibice aplikací specifické protilátky mùže být jedním ze zpùsobù, jak zabránit oplodnìní (Diego A., 2008). Po transportu spermie skrz zona pellucida do perivitelinního prostoru (trvá to 15-25 min.) dojde k uvolnìní kortikálních granul, které blokují prùnik dalších spermií pùso- 4 Labor Aktuell 01/09
Obr. 1: Cesta spermie a vajíèka po kopulaci bením hydrolytických enzymù narušujících molekuly receptorù (Obr. 2). V této fázi se kompletizuje druhé meiotické dìlení a vzniká mužský pronukleus (mužské prvojádro), obsahující polovièní (haploidní) poèet chromozomù. Po penetraci vitelinní membrány se vytvoøí i ženský pronukleus. Obì prvojádra putují k centru vajíèka, jejich haploidní chromozomy replikují, vytváøí se mitotické vøeténko a nastává mitotické dìlení (rýhování) za vzniku dvou bunìk, spolu spojených - blastomér. Pøi meióze dochází k jedné replikaci, po níž následují dvì bunìèná dìlení, takže z každé diploidní buòky vzniknou 4 haploidní buòky. Obèas meióza probíhá abnormálnì a homologní chromozomy se od sebe neoddìlí, dojde k nondisjunkci. V tomto pøípadì nìkteré haploidní buòky postrádají urèitý chromozom, zatímco jiné ho mají nadbyteèný. Takové gamety dávají vzniknout abnormálním zárodkùm; vìtšina zanikne, ale nìkteré pøežívají, vyvíjí se dále. Napøíklad Downùv syndrom je zpùsoben pøítomností nadbyteèné kopie chromozomu 21 (diploidní buòka po oplodnìní má tøi kopie chromozomu 21 místo normálních dvou). (Obr. 2) Aèkoliv bunìèná struktura lidského tìla je velmi složitá, je vytváøena omezeným repertoárem bunìèných aktivit: Buòky rostou a dìlí se (proliferace), umírají (apoptóza), pøichycují se (adherence), diferencují se zapínáním nebo vypínáním aktivit specifických sad proteinù, vyvíjejí síly umožòující pohyb, vytváøejí molekulové signály ovlivòující sousední buòky a dovedou na tyto signály reagovat. Genom, který je v každé jaderné buòce stejný, urèuje pravidla, podle kterých jsou tyto rùzné bunìèné aktivity uplatòovány. Takto se ovlivòuje celý složitý mnohobunìèný proces vývoje, kterým vzniká dospìlý organismus z oplodnìného vajíèka. Tento proces je øízen složitým bunìèným informaèním systémem, kterým je bunìèná signalizace. V poèáteèních fázích vývoje, kdy ještì není vytvoøen funkèní cirkulaèní systém, signály mezi buòkami jsou šíøeny difuzí parakrinnì (pouze difuzibilní proteiny a na krátkou vzdálenost) a juxtakrinnì (nedifuzibilní proteiny mezi sousedícími buòkami); po vytvoøení cirkulace je to také cesta endokrinní, umožòující pøenos i na vzdálené oblasti. Parakrinní faktory vyvolávají bunìèné aktivity cestou signální transdukce buï aktivací (navozením fosforylace) jednotlivých èlenù signální dráhy nebo odblokováním jejich inhibitorù. Juxtakrinní signalizace se dìje tøemi zpùsoby: (a) tzv. gap junction, to je kanálky (tzv. konexiny) v membránách na sebe naléhajících bunìk (b) pomocí receptoru na povrchu buòky (kupø. signální dráha Notch) (c) pomocí ligand (kupø. fibronektin, laminin) a jejich receptorù (kupø. integrinù) v extracelulární matrix, jejichž sekrece je navozena vzájemným kontaktem dvou sousedících bunìk. Notch proteiny jsou typem transmembránových glykoproteinù dùležitých pro správný rozvoj a interakci mezi bunìènými typy v prùbìhu ontogeneze. Notch signalizace hraje dùležitou úlohu kupø. pøi diferenciaci epidermis a vlasových váèkù. Od poèátkù ontogeneze se na rùstu a diferenciaci bunìk a tkání podílejí rùzné rùstové a diferenciaèní faktory (GD s), které možno klasifikovat do nìkolika skupin: Obr. 2: Schéma oplodnìní vajíèka spermií (fertilizace) ibroblastové rùstové faktory ( G ) Byly identifikovány dvì až tøi desítky genù kódujících nìkolik set izoforem proteinových faktorù, které aktivují rùzné receptory fibroblastových rùstových faktorù ( G Rs). Tyto pak navozují bunìènou signalizaci (signální dráhy) podílející se na angiogeneze, rùstu nervových axonù nebo diferenciaci mezodermu. Nìkteré se Labor Aktuell 01/09 5
renciace urogenitálního ústrojí. Receptory jsou èlenové frizzled family. (Obr. 5) TG -beta superfamily Tato nadrodina má více než 30 èlenù, ke kterým patøí transformující rùstový faktor beta (TG -beta), kostní morfogenetické proteiny (BMP), rodina aktivinu, Muellerian inhibiting factor (MI ). TG -beta proteiny jsou dùležité pro tvorbu extracelulární matrix a vìtvení epitelií pøi vývoji plic, ledvin, slinných žláz. Rodina BMP indukuje tvorbu kosti, podílí se na regulaci bunìèného cyklu dìlení, na apoptóze nebo migraci bunìk a øadì dalších mechanismù. Obr. 3: Signalizace rùstových faktorù i vzájemnì zastupují. Kupø. G 8 se podílí jak na vývoji konèetin, tak na vývoji nìkterých èástí mozku. (Obr. 3) Hedgehog proteiny jsou kódovány tøemi geny, Desert (Dhh), Indian (Ihh) a Sonic hedgehog (Shh). Poslednì jmenovaný se podílí na øadì vývojových mechanismù, jako je formování konèetin, indukce a formování neurální trubice, diferenciace somitù, regionalizace støeva apod. Receptorem pro rodinu hedgehog je Patched Obr. 4: Signalizace hedgehog (Ptch), který blokuje proteinové faktory nazvané Smoothened (Smo). Odblokované Smo proteiny realizují transdukcí hedgehog signalizaci. Jde tedy o aktivaci transdukce signálu mechanismem dereprese represe. (Obr. 4) WNT proteiny Bylo identifikováno více 15 rùzných WNT faktorù podílejících se na signalizaci vývoje, jako regulace formování konèetin, vývoj støedního mozku, somitù nebo dife- Oct-3/4 Jde o 34kDa POU transkripèní faktor, který je exprimován embryonálními kmenovými buòkami nebo zárodeènými buòkami. Udržuje aktivitu samoobnovy bunìk a jeho pøítomnost podmiòuje pluripotenci (omnipotenci). Nanog Je èlen rodiny homeobox vázajících transkripèních faktorù, udržujících aktivitu pluripotence embryonálních kmenových bunìk. Tak jak tyto buòky postupnì diferencují, jejich pluripotentní aktivita se snižuje. (Obr. 6) Èasování dìlení oplodnìného vajíèka je následující: 2 buòky (blastomery) vzniknou za 26 hod., 4 buòky za 46-48 hod., 8 bunìk za 51-62 hod., vznik moruly (útvar obsahující > 16 blastomer) za 11-135 hod. Implantace do dìlohy: Ve stádiu moruly vstupuje zárodek do dutiny dìložní, mìní se (za 123-147 hod.) na blastocytu, což je kulový útvar s dutinou a dvìma typy bunìk, vytváøejících trofoektoderm (vnìjší vrstva) (základ pozdìjší placenty) a dále bunìèné nakupení ve vnitøní vrstvì (základ plodu). Implantace do endometria tìhotenské dìlohy a napojení na mateøskou krevní cirkulaci zaèíná 7. den po ovulaci. Implantace embrya je dynamický proces parakrinní interakce mezi kompartmentem matky a zárodkem, který umožòuje adaptaci endometria na vývojovì zralou blastocystu. Blastocysta se naváže na endometrium tak, že konec blastocyty, v které se vyvíjí zárodek, je obrácen 6 Labor Aktuell 01/09
né tìhotenské faktory, pregnancy-related proteiny, faktor aktivující destièky, cytokiny (kupø. interleukin-10) a další. Obr. 5: Signalizace WNT Implantace lidského zárodku do endometria matky má za následek kompletní remodelaci dìložních tepen extravilózním trofoblastem. Jedním z mnoha faktorù, který mùže zpùsobit abnormity ve vývoji èasného stádia placenty, je nesprávná aktivace receptoru PPAR-gama a jaterního receptoru X (LXR). Pøítomnost nadmìrného množství ligand (jako jsou oxyldl èástice) v místì implantace mùže vést k poškození plodu a ke vzniku preeklampsie ( ournier T., 2008). Pøi implantaci se musí vyøešit paradox - mateøská non-rejekce fetálního allograftu, tedy zabránìní imunitní reakci matky na otcovské alloantigeny plodu. Nìkdy se tento pro plod ochranný mechanismus neuplatní a dochází k spontánnímu potratu (Chaouat G. et al., 2007). Placenta Hlavní funkcí placenty je: (a) výmìna produktù metabolismu mezi cirkulací matky plodu (b) tvorba hormonù jako je progesteron, estrogeny (estriol), somatomamotropin, choriový gonadotropin (hcg). Obr. 6: Signální dráhy v èasné fázi embryogeneze do dutiny dìlohy. Buòky trofoektodermu vytváøejí mikrovilli proplétající se s buòkami tìhotenského endometria (nazývá se decidua), které se do této formy pøemìnilo úèinkem progesteronu produkovaného z corpus luteum ovaria. Decidua je charakterizována velkými polyhedrálními buòkami s bohatým obsahem glykogenu a lipidù, èasto s více jádry. Další produkce progesteronu tìhotnou ženou udržuje tìhotenství. Implantace se dìje interdigitalizací mikrovilli s trofoektodermem; vzniká tak vnitøní vrstva cytotrofoblastu a vnìjší vrstva syncytiotrofoblastu. Buòky syncytiotrofoblastu produkují proteolytické enzymy (kupø. matrix-metaloproteináza 9), které erodují endometrium a umožòují tak zanoøení embrya do hloubky endometria. Tato aktivita trofoblastu je velmi pøísnì regulována, invazivita je nejvyšší v 1. trimestru a postupnì se snižuje na základì zmìn v expresi genù ovlivòujících komplexní mechanismus aktivace/inhibice proteolytických enzymù. Na implantaci embrya se podílí øada mateøských a embryonálních faktorù, jako jsou rùstové faktory (placentární rùstový hormon), histamin, prostaglandiny (15-deoxy-prostaglandin J), èas- Invazivní diferenciaèní aktivita trofoblastu (pøipomínající nádorovou proliferaci) je nutný fyziologický proces pøi vývoji placenty. Tvorba zakotvujících se klkù, proliferace bunìèných svazkù a invaze extravilózního cytotrofoblastu do stromatu mateøské decidui navozuje vaskulární zmìny pro zajištìní adekvátního krevního zásobení pro rostoucí plod. Na tomto diferenciaèním procesu se podílí øada faktorù signalizaèní kaskády jako je GTPáza RhoA, proteinkinázy ROCK, ERK1, ERK2, AK, PI3K, AKT/PKB, dále mtor a TG beta-dependentní SMAD faktory (Pollheimer J. et al., 2005). V èasné fázi placentace je nastoleno relativnì hypoxické prostøedí, které je nezbytné pro správný vývoj plodu. Intervilózní krevní cirkulace stoupá výraznìji po 12.-13. týdnu gestace a je pøíèinou zvýšené tenze kyslíku (po 2). Pøed škodlivým úèinkem nadbyteèného kyslíku chrání trofoblast faktor HI -1 (hypoxia inducibile factor 1). S expresí laboratornì prokazatelné podjednotky HI -1- beta stoupá paralelnì sekrece TG -beta 3, Labor Aktuell 01/09 7
který potlaèuje èasnou diferenciaci bunìk trofoblastu (Caniggia I., 2000). etus etální stádium zaèíná 9. týdnem gestace a konèí porodem. Je charakterizováno rychlým rùstem celého plodu a vytváøením jednotlivých orgánových systémù. Rùst do délky postupuje rychlostí 5 cm/ mìsíc mezi 3.-5. mìsícem gestace; poslední 2 mìsíce pøed porodem narùstá jeho hmotnost o 700 g/mìsíc. (Tab. 1) Tab. 1: Vývoj embrya a fétu Prenatální mortalita a morbidita je pomìrnì vysoká. Uvádí se, že až 30 % tìhotenství konèí spontánním potratem. (Tab. 2, Obr. 7) Tab. 2: rekvence teratogeneze v prenatálním období Obr. 7: Grafické znázornìní teratogeneze v prenatálním období Kouøení matky v tìhotenství zvyšuje perinatální morbiditu a mortalitu: placenta previa (RR-1,36), redukce hmotnosti, pøedèasný porod, asfyxie bìhem porodu, syndrom respiraèní tísnì apod. Také vystavení exhalacím tabákového kouøe mùže mít stejný úèinek (koreluje s množstvím nikotinu v krvi: 10 µg/l). Novorozenec - dítì - dospìlý jedinec Porodem se datuje vlastní život jedince. Novorozenec je stále závislý na péèi matky nebo dospìlých, ale na rozdíl od ochranného prostøedí, kterým byla dìloha, je už plnì vystaven vlivùm vnìjšího prostøedí. Adaptace na nové podmínky je základním pøedpokladem jeho další existence. Neonatální mortalita je nejvyšší v prvních 24 hodinách po porodu; na 1. rok života pøipadá nejvìtší procento exitù ve srovnání s ostatními léty života. Asi 1 % novorozencù má dìdiènou malformaci a 0,5 % je postiženo hereditárními poruchami vývojovými a metabolickými. Situace však nemusí být tak jednoduchá. Tak kupø. dvì autoimunitní zánìtlivá onemocnìní, diabetes mellitus typu 1 a coeliakie, která se èasto vyskytují pohromadì, mají genetický základ, jsou sdružena s geny HLA tøídy II lokalizovanými na chromozomu 6p21. Nedávné studie (Smyth D.J., 2008) prokázaly, že situace je složitìjší: byly objeveny alterace též jiných genù, které jednak zvyšovaly riziko klinického projevu coeliakie, ale snižovaly náchylnost k diabetu mellitu typu 1 (IL 18RAP a TAGAP alely na chromozomu 2q12 resp. 6q25). Rozdílný vliv na obì onemocnìní mìly i další lokusy (INS na chromozomu 11p15, IL2RA na 10p15, PTPN22 na 1p13, IL12A na 3q25 nebo LPP na 3q28). Tyto nálezy nasvìdèují tomu, že spoleèné biologické mechanismy, jako je autoimunitní poškození pøíslušných tkání a intolerance k potravinovým antigenùm, jsou spoleènými rysy obou chorob. Jedním z faktorù, který významnì narušuje zdraví zejména obyvatel velkých mìst nebo žijících v okolí prùmyslových lokalit, jsou exhalaèní produkty zneèiš- ující vzduch (air pollution). Nejde jen o toxiny, jako jsou oxidy dusíku, oxid siøièitý, ozon nebo prchavé aromatické slouèeniny, ale též o mikroskopické prachové èástice o aerodynamickém prùmìru 10 až 0,1 nm (nanoèástice). Tyto èástice mohou pronikat hluboko do plic pøi dýchání. Mnohé složky tìchto exhalací nejsou pøímo toxické, nìkteré kupø. NaCl neškodí vùbec; naproti tomu výfukové plyny pøi déle trvající expozici navozují oxidaèní stres a zánìtlivé reakce v plicích s následným vyplavováním protrombotických a prozánìtlivých cytokinù (IL-1-beta, IL-6) a GM-SC do krevní cirkulace z alveolárních makrofágù (Mills N.L., 2008, Medscape). Kromì toho nanoèástice translokované z alveolù do cirkulace atakují pøímo cévní endotel a spolu s LDL-èásticemi mají vliv na vznik ateromových plátù a tím zvyšují riziko závažných kardiovaskulárních chorob (Obr. 8). Kromì toho v posledním desetiletí se upozoròuje na zneèištìní vod (povrchové vody, moøe) medikamenty používanými v humánní i veterinární medicínì (Liebig M., 2006; Brain R.A., 2008), kam se dostanou z kanalizaèního odpadu. Tato farmaceutika jsou biologicky aktivní; jejich zátìž pro živé organismy je srovnatelná se zátìží pesticidy. Jejich toxicita v koncentraci analyzovaných vzorkù byla prokázána u rùzných øas nebo vodních rostlin. Na antibiotika jsou zvláš citlivá Cyanobakteria. Problém je v tom, že tyto látky se dostávají do potravinového øetìzce a mohou tak pùsobit nežádoucnì i na èlovìka, který jinak léky neužívá. Poznámka: V našem tìle nejsou jen naše buòky; dokonce tìch nevlastních (nalézajících se v trávicím ústrojí) je 90 % všech bunìk v tìle a našich vlastních jen (rozumí se poèet) 10 %. Gastrointestinální trakt obsahuje 10 14 (100 000 miliard = 100 trilionù) mikroorganismù, asi 8 Labor Aktuell 01/09
Obr. 8: Mechanismus poškození kardiovaskulárního systému exhalovanými nanoèásticemi 36 000 rùzných druhù. Tyto mikroorganismy vytváøejí složitý ekosystém s celkovým genetickým poolem (= mikrobiom) 100krát vìtším než je genom èlovìka (viz BMJ, 2009). Ve skuteènosti jsme hybridní superorganismus. Typ a poèet baktérií se liší, postupujeme-li od žaludku po tlusté støevo, v závislosti na ph, koncentraci kyslíku a dostupnosti živin. Udržování této populace rezidentních mikrobù, nazývaných støevní mikrobionta, má pro hostitele znaèný význam. Brání kolonizaci patogenních mikroorganismù. Jeli normální flóra destabilizována kupø. aplikací širokospektrých antibiotik, mohou proliferovat oportunní patogeny jako Clostridium difficile a navodit prùjmová onemocnìní. Bakteriální metabolismus poskytuje také nezbytné vitaminy a kofaktory jako vitamin K, foláty nebo biotin. Kromì toho asi 5-30 % energetické potøeby hostitele vzniká z fermentaèní èinnosti baktérií. Další význam spoèívá v tom, že baktérie se podílejí na vývoji a regulaci imunitního systému hostitele (Child M., Macfarlane G., 2008). (pokraèování) Diagnostická divize spoleènosti Roche uvádí na trh první test na zjištìní preeklampsie Spoleènost Roche v lednu oznámila, že uvádí na trh první in vitro diagnostický test pro zjištìní preeklampsie. irma Roche obdržela certifikát CE pro imunoanalytické testy hladiny PlG a s lt-1 pro použití se systémy Elecsys / cobas e, založenými na elektrochemiluminiscenèní imunoanalýze. Podle vìdeckých zjištìní mají významný podíl na rozvoji preeklampsie angiogenní rùstové faktory, jako je PlG (Placenta Growth actor) a s lt-1 (soluble fms-like tyrosine kinase-1). PlG je odpovìdný za normální funkci placenty, a tudíž i za správnì probíhající tìhotenství, zatímco s lt-1 má vliv na ukonèení tìhotenství v posledních týdnech gravidity. U žen, které onemocní preeklampsií, se hladina tìchto proteinù cirkulujících v jejich tìle zmìní. Hladina s lt-1 v plazmì se zvýší jak pøed stanovením diagnózy, tak i v dobì klinického projevu preeklampsie, zatímco hladina PlG je oproti normálnímu tìhotenství nižší. Na základì kombinovaného pomìru s lt-1/plg pak lze rozeznat normální prùbìh tìhotenství od tìhotenství provázeného preeklampsií. Tento test pøedstavuje pro zdraví žen další dùležitý mezník. Jsme hrdí, že jsme první spoleèností, která lékaøùm a laboratoøím tuto inovativní technologii poskytuje, øekl Dirk Ehlers, øeditel prodejní jednotky Profesionální diagnostika spoleènosti Roche. Labor Aktuell 01/09 9