ORÁLNÍ MIKROBIOM: NEMALÝ HRÁČ NA VELKÉM POLI ZDRAVÍ ČLOVĚKA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ORÁLNÍ MIKROBIOM: NEMALÝ HRÁČ NA VELKÉM POLI ZDRAVÍ ČLOVĚKA Bakalářská práce Kristýna Koželuhová Vedoucí práce: Mgr. Petra Vídeňská, Ph.D. Brno 2018

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Kristýna Koželuhová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Orální mikrobiom: nemalý hráč na velkém poli zdraví člověka Experimentální biologie Speciální biologie směr: Mikrobiologie a molekulární biotechnologie Vedoucí práce: Mgr. Petra Vídeňská, Ph. D. Akademický rok: 2017/2018 Počet stran: 73 Klíčová slova: orální mikrobiom, vývoj, faktory, periodontitida, zubní kaz, dysbióza, strava, systémová onemocnění

Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Kristýna Koželuhová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Oral microbiome: A great player in a large field of human health Experimental biology Special Biology Specialization: Microbiology and Molecular Biotechnology Mgr. Petra Vídeňská, Ph.D. Academic Year: 2017/2018 Number of Pages: 73 Keywords: oral microbiome, development, factors, periodontitis, dental caries, dysbiosis, diet, systemic diseases

Abstrakt Orální mikrobiom je soubor mikroorganismů nacházejících se v dutině ústní. Tento mikrobiom zahrnuje více než 700 bakteriálních druhů a je po střevě považován za druhý nejdiverzifikovanější lidský mikrobiom. V lidských ústech jsou identifikovány prokaryotické i eukaryotické mikroorganismy. Důležitou funkci má při udržování homeostázy v dutině ústní, která je zajišťována produkcí zásaditých látek tak, aby se ph co nejvíce blížilo neutrální hodnotě. Pokud tomu tak není a dojde k dysbióze, tak se může tento stav projevit rozvojem onemocnění dutiny ústní. Nejznámější jsou např. zubní kaz a periodontitida. Navíc orální infekce v těhotenství mohou být potenciálním nebezpečím pro vyvíjející se plod, protože můžou způsobit např. předčasný porod. Kromě toho má nerovnováha v orálním mikrobiomu vliv také na rozvoj systémových onemocnění, jakými jsou např. kardiovaskulární onemocnění, rakovina, pneumonie nebo Diabetes mellitus, kdy se bakterie dostávají krevním řečištěm při poranění dásně např. při běžném čištění zubů nebo stomatochirurgickém zákroku ke vzdálenějším orgánům. Abstract The human oral microbe is a set of microorganisms found in the oral cavity. This microbiome contains more than 700 bacterial species and is considered to be the second most diverse human microbiome after gut microbiome. Prokaryotic and eukaryotic microorganisms are identified in human oral cavity. An important function of the oral microbiome is to maintain homeostasis in the oral cavity, which is ensured by the production of alkaline substances so that the ph approaches as neutral as possible. If this is not the case, dysbiosis may occur which may result in a development of the oral cavity disease. Dental caries and periodontitis are the most common. In addition, oral infections in pregnancy may pose a potential risk to the development of the fetus, as they may cause e.g. premature birth. In addition, the oral microbial imbalance also affects the development of systemic diseases such as cardiovascular disease, cancer, pneumonia or Diabetes mellitus, when the bacteria invade into the bloodstream due to gum injuries, e.g. during normal tooth brushing or dental surgery, and migrate to distant organs.

Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucí mé bakalářské práce Mgr. Petře Vídeňské, Ph.D. za ochotu, velkou trpělivost, vstřícnost a cenné rady během sepisování bakalářské práce. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 25. 4. 2018 Kristýna Koželuhová

Obsah Seznam zkratek... 9 1. Úvod... 10 2. Cíle práce... 11 3. Orální mikrobiom... 12 3.1. Bakterie orálního mikrobiomu... 12 3.2. Bakteriální složení orálního mikrobiomu v závislosti na místě výskytu... 14 3.2.1. Zubní plak... 15 3.2.2. Dáseň a bukální sliznice... 17 3.2.3. Mandle, tvrdé patro, krk, dorsální strana jazyka, sliny... 17 3.3. Výskyt orálních patogenů u zdravých lidí... 18 3.4. Bakterie orálního mikrobiomu ve vzorcích stolice... 18 4. Vývoj orálního mikrobiomu... 19 4.1. Bakteriální kolonizace novorozence a způsob porodu... 19 4.1.1. Přirozený porod... 19 4.1.2. Císařský řez... 19 4.2. Poporodní bakteriální kolonizace... 20 4.3. Vliv matky na orální mikrobiom dítěte... 22 4.3.1. Užívání antibiotik matkou a vliv na orální mikrobiom dítěte... 23 4.3.2. Chování matky a přenos bakterií na dítě... 23 4.4. Vliv výživy na orální mikrobiom dítěte... 24 4.4.1. Mateřské mléko... 24 4.4.2. Umělá výživa... 25 5. Faktory ovlivňující orální mikrobiom... 27 5.1. Geografie a příslušnost k etniku... 27 5.2. Genetika... 30 7

5.3. Strava... 31 5.4. Vliv hospitalizace v nemocnici a antibiotik... 33 5.5. Probiotika a orální mikrobiom... 34 5.6. Hygiena... 34 5.7. Alkohol a kouření... 35 5.8. Ortodontická léčba a její vliv na orální mikrobiom... 36 6. Orální mikrobiom a nemoci dutiny ústní... 38 6.1. Zubní kaz... 38 6.1.1. Zubní kaz a strava... 40 6.1.2. Výživová doporučení pro prevenci před zubními kazy... 41 6.2. Periodontitida... 42 6.2.1. Výživová doporučení pro prevenci periodontitidy... 43 6.3. Halitóza... 44 7. Orální mikrobiom a systémová onemocnění... 45 7.1. Rakovina... 45 7.2. Kardiovaskulární onemocnění... 46 7.3. Diabetes mellitus... 46 7.4. Pneumonie... 47 8. Závěr... 48 9. Seznam literatury... 49 8

Seznam zkratek CFU z ang. colony formintg units kolonie tvořící jednotky IgA imunoglobulin A OSCC z ang. oral squamous cell carcinoma dlaždicobuněčný karcinom dutiny ústní 9

1. Úvod O mikroorganismy v dutině ústní se začal zajímat již Antonie von Leeuwenhoek, který pozoroval pod mikroskopem zubní plak seškrábaný ze svých vlastních zubů. Od této doby mikrobiologie zaznamenala značný pokrok. Přes prvotní využívání kultivačních metod až po současnost, kdy jsou hojně používány metody sekvenování druhé generace. Dutina ústní je po střevě druhým nejosídlenějším místem lidského těla. Metagenomické studie se převážně věnovaly mikrobiomu střevnímu, ale postupně se více zkoumá i mikrobiom orální. Jde totiž o hlavní vstup do lidského těla. Při konzumování potravy se jídlo v dutině ústní mísí se slinami a pokračuje dále do trávicího traktu. Vdechovaný vzduch prochází nosem a dutinou ústní a následně se dostává do plic. V orálním mikrobiomu se nachází více než 700 bakteriálních druhů, z nichž většina je nekultivovatelných. Objevují se zde prokaryotní zástupci domény Bacteria i Archaea, viry, ale rovněž se tu nachází eukaryotní kvasinky a zástupci říše Fungi. Dutina ústní, z hlediska své anatomie, poskytuje řadu rozmanitých habitatů, zahrnující zuby, dásně, jazyk, mandle a sliny. Pro výskyt bakterií jsou důležité fyzikálně-chemické vlastnosti těchto různých anatomických struktur, které určují, zda se právě na nich konkrétní bakterie vyskytují. První velký vliv na složení a následný vývoj orálního mikrobiomu má způsob porodu dítěte. Lišit se bude také orální mikrobiom dítěte, které bylo krmeno mateřským mlékem od toho, které bylo krmeno umělou stravou. Na orální mikrobiom nicméně působí spousta dalších faktorů, např. geografie, etnická příslušnost, genetika, strava, hygiena, ortodontická léčba, užívání antibiotik, probiotika a v neposlední řadě konzumace alkoholu a kouření. Orální mikrobiom je důležitý i vzhledem k celkovému zdraví. Pokud je narušena homeostáza, může dojít k onemocnění, nejznámější a nejčastější jsou zubní kaz a periodontitida. Dysbióza orálního mikrobiomu má ovšem vliv i na systémová onemocnění, jakými jsou např. kardiovaskulární onemocnění, rakovina, pneumonie nebo Diabetes mellitus. 10

2. Cíle práce Cílem této bakalářské práce je pomocí nejrecentnější dostupné literatury shrnout poznatky o orálním mikrobiomu a jeho vlivu na zdraví člověka. 11

3. Orální mikrobiom Mikroorganismy nacházející se v lidské dutině ústní nazýváme orální mikroflóra, orální mikrobiota nebo orální mikrobiom. Termín mikrobiom byl vytvořen laureátem Nobelovy ceny Joshuou Lederbergem jako označení pro ekologické společenství komenzálních, symbiotických a patogenních mikroorganismů, které sdílejí naše vnitřní prostředí a v minulosti zůstávaly zcela bez povšimnutí jakožto faktory zdraví a nemoci (Lederberg a McCray 2001). V lidských ústech bylo identifikováno přes 700 bakteriálních druhů, z nichž více než 250 druhů bylo izolováno, kultivováno a pojmenováno (Paster a kol. 2006). 3.1. Bakterie orálního mikrobiomu Orální mikrobiom je tvořen velkým množstvím mikroorganismů, vedle bakterií se zde nacházejí i zástupci domény Archaea, viry, mikromycety nebo prvoci (Wade 2013). Se vstupem do nového tisíciletí přišly i nové možnosti pro zkoumání orálního mikrobiomu. Vnikly nové technologie sekvenování a rozsáhlé analýzy genomu (Keijser a kol. 2008). Recentní studie odhalily, že většina mikroorganismů orálního mikrobiomu je nekultivovatelných a orální mikrobiom je rozmanitější, než se původně myslelo (Huttenhower a kol. 2012, Nasidze a kol. 2009). V ústní dutině se nachází šest hlavních bakteriálních kmenů: Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes a Fusobacteria, dále jsou méně zastoupeny kmeny Euryarchaeota, Chlamydia, Chloroflexi, Synergistetes a Tenericutes. Konkrétně z kmene Firmicutes jsou zastoupeny tyto jeho třídy: Clostridia, Bacilli i Erysipelotrichia. Nejrozšířenějším rodem vyskytujícím se v ústech je rod Streptococcus ze třídy Bacilli. Hojně jsou též zastoupeny rody Abiotrophia, Gemella, Granulicatella (Dewhirst a kol. 2010). Abiotrophia a Granulicatella vyžadují k růstu přidání pyridoxalu ke krevnímu agaru a byly známy jako nutričně odlišné streptokoky (Collins a Lawson 2000, Ruoff 1991). Ze třídy Erysipelotrichia byly izolovány následující mikroorganismy: Buleidia extructa, Solobacterium moorei, Erysipelothrix tonsillarum a Eggerthia catenaformis. Největší čeledí třídy Clostridia je čeleď Veillonellaceae (dříve známá pod názvem Acidaminococcaceae). Většina lidských orálních klostridií spadá do čeledě Lachnospiraceae, Peptostreptococcaceae a Veillonellaceae. Všichni zástupci čeledě Veillonellaceae jsou gramnegativní a zahrnuje druhy Anaeroglobus, Centipeda, Dialister, Megasphaera, Selenomonas a Veillonella. Je překvapující, že se čeleď 12

s gramnegativními zástupci vyskytuje v jinak grampozitivním kmeni (Dewhirst a kol. 2010). Zástupci rodu Mycoplasma z kmene Tenericutes byli detekováni ve slinách 97 % jedinců (Watanabe a kol. 1986). Konkrétně byly zjištěny druhy Mycoplasma hominis, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma faucium. Orálně významné taxony zastupující kmen Actinobacteria byly nalezeny v řádech Actinomycetales. Bifidobacteriales a Coriobacteriales. Řád Actinomycetales zahrnuje rody Actinomyces, Rothia, Kocuria, Arsenicicoccus, Microbacterium, Propionibacterium, Mycobacterium, Dietzia, Turicella, Corynebacterium. Řád Bifidobacteriales obsahuje rody Bifidobacterium, Gardnerella, Scardovia a Parascardovia (Dewhirst a kol. 2010). Tyto řády jsou nalézány primárně v zubních kazech a v zubním plaku (Mantzourani a kol. 2009) s výjimkou rodu Gardnerella, který je primárně izolován z pochvy. Řád Coriobacteriales v orálním mikrobiomu zahrnuje následující rody: Atopobium, Cryprobacterium, Eggerthella, Olsenella a Slackia (Dewhirst a kol. 2001). Z kmene Fusobacteria byly nalezeny následující dva rody často se nacházející v dutině ústní: Fusobacterium a Leptotrichia. 107 taxonů kmene Bacteroidetes spadá do rodu Prevotella, Bacteroides, Porphyromonas, Tannerella, Bergeyella, Capnocytophaga a osm je nepojmenovaných. Prevotella je nejzastoupenější rod s přibližně padesáti druhy, z nichž je většina kultivovatelná (Dewhirst a kol. 2010). Bergeyella zoohelcum, je součástí orálního mikrobiomu psů a po psím kousnutí může být pro člověka patogenní (Vandamme a kol. 1994). Dva taxony zmíněného rodu vyskytující se v lidských ústech jsou nekultivovatelné. Všech pět tříd kmene Proteobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria a Epsilonproteobacteria, obsahuje taxony detekované v lidské dutině ústní. Ze třídy Betaproteobacteria to jsou konkrétně rody Nesseria, Eikenella, Kingella, Simonsiella, Achromobacter, Bordetella, Lautropia, Burkholderia, Ralstonia, Delftia, Variovorax, Leptothrix. Většina těchto rodů je aerobních. Gammaproteobacteria zahrnuje taxony následujících pěti čeledí: Xanthomonadaceae, Cardiobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Moraxellaceae, Enterobacteriaceae a Pasteurellaceae (Dewhirst a kol. 2010). V čeledi Xanthomonadaceae se nachází Stenotrophomonas maltophilia, což je ubikvitní mikroorganismus, který je oportunním patogenem způsobující nosokomiální 13

infekce (Senol 2004). Deltaproteobacteria zahrnuje druhy rodů Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfolobus a Bdellovibrio. Nacházíme však i zástupce třídy Epsilonproteobacteria z rodů Campylobacter, Helicobacter (Dewhirst a kol. 2010) a nesprávně pojmenovaný Bacteroides ureolyticus, který patří do rodu Campylobacter (Vandamme a kol. 1995). Všechny taxony bakteriálního kmene Spirochaetes nacházející se v lidských ústech jsou zástupci rodu Treponema. Z těchto taxonů je zatím více než 70 % nekultivovatelných (Dewhirst a kol. 2010). Z kmene Chlamydia byla v zubním plaku detekována Chlamydophila pneumoniae, která je uznávaným patogenem v plicích (Mäntylä a kol. 2004). V poměrně novém kmeni Synergistetes můžeme nalézt původně špatně zařazené rody kmenů Deferribacteres nebo Firmicutes (Hugenholtz a kol. 1998). Z úst člověka byly například izolovány tyto konkrétní druhy: Jonquetella antropi (Jumas-Bilak a kol. 2007) a Pyramidobacter piscolens (Downes a kol. 2009). Protože prakticky všichni jíme také rostlinnou stravu, není překvapující přítomnost sekvencí chloroplastové 16S rrna, jež se mohou vyskytovat v ústní dutině. Identifikovanými rody jsou Tritium aestivum (pšenice) a Manihot esculenta (kasava, zdroj tapioky). Mikrobiologickými experimenty bylo kultivováno 29 50 % orálních taxonů z kmenů Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria a Fusobacteria. Méně než 12 % taxonů bylo dosud vykultivováno z kmenů Spirochaetes a Synergistete. Chloroflexi zatím nemají žádného kultivovatelného zástupce (zástupci kmene Chloroflexi mohou být kultivovatelní, ale ne ti vyskytující se v lidských ústech) (Dewhirst a kol. 2010). 3.2. Bakteriální složení orálního mikrobiomu v závislosti na místě výskytu V rámci dutiny ústní je možné pozorovat rozdílné zastoupení jednotlivých mikroorganismů. Důvodem této variability jsou rozdílné fyzikálně-chemické vlastnosti různých anatomických struktur úst (Obr. 1). Jedná se například o ph, teplotu a redoxní potenciál (Kleinberg a Jenkins 1964, Fejerskov a kol. 1994). Na distribuci bakterií má vliv i přítomnost kyslíku. Mezi místa vystavená většímu množství kyslíku patří vnější strany zubů, řezáky a špičáky, která jsou osídlena aerobními či fakultativně anaerobními druhy, jako jsou např. streptokoky. Naopak, na vnitřní straně zubů, s omezeným 14

přístupem kyslíku, jsou typičtí obligátní anaerobové, např. Fusobacterium (Simón-Soro a kol. 2013). Rozdílné zastoupení bakterií nalézáme v subgingiválním plaku, supragingiválním plaku, na bukální sliznici, gingivě, dorsální části jazyka, tvrdém patře, ve slinách, krku a na mandlích. Plak se silně odlišuje bakteriálním složením od jiných částí úst a zároveň vykazuje větší diverzitu. Mikrobiom bukální sliznice se podobá mikrobiomu gingivy, zatímco další skupinu s podobným bakteriálním složením tvoří mandle, krk s tvrdým patrem, dorsální částí jazyka a slinami (Eren a kol. 2014). Obr. 1: Anatomie dutiny ústní (PDQ Screening and Prevention Editorial Board, 2002; upraveno). Ústní dutina se skládá z následujících anatomických struktur: rty, zuby, dáseň, bukální sliznice, mandle, jazyk, tvrdé a měkké patro, retromolární trojúhelník, čípek a dolní stěna (spodina) dutiny ústní. 3.2.1. Zubní plak Zubní plak je druh biofilmu narůstající na povrchu zubu (Yang a kol. 2011). Rozlišujeme plak subgingivální pod vyvýšeným okrajem dásně okolo zubu, v dásňovém žlábku a supragingivální nad vyvýšeným okrajem dásně okolo zubu (Obr. 2) (Filoche a kol. 2010). Mikrobiální složení plaku zdravé skloviny a kazu je značně odlišné, s postupujícím vývojem kazu se diverzita bakterií snižuje a dochází ke změně v zastoupení dominantních druhů (Aas a kol. 2008, Gross a kol. 2010). 15

V supragingiválním plaku se nacházejí především aerobní či fakultativně anaerobní bakterie z kmene Firmicutes a Actinobacteria. Supragingivální plak je vysoce diverzní, vyskytuje se zde až 7 000 druhů bakterií, mezi nejčastější rody patří Abiotropia, Capnocytophaga, Corynebacterium, Haemophilus, Lautropia, Leptotrichia, Neisseria, Rothia, Simonsiella i Streptococcus. (Aas a kol. 2008, Gross a kol. 2010, Keijser a kol. 2008). Složení supragingiválního plaku je ovlivněno i zdravotním stavem. V subgingiválním plaku se vyskytují anaerobní rody bakterií. Konkrétně můžeme v subgingiválním plaku nalézt rody Alloprevotella, Atopobium, Capnocytophaga, Dialister, Eubacterium, Filifactor, Fusobacterium, Parvimonas, Peptococcus, Porphyromonas, Prevotella, Selenomonas, Tannerella, Treponema a Streptococcus intermedius (Eren a kol. 2014). Obr. 2: Rozlišení zubního plaku. Zubní plak rozlišujeme subgingivální v dásňovém žlábku a supragingivální nad vyvýšeným okrajem dásně. Převzato z: https://www.lion.co.jp/en/oral/self/05.htm (25. 4. 2018) Významný rozdíl v bakteriálním složení v plaku je pozorován i v závislosti na tom, zda se nachází na vnitřní, vnější nebo aproximální části zubů a také hraje roli to, zda se jedná o řezák či stoličku. Rozdíly jsou způsobeny tokem slin, pohybem rtů, tváří nebo žvýkací sílou, které silněji působí na vnější stranu zubů. (Zaura a kol. 2009). Například rod Streptococcus u vzorků supragingiválního plaku na vnější straně zubů tvoří 29 70 % z celkového bakteriálního složení, na vnitřní straně byl však zastoupen méně, do 51%. Bakteriální složení plaku zubů třenových a stoliček je podobnější než bakteriální složení plaku řezáků a špičáků. U první zmínění dvojice je také pozorováno větší zastoupení rodů Capnocytophaga a Aggregatibacter (Simón-Soro a kol. 2013). 16

3.2.2. Dáseň a bukální sliznice Gingiva neboli dáseň, je součástí funkční, tzv. mastikační, sliznice. Tato sliznice je keratinizovaná a odolná vůči mechanické zátěži při rozkousávání potravy. Na povrchu zubní korunky gingiva přisedá ztenčeným okrajem ke sklovině Bukální sliznice je výstelka vnitřní strany tváří. Bakteriální složení je na obou místech obdobné a vyskytují se zde bakteriální rody Streptococcus, Gemella a Haemophilus (Eren a kol. 2014). Bakteriální rody, nacházející se jakožto součást gingivy, jsou : Granulicatella, Veillonella, Alloprevotella, Porphyromonas, Neisseria, Fusobacterium, Campylobacter, Prevotella.. 3.2.3. Mandle, tvrdé patro, krk, dorsální strana jazyka, sliny Mandle jsou párovým orgánem lymfatického systému. Jsou prvním místem, kde se zachytávají antigeny, které přicházejí do organismu ústní a nosní dutinou. Patro je horizontální přepážka oddělující dutinu ústní od dutiny nosní. Má dvě části, měkké a tvrdé patro. Měkké patro je v zadní části. Tvrdé patro se nachází v části přední a je vyztuženo kostěným patrem. Jazyk je svalový orgán krytý sliznicí, na které se nachází mnohovrstevný dlaždicový epitel. Sliznice přechází ze spodní plochy jazyka ve sliznici spodiny úst. Pomocí svých svalů je spojen s dolní čelistí, jazylkou, měkkým patrem, processus styloideus a se stěnou hrtanu. Sliny jsou produktem slinných žláz dutiny ústní. Obsahují vodu, enzymy, hlen a minerální látky. Tato skupina orgánů má podobné bakteriální složení. Ve všech se vyskytovaly následující bakteriální rody: Streptococcus, Veillonella, Neisseria, Prevotella, Fusobacterium, Granulicatella, Campylobacter, Porphyromonas, Rothia, Actinomyces, Oribacterium, Gemella, Atopobium, Leptotrichia, Prevotella, Catonella, Lachnoanaerobaculum, Solobacterium, Mogibacterium, Haemophilus, Peptostreptococcus, Eubacterium, Alloprevotella, Megasphaera, Parvimonas, Terrahaemophilus a Treponema. Zajímavé je zjištění výskytu mikrobiálních společenství charakteristických pro subgingivální plak také na mandlích. I mandle tak poskytují habitat pro anaeroby orálního mikrobiomu (Eren a kol. 2014). Potvrzuje se tak studie tvrdící, že je možné anaeroby získat stěrem z mandlí (Reilly s kol. 1981). Další studie ukazuje, že krypty na mandlích jsou prostředím, které je výhodnější pro 17

periodontální mikrobiotu, než je mukózní povrch (Jensen a kol. 2013). Průkaz anaerobů na mandlích zdravých jedinců dokazuje, že kolonizace mandlí těmito bakteriemi není v podstatě patogenní, namísto toho reprezentuje fyziologický mechanismus pro podporu kontaktu potenciálních patogenů s lymfatickou tkání (Eren a kol. 2014). 3.3. Výskyt orálních patogenů u zdravých lidí I u jedinců bez orálních onemocnění lze nalézt potenciální patogeny vyskytující se v malém množství vzorků s vysokou abundancí. Například Moraxella catarrhalis dominovala ve dvou vzorcích z krku a Haemophilus aegyptius tvořil 35 % jednoho vzorku z krku. Porphyromonas gingivalis byla zjištěna u 11 % jedinců s maximální abundancí 10,5 % ve vzorku subgingiválního plaku. Streptococcus mutans se vyskytoval u 10 % jedinců ve vzorku plaku (Eren a kol. 2014). 3.4. Bakterie orálního mikrobiomu ve vzorcích stolice Z hlediska zdraví se jeví jako nejdůležitější střevní mikrobiom, který se podílí například na vývoji imunitní reakce, na trávení potravy a produkci vitamínů apod. Je tedy důležitá otázka, jestli se konkrétní bakterie nacházejí jak v orálním, tak ve střevním mikrobiomu. Bylo zjištěno, že bakterie vyskytující se v ústech dospělých jedinců jsou pouze ve stopovém množství zároveň ve stolici a naopak. Jediný druh, Dialister invisus, byl nalezen ve zhruba stejných poměrech v subgingiválním plaku i ve stolici. Výsledky ukazují, že orální prostředí a stolice jsou habitaty samostatných druhů, navzdory zjevným podobnostem na úrovni rodu (Eren a kol. 2014). 18

4. Vývoj orálního mikrobiomu Orální mikrobiom se vyvíjí zejména v prvních letech našeho života. Kolonizace dutiny ústní začíná záhy po porodu (Cephas a kol. 2011). Vývoj orálního mikrobiomu je značně ovlivněn způsobem porodu, stravou novorozence a v neposlední řadě matkou, která je významným zdrojem bakteriálního osídlení (Zaura a kol. 2014). Během dětství se orální mikrobiom mění a vyvíjí. Diverzita bakterií stoupá s věkem dítěte, skupina počátečních kolonizátorů významně ovlivňuje složení orální mikrobiom v dospělosti (Sampaio-Maia a Monteiro-Silva 2014). Ukázalo se, že bakterie orálního mikrobiomu osidlují i střevní mikrobiom novorozenců, který se z počátku podobá tomu v dutině ústní, až po dvou týdnech dochází ke kolonizaci bakteriemi typickými pro střevní mikrobiom (Costello a kol. 2013). 4.1. Bakteriální kolonizace novorozence a způsob porodu Již bylo zmíněno, že způsob porodu hraje významnou roli v tom, které bakterie začnou osidlovat orální mikrobiom dítěte. Podobně jako je tomu i u střevního mikrobiomu (Dominguez-Bello a kol. 2010) Po porodu je dítě vystaveno velkému množství mikroorganismů a tato první interakce s nimi má vliv na vývoj jeho imunitní odpovědi (Mold a kol. 2008). 4.1.1. Přirozený porod U dětí narozených přirozeným způsobem porodu, kdy dítě prochází porodními cestami, byly pozorovány bakterie podobné těm, které se vyskytují v pochvě matky, hlavně rody Lactobacillus, Prevotella a Sneathia (Dominguez-Bello a kol. 2010). Děti narozené přirozeně vykazují navíc ve třech měsících větší taxonomickou diverzitu orálního mikrobiomu, než je tomu u dětí narozených císařským řezem (Lif Holgerson a kol. 2011). 4.1.2. Císařský řez Pokud se jedná o porod, který proběhl císařským řezem, tak první bakterie, se kterými se dítě setká, jsou bakterie kůže matky a to: Staphylococcus, Corynebacterium, Propionibacterium (Dominguez-Bello a kol. 2010) a Slackia exigua. Poslední zmíněný druh se nacházel pouze v mikrobiomu dětí narozených císařským řezem a to s vysokou prevalencí (Lif Holgerson a kol. 2011). Tento striktní anaerob byl také izolován z infekcí zubních kanálků, periodontitid, střevních abscesů a z extraorálních chirurgických ran (Abiko a kol. 2010, Kim a kol. 2010) Vysvětlení vysokého výskytu 19

zmíněného druhu u dětí narozených císařských řezem je spojeno s nedostatečnou bakteriální diverzitou orálního mikrobiomu, která nedokáže potlačit kolonizaci tímto patogenním druhem (Lif Holgerson a kol. 2011). Skupina mutantních streptokoků, což je skupina viridujících orálních streptokoků, která je patogenetický činitel zubního kazu, byla u dětí rozených císařským řezem pozorována v nižším věku a s vyšší frekvencí, než je tomu u dětí narozených přirozeným porodem. Císařský řez totiž snižuje expozici mateřskými komenzálními bakteriemi a je tudíž snížena přirozená bariéra proti orálním patogenům (Li a kol. 2005). Podobně byla nižší diverzita bakterií zjištěna také ve střevním mikrobiomu dětí, které se narodily císařským řezem (Dominguez-Bello a kol. 2010). 4.2. Poporodní bakteriální kolonizace Mezi první kolonizátory dutiny ústní po porodu byly identifikovány grampozitivní koky, zahrnující streptokoky a stafylokoky (Hegde a Munshi 1998, Merglova a Polenik 2016). Tyto prvotní mikroorganismy mění prostředí ústní dutiny produkcí svých metabolitů, která je stimulována oligosacharidy (Carlsson a kol. 1970), jež dítě přijímá ve stravě, ať už se jedná o mléko mateřské nebo mléko umělé. Umožňuje se tak dalším mikroorganismům kolonizovat ústa novorozence. Například Streptococcus salivarius má schopnost adherovat k epiteliálním buňkám. Produkuje extracelulární polymery ze sacharózy, ke kterým mohou adherovat další bakterie, například Actinomyces. Tímto způsobem se zvyšuje diverzita orálního mikrobiomu a formuje se tak komplexní a stabilní mikrobiom (Jenkinson a Lamont 1997, Kreth a kol. 2009). Od prvních let života po dospělost prochází orální mikrobiom změnami a stává se diverzifikovanějším (Cephas a kol. 2011, Lif Holgerson a kol. 2015). Například druh Escherichia coli a rody Staphylococcus, Pseudomonas a bakterie produkující kyselinu mléčnou: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Streptococcus, vyskytující se na kůži, ve střevě, v mateřském mléce, jsou dominantní během prvních měsíců života, ještě před prořezáním zubů (Dominguez-Bello a kol. 2010, Martín a kol. 2003, Ward a kol. 2013). Zato kmeny Fusobacteria, Tenericutes, Synergistetes s rody Veillonella, Fusobacterium, Neisseria, Prevotella, Rothia, Treponema a S.mutans začínají dominovat po prvních letech života, kdy dítě roste a je vystavováno postupně více externím faktorům (Crielaard a kol. 2011, Rôças a kol. 2016, Yang et al. 2012). 20

Okolo pátého měsíce věku dítěte je vlivem vnějších podmínek orální mikrobiom odlišný od mikrobiomu matky. Složení orálního mikrobiomu je ovlivněno příjmem potravy, kontaktem s jinými dětmi a dospělými, kontaktem s domácími zvířaty nebo hygienou. Pro toto období jsou charakteristické kmeny Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Fusobacteria a Spirochaetes. Nejvíce zastoupenými rody jsou Streptococcus, Haemophilus, Neisseria a Veillonella (Cephas a kol 2011). Některé z těchto mikroorganismů, například S. mitis a S. oralis, produkují imunoglobulin A proteázy, které specificky štěpí IgA produkované slinami. Toto umožňuje bakteriím přežít v prostředí bohatém na IgA (Cole a kol. 1994). S prořezáváním prvních zubů se objevuje i nový povrch pro adhezi bakterií, hlavně pro kariogenní streptokoky, konkrétně Streptococcus mutans (Caufield a kol. 1993). Původně se myslelo, že kariogenní druhy začínají kolonizovat dutinu ústní v této fázi, protože jejich preferovaný povrch pro adhezi jsou zuby. Zjistilo se ale, že měkká tkáň může sloužit jako rezervoár těchto orálních patogenů (Gizani a kol. 2009). Proto je nutná důkladná hygiena i před tím, než se dítěti prořežou první zuby (Sampaio-Maia a Monteiro-Silva 2014). Orální mikrobiom je také ovlivněn tím, zda má dítě stále mléčný chrup nebo již druhé zuby. Děti s mléčnými zuby mají vyšší výskyt třídy Gammaproteobacteria, hlavně čeledě Pseudomonadaceae, Moraxellaceae s rody Moraxella, Actinobacter a Enhydrobacter. Dále jsou více zastoupeny čeledě Enterobacteriacea a Pasteurellaceae. Jak se postupně mění mléčný chrup ve stálý, zvyšuje se počet bakterií čeledě Veillonellaceae, rodů Veillonella, Selenomonas a rodu Prevotella. Naopak se snižuje počet bakterií čeledě Carnobacteriace a rodu Granulicatella (Crielaard a kol. 2011). Puberta je známá jako doba hormonálních změn, to vede k nárůstu některých skupin mikroorganismů, jimiž jsou gramnegativní anaerobové a spirochety, tato změna způsobuje vyšší výskyt gingivitidy během puberty (Mombelli a kol. 1989). 21

Obr. 3: Schéma osidlování dutinu ústní bakteriemi v čase (autor). Schéma ukazuje rozdílné bakteriální osídlení po přirozeném porodu, porodu císařským řezem a následné významné změny, které probíhají v prvních měsících života, po pěti měsících života, kdy dítě začne přijímat pevnou stravu, po prvním roce a po prořezání stálého chrupu. 4.3. Vliv matky na orální mikrobiom dítěte Zásadní vliv na vývoj orálního mikrobiomu dítěte má matka, protože je s dítětem ve stálém kontaktu. Recentními výzkumy byla zjištěna velká podobnost mezi orálním mikrobiomem dítěte a mikrobiomem mateřského mléka, matčiným orálním mikrobiomem a mikrobiotou kolonizující matčiny prsní dvorce, na rozdíl od střevního mikrobiomu dítěte, který vykazuje nízkou podobnost s mikrobiomem matky. Patrně je to způsobeno pravidelným kontaktem těchto oblastí (Drell a kol. 2017). Matka má na dětský střevní mikrobiom vliv již v prenatálním období. Zprvu byl vyvíjející se plod považován za zcela sterilní. Toto tvrzení však bylo vyvráceno po objevení bakterií v mekoniu (první dětské stolici, obvykle do 24-48 hodin po narození). Při osidlování střevního mikrobiomu ještě nenarozeného dítěte je důležitý mikrobiom placenty, která byla v minulosti považována ze sterilní. Recentní studie zjistila, že mikrobiom placenty se podobá orálnímu mikrobiomu matky. Tuto teorii podporuje výskyt typických orálních bakterií, jako jsou Neisseria a Prevotella, popř. Fusobacterium, v placentě (Aagaard a kol. 2014). Bakterie orálního mikrobiomu matky se díky poškození dásně nebo onemocněními jako těhotenská gingivitida či periodontitida, dostanou krevním oběhem do placenty a ovlivňují ještě nenarozené dítě. Výskyt například patogenního druhu Fusobacterium nucleatum v placentě se ukázal jako příčina infekcí a následně předčasných porodů. Důležité bylo i zjištění, že 22

F. nucleatum při experimentech na myších nekolonizovalo žádný jiný orgán, například slezinu nebo játra, ale právě jen placentu (Han a kol. 2004). F. nucleatum produkuje adheziny FadA, ty se vážou na vaskulární-endoteliální kadherin, tím změní permeabilitu endotelu, což umožní dalším druhům překonat endoteliální bariéru a tak může dojít ke kolonizaci například E. coli, která se může dále systémově šířit (Fardini a kol. 2011). Dále dokazuje původ mikrobiomu placenty z orálního mikrobiomu i přítomnost rodu Bergeyella, kdy byla pozorována 100% identita 16S-23S rrna sekvencí jednoho kmene Bergeyella ze vzorku periodontálního subgingiválního plaku pacientky s nitroděložní infekcí a její plodovou vodou. Naopak, tento bakteriální kmen nebyl nalezen v jejím vaginálním traktu (Han a kol. 2006). Orální infekce matky v těhotenství mohou být pro dítě potenciálním nebezpečím a je tedy velmi důležitá pravidelná prevence u zubaře (Wrzosek a Einarson 2009). 4.3.1. Užívání antibiotik matkou a vliv na orální mikrobiom dítěte Širokospektrá antibiotika jsou profylakticky předepisována více než 40 % těhotných žen v době porodu (Ledger a Blaser 2013). Je známo, že antibiotika negativně ovlivňují střevní mikrobiom. Podávání antibiotik v době porodu však přispívá k rozdílné mikrobiální kolonizaci i orálního mikrobiomu novorozence. Právě rozdíl mezi bakteriemi detekovanými u dětí narozených císařským řezem a přirozeným způsobem je možná i z toho důvodu, že antibiotika jsou běžně používána u porodu císařským řezem k prevenci infekcí v prvních měsících po porodu. Používaná antibiotika jsou cílena proti streptokokům, kteří, jak je již popsáno výše, mají zásadní vliv na správný vývoj orálního mikrobiomu (Gomez-Arango a kol. 2017). V důsledku poklesu výskytu streptokoků se stávají dominantními čeledě kmene Proteobacteria, což bývá příčinou dysbiózy a zánětů (Shin a kol. 2015). Tato antibiotika působí také na rod Lactobacillus, který je důležitý ke správné kolonizaci střevního mikrobiomu (Gomez- Arango a kol. 2017, Penders a kol. 2006) Užívání antibiotik první dny po porodu bylo navíc asociováno s vysokou prevalencí sepsí s pozdním nástupem vyvolaných antibioticky rezistentními mikroorganismy, například rodem Pseudomonas (Shah a kol. 2013). 4.3.2. Chování matky a přenos bakterií na dítě Podobnost orálního mikrobiomu matky a dítěte může být důsledkem matčina chování související s péčí o dítě. Jedná se například o líbání dítěte na rty, používání stejné lžičky při krmení a olizování dudlíku (Drell a kol. 2017). 23

Byla nalezena spojitost mezi chováním matky, jejím věkem a vzděláním. Matky vyššího věku a s vyšším vzděláním častěji používaly ke krmení dětí stejnou lžičku a líbaly děti na rty, což je chování spojené s potenciálním bakteriálním přenosem (Virtanen a kol. 2015). Takovéto chování může vést k přenosu kariogenních druhů, například Sterptococcus mutans. Byl prokázán značný vliv na kolonizaci právě S. mutans a používání stejné lžičky s matkou nebo s jiným členem rodiny (Damle a kol. 2016). 4.4. Vliv výživy na orální mikrobiom dítěte Na vývoj mikrobiomu dítěte má bezpochyby vliv i způsob výživy. Byly pozorovány rozdíly mezi dětmi, které byly kojeny a těmi, které byly krmeny umělou výživou. Kromě jiných faktorů i způsob výživy má velký vliv na vývoj imunitního systému dítěte, kdy se např. případná dysbióza střevního mikrobiomu může projevit různými onemocněními. 4.4.1. Mateřské mléko Mateřské mléko je zdrojem látek důležitých pro správný vývoj novorozence a je mezi prvními zdroji mikroorganismů, se kterými se dítě setká. Navíc při kojení orální mikrobiom dítěte přispívá k osídlení střeva přímo, polykáním, i nepřímo, kontaminováním mléčných kanálků matčina prsu (Biagi a kol. 2017). Složení mikrobiomu mateřského mléka se liší od jiného lidského mikrobiomu a zdrojem bakterií se ukázal střevní trakt a dutina ústní (Cabrera-Rubio a kol. 2012). Bakterie z gastrointestinálního traktu jsou pohlceny lymfoidními buňkami a krví přenášeny do mléčných žláz, kde jsou následně zpětně uvolněny (Walker a Shuba Iyengar 2014). Zkoumané vzorky mikrobiomu mléka matek si byly svým složením navzájem více podobné, než tomu bylo u vzorků ze střevního a orálního mikrobiomu zkoumaných dětí (Biagi a kol. 2017). Nejčastěji se v mateřském mléku vyskytují fakultativně anaerobní a aerobní druhy bakterií, může dojít i ke kontaminaci bakteriemi z kůže. Nejčastěji izolovány jsou rody Streptococcus a Staphylococcus, rody čeledě Enterobacteriaceae a rod typický výskytem na kůži, Propionibacterium. Často jsou molekulárními metodami i kultivací získány bakteriální rody Bifidobacterium a Lactobacillus (Fitzstevens a kol. 2017). Pomocí sekvenování druhé generace byly detekovány další druhy, anaerobní Bacteroides, Blautia, Dorea a Faecalibacterium, tyto bakterie jsou nacházeny ve střevech člověka a potvrzují tak hypotézu o původu bakterií mateřského mléka ze střeva 24

matky (Jost a kol. 2013). Mikrobiom mateřského mléka může obsahovat bakterie, které se nevyskytují ani ve střevním nebo orálním mikrobiomu, konkrétně se u 83 % vzorků mateřského mléka vyskytoval rod Ralstonia, který by detekován s relativní abundancí více než 0,1 %, dále pak bakteriální rod Sediminibacterium v 61 % vzorků, s relativní abundancí 0,15 % (Biagi a kol. 2017). Sledovány byly též změny v orálním mikrobiomu po kojení. Vyskytovaly se hlavně více rody typické pro mikrobiom mateřskému mléka, např. čeledě Lachnospiraceae, Ruminococcacae, Oxalobacteraceae a Bacteroides. Děti, jež byly krmeny mateřským mlékem, měly v ústní dutině větší zastoupení aktinobakterií a enterobakterií (Al-Shehri a kol. 2016). Důležitá je také interakce slin a mateřského mléka při kojení. Recentní studie zjistila, že sliny novorozenců obsahují vysoké množství xantinu a hypoxantinu, tyto purinové báze, kterých je v ústech novorozence desetkrát více než v ústech dospělých, jsou substrátem pro enzym xantinoxidázu, jež je přítomna v mateřském mléce. Xantinoxidáza má antimikrobiální účinky, díky čemuž předchází mastitidám mléčných žláz, které jsou nejčastěji způsobované bakterií Staphylococcus aureus, a dochází k regulaci bakterií v mateřském mléce. Během kojení se vytváří peroxid vodíku - reaktivní formu kyslíku, která aktivuje laktoperoxidázový systém pro produkci dalších baktericidních reaktivních forem kyslíku. Tak je zajištěna antibakteriální aktivita v ústech novorozence ještě v období, kdy další imunitní mechanismy nejsou plně rozvinuty. In vitro experimentem byla prokázána například úplná inhibice patogenních bakterií Staphylococcus aureus a Salmonella. Největší koncentrace peroxidu vodíku je pozorována v prvních dnech po porodu, poté klesá okolo čtvrtého měsíce věku dítěte, tento pokles je zároveň spojen i s poklesem koncentrací xantinu a hypoxantinu v dětských slinách (Al-Shehri a kol. 2015). 4.4.2. Umělá výživa Důležité je, že umělá výživa neobsahuje všechny prospěšné bakterie, případně se vyskytují v malém množství. Základ umělé výživy tvoří většinou mléko kravské, to ale neobsahuje oligosacharidy charakteristické pro mateřské mléko. To má velký vliv na vývoj především střevního mikrobiomu dítěte, kdy děti krmeny umělou výživou mají nižší počet důležitých bifidobakterií, jejichž substrátem jsou právě oligosacharidy. V ústní dutině dětí krmených umělou výživou byla zjištěna větší prevalence kmene Bacteroidetes a rodu Prevotella oproti kojeným dětem (Al-Shehri a kol. 2016). 25

Nezbytné je zmínit, že u umělé výživy nebyla pozorována aktivita xantinoxidázy. Příprava a zpracování mléka vedou ke kompletní ztrátě aktivity tohoto enzymu, což znamená, že u dětí krmených umělou výživou nedochází k produkci peroxidu vodíku. Aktivita xantinoxidázy nebyla detekována ani u pasterovaného mateřského mléka, které se také používá jako náhradní výživa dětí, jejichž matky nemůžou ze zdravotních důvodů kojit. Pasterací dochází k inaktivaci enzymů a opět nevzniká peroxid vodíku (Al-Shehri a kol. 2015). Potvrzuje se i vliv orálního mikrobiomu na vývoj střevního mikrobiomu, protože u dětí krmených umělou stravou je větší riziko onemocnění nekrotizující enterokolitidou nejčastější a letální onemocnění předčasně narozených dětí. Takové děti jsou často na novorozeneckých jednotkách intenzivní péče krmeny pasterovaným mlékem, pomocí intubace, nedochází k výše popsané interakci slin s mlékem a je možné, že tato situace hraje roli ve vzniku nekrotizující enterokolitidy (Claud a kol. 2013, Meinzen-Derr a kol. 2009). 26

5. Faktory ovlivňující orální mikrobiom Kromě zmíněného způsobu porodu a matky, které ovlivňují orální mikrobiom dítěte, dále působí na orální mikrobiom řada dalších faktorů. Mezi ty základní patří strava, hygiena, konzumace alkoholu, kouření, ortodontická léčba, také geografie a v neposlední řadě genetika. Tyto faktory mají vliv na rozvoj nemocí dutiny ústní, jako je např. vznik zubních kazů či periodontitida. 5.1. Geografie a příslušnost k etniku Prokazatelné odlišnosti ve složení orálního mikrobiomu jsou v závislosti na klimatických podmínkách i na příslušnosti k etniku. Při porovnávání vzorků slin obyvatel Aljašky, Německa a Afriky vyšlo najevo, že mikrobiomy slin obyvatel Aljašky a Německa jsou si podobnější než mikrobiom jedné z těchto skupin v porovnání s Afričany. U obyvatel Aljašky a Němců je nejčastěji zastoupeným bakteriálním kmenem kmen Firmicutes, následně Bacteroidetes, Proteobacteria, poté Actinobacteria a nejméně detekován byl kmen Fusobacteria. U Afričanů je nejčastěji zastoupený kmen Proteobacteria, pak jsou sestupně zastoupeny kmeny Firmicutes, Bacteroidetes, Fusobacteria a Actinobacteria. Podobnost byla zjištěna i na úrovni rodu. 13 z 28 rodů nejběžněji se nacházejících ve vzorcích je pozorováno se srovnatelnou abundancí jak u Němců, tak u obyvatel Aljašky. Naopak Afričané sdílejí s obyvateli Aljašky jen šest rodů se srovnatelnou abundancí, konkrétně rody Neisseria, Campylobacter, Granulicatella, Megasphaera, Selenomonas, Actinomyces. Němci a Afričané mají společné jen tři bakteriální rody: Actinobacillus, Aggregatibacter, Capnocytophaga. Ve všech třech skupinách byla zjištěna podobná abundance rodů Streptococcus, Fusobacterium a Leptotrichia. Naproti tomu, u všech třech pozorovaných skupin, ale s odlišnými abundancemi, se vyskytuje následujících sedm rodů Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Gemella, Klebsiella, Rothia a Veillonella. Rozdíl je rovněž porovnáván v mikrobiomu slin mezi čtyřmi skupinami obyvatel Aljašky, od kterých byly vzorky odebírány. Při výzkumu byly dvě skupiny z vnitrozemských oblastí a další dvě skupiny z oblastí podél pobřeží. V případě těchto čtyř skupin tak nehraje roli strava, i když skupiny žijící při pobřeží konzumují více mořských ryb, ani geografie. Naopak u tří skupin obyvatel afrického kontinentu kmene Pygmejů Batwa z Ugandy, obyvatel Demokratické republiky Kongo a Sierra Leone, hraje geografie a strava důležitou roli (Li a kol. 2014). Bakteriální diverzita mikrobiomu slin kmene 27

Batwa je vyšší než u obyvatel Demokratické republiky Konga a Sierra Leone (Obr. 4). U kmene Batwa bylo detekováno celkem 127 bakteriálních rodů ze vzorků slin ve srovnání se 71 rody u obyvatel Sierra Leone a 54 rody u obyvatel Demokratické republiky Kongo. U kmene Batwa bylo navíc pozorováno 40 bakteriálních druhů, u kterých do té doby nebyl popsán výskyt v lidské dutině ústní (Nasidze a kol. 2011). Vliv na diverzitu v tomto případě má zmíněná strava a životní styl. Příslušníci kmene Batwa, kmene lovců a sběračů, konzumují stravu velmi bohatou na bílkoviny (Walker a Hewlett 1990), zatímco v Sierra Leone a Demokratické republice Kongo se obyvatelé živí zemědělstvím a stravu mají bohatou na sacharidy. Kromě toho je u kmene Batwa pozorován nízký výskyt zubních kazů (Nasidze a kol. 2011). Pro vznik kazů je důležité ph, jestliže se pohybuje v zásaditých hodnotách, tak dochází k ochraně proti tvorbě zubního kazu. Zásadité ph je v dutině ústní zajištěno tvorbou amoniaku z močoviny a argininu. Močovina je přítomna ve slinách a je rozkládána bakteriálními ureázami na amoniak a oxid uhličitý. Hlavními producenty ureáz v dutině ústní jsou Actinomyces naeslundii a Haemophilus (Burne a Marquis 2000). Právě rod Haemophilus se více vyskytuje u kmene Batwa, čímž je vysvětlen nízký výskyt zubních kazů. Z tohoto pozorování je zřejmé, že podobný životní styl a strava, jako je tomu u obyvatel Sierra Leone a Demokratické republiky Kongo, vedou k podobnému složení orálního mikrobiomu (Nasidze a kol. 2011). Obr. 4: Mapa vzorkovaných oblastí a přehled diverzity nejčastějších bakteriálních rodů (Nasidze a kol. 2011; upraveno). SL Sierra Leona, DRC Demokratická republika Kongo, BP kmen Batwa. Z koláčových grafů lze pozorovat, že bakteriální diverzita mikrobiomu slin kmene Batwa je vyšší než u obyvatel Demokratické republiky Kongo a Sierra Leone. Ve všech oblastech je mezi dominantními rody rod Enterobacter a Streptococcus. U příslušníků kmene Batwa je pozorován vyšší výskyt rodu Haemophilus v porovnání s obyvateli ostatních oblastí, častější jsou i rody Fusbacterium, Prevotella a Veillonella. U obyvatel Demokratické republiky Kongo je častý rod Serratia. 28

Dále byla zkoumána alpha diverzita. Ukazuje se, že diverzitu nejvíce ovlivňuje složení stravy. Diverzita je největší u obyvatel Německa, protože Němci konzumují širší spektrum látek než obyvatelé Afriky nebo Aljašky. Zejména velké množství různých sacharidů ovlivňuje diverzitu orálního mikrobiomu. Rozmanitější strava totiž poskytuje komplexnější řadu substrátů využívaných i méně abundantními bakteriálními druhy. Beta diverzita je naopak nejvyšší u vzorků Afričanů. Tento druh diverzity reflektuje heterogenitu orálního mikrobiomu v rámci zkoumané skupiny. Hlavní rody bakterií specifických pro obyvatele Afriky jsou z čeledě Enterobacteriaceae, jedná se o rody Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Salmonella Providencia a Escherichia. Právě čeleď Enterobacteriaceae odlišuje africkou populaci od jiných geografických oblastí. Důvodem vysoké abundance této čeledě není znám. Zdrojem může být kontaminovaná voda a jídlo. Kromě toho může být důležitým faktorem také venkovní teplota. Zástupci čeledě Enterobacteriaceae vyžadují teplotu nad 37 C, např. Escherichia coli má optimum růstu při 40,85 C. Venkovní teplota také ovlivňuje teplotu v ústech, vyšší ji lze logicky očekávat u obyvatel Afriky, čímž představuje vhodné prostředí pro růst bakterií této čeledi. Vliv má též konstantnost teploty vzduchu, u obyvatel oblastí blízko rovníku nelze předpokládat náhlé poklesy teploty v zimním období. To lze předpokládat při vcházení a opouštění vytápěných domů obyvatel Evropy (Li a kol. 2014). Ovšem i příslušnost k danému etniku vyvíjí selekční tlak na orální mikrobiom. Při srovnání skupin orálního mikrobiomu bělochů, Afroameričanů, Číňanů a obyvatel Latinské Ameriky se vyskytují odlišnosti v mikrobiomu subgingiválního plaku. U Afroameričanů nalezneme v subgingiválním plaku vyšší zastoupení rodu Actinomyces, druhů Haemophilus segnis, Streptococcus gordonii/sanguinis, Streptococcus sobrinus, Pro subgingivální plak u Číňanů je charakteristická vyšší abundance rodů Capnocytophaga, Treponema a druhů Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas catoniae, obyvatelé Latinské Ameriky mají zase více zastoupeny druhy Tannerella forsythensis, Peptostreptocccus stomatis a rod Treponema, u bělochů to jsou druhy Capnocytophaga sputigena, Corynebacterium durum, Selenomonas infelix. Patogenní rody Filifactor, Staphylococcus, Mycoplasma a Treponema jsou častější v plaku Číňanů a obyvatel Latinské Ameriky (Mason a kol. 2013). Potvrdila se tak pozorovaná náchylnost k nemocem, jako je např. periodontitida (Albandar 2002). Jen na základě složení mikrobiomu vzorků subgingiválního plaku bylo v dané studii možné určit příslušnost k etniku s celkovou 58% senzitivitou a 86% specifičností. Afroameričané 29

byli rozpoznáni se 100% senzitivitou a 74% specifičností, obyvatelé Latinské Ameriky se 67% senzitivitou a 80% specifičností, běloši s 50% senzitivitou a 91% specifičností (Mason a kol. 2013). 5.2. Genetika Zatímco vliv genetiky na střevní mikrobiom byl již prokázán (Goodrich a kol. 2014), názor na vliv genetiky na orální mikrobiom je rozporuplný. První studie zkoumala vliv genetiky na abundanci kariogenních taxonů v zubním plaku dvojčat. Dospěla k názoru, že jsou tyto taxony dědičné (Corby a kol. 2007). Pozdější výzkumy naopak poukazují na nevýznamnost vlivu genetiky na orální mikrobiom v porovnání s vlivem prostředí (Papapostolou a kol. 2011, Stahringer a kol. 2012). Nicméně nejrecentnější studie na dvojčatech označují genetiku jakožto faktor, který může ovlivňovat orální mikrobiom (Gomez a kol. 2017, Demmitt a kol. 2017). Byly nalezeny dva lokusy spojené s tímto tvrzením. Jeden se vyskytuje na chromozomu 7 a druhý na chromozomu 12 (Demmitt a kol. 2017). Důležité je, že nebyla zjištěna dědičnost patogenních druhů bakterií, čili genetika nemá vliv na rozvoj kazu nebo periodontitidy. Mezi nejvíce dědičné bakteriální druhy patří Prevotella pallens, rod Veillonella, čeleď Pasteurellaceae a druh Corynebacterium durum, druhy neasociované se zubními kazy. Abundance těchto dědičných bakterií s postupujícím věkem klesá, např. P. pallens byla nejčetnější ve skupině dětí starých 5 7 let, ve vyšších věkových skupinách se postupně abundance tohoto bakteriálního druhu snižuje. Jiný rod, Tannerella, je jediný bakteriální rod spojený se zubním kazem, který se také odlišuje svou abundancí v různých věkových skupinách, zde je ale pozorována vyšší abundance s vyšším věkem. Naproti tomu kariogenní streptokoky, jejichž abundance není proměnlivá s věkem, jsou ovlivněny především prostředím (Gomez a kol. 2017). Podobnost orálního mikrobiomu je vyšší u monozygotických dvojčat než u dvojčat dizygotických. Je možné, že tendence monozygotických dvojčat déle bydlet ve stejné domácnosti může mít na tuto skutečnost také vliv (Demmitt a kol. 2017). U některých prokazatelně dědičných taxonů se projevuje i závislost na frekvenci konzumaci cukru. Dědičné bakteriální rody Veillonella a Leptotrichia ukazují nižší abundanci u dvojčat, kterým byl do každého jídla či pití přidán cukr. Naopak, kariogenní rod Aggregatibacter zvýšil abundanci s vyšší frekvencí konzumace cukru (Gomez a kol. 2017). 30

5.3. Strava Strava má bezesporu významný vliv na složení orálního mikrobiomu. To, jak se naši předci stravovali, hrálo roli v evoluci orálního mikrobiomu. Při zkoumání zubního kamene z období pravěku bylo zjištěno, že před nástupem zemědělství byl nižší výskyt zubních kazů a periodontitidy, což souvisí s nízkou abundancí bakteriálních druhů způsobující zmíněná onemocnění u našich prapředků. V období neolitické revoluce totiž dochází k zařazování velkého množství sacharidů, jakožto součást jídelníčku člověka. Jelikož nastal přechod od lovců a sběračů k zemědělcům, strava se začala skládat především z obilovin bohatých právě na sacharidy. Další velkou změnou se ukázala být průmyslová revoluce související s výrobou rafinovaného cukru z cukrové řepy, cukrové třtiny a jeho následným zařazením do každodenní stravy. V porovnání se vzorky z období neolitu je orální mikrobiom moderního člověka méně diverzifikovaný a může obsahovat více oportunně patogenních bakterií, např. Streptococcus mutans a bakterie asociované s periodontitidou, Porphyromonas gingivalis, Treponema, Tannerella (Adler a kol. 2013). Vliv potravy na evoluci orálního mikrobiomu lze pozorovat i ve slinách, kde se vyvinuly hydrogenuhličitanové ionty vlivem selekčního tlaku, aby byly vyrovnány nízké hodnoty ph v dutině ústní související s příjmem potravin bohatých na sacharidy (Kaidonis a Townsend 2016). Strava může mít pravděpodobně vliv na samotné složení orální mikrobiomu. Příjem nasycených mastných kyselin má pozitivní korelaci s relativní abundancí kmenů Betaproteobacteria a Fusobacteria. Příjem vitamínu C má také pozitivní korelaci s abundancí třídy Fusobacteria, konkrétně s čeledí Leptotrichiaceae a další čeledí, Lachnospiraceae. Glykemický index má zase pozitivní korelaci s abundancí čeledě Lactobacillaceae. Není žádný důkaz o tom, že by byl orální mikrobiom diverzifikovanější např. díky zdravé stravě, jako je tomu u střevního mikrobiomu (Kato a kol. 2017, Claesson a kol. 2012). Dlouho už je pozorován vliv sacharidů na orální mikrobiom. Cukry totiž představují pro mikroorganismy snadno dostupný substrát. Jedinci často konzumující cukry vykazují vyšší abundanci acidogenních a acidurických bakterií, tedy takových, které mají schopnost produkovat kyseliny a tolerovat pokles ph, zejména laktobacilů a druhu Streptococcus mutans (Morhart a Fitzgerald 1976). Kyseliny produkovány těmito bakteriemi jsou považovány za příčinu zubních kazů (Wade 2013). Tuky z potravy sice nejsou tráveny v dutině ústní, ale sliny obsahují lipidy, jako jsou mastné kyseliny, cholesterol a triglyceridy, ve výrazně menších koncentracích, než 31