Zubní kaz v časném dětství a mikrobiální flóra. I. Sedláček, L. Žáčková, M. Kukletová, L. Klapušová, J. Kuklová, D. Nováková, P.

Transkript

1 Zubní kaz v časném dětství a mikrobiální flóra projekt 1M I. Sedláček, L. Žáčková, M. Kukletová, L. Klapušová, J. Kuklová, D. Nováková, P. Švec

2 Bakteriální mikroflóra zubů průkaz druhové diverzity typizace bakteriálních izolátů studium vlivu dominantní mikroflóry na dentální materiály duben červen, metodika, ověřování od července pacientů 32 vzorků

3 Bakteriální mikroflóra zubů -charakteristika extrémně heterogenní společenství převaha mikroaerofilních a fakultativně anaerobních izolátů převaha grampozitivních koků a tyček nad gramnegativními bakteriemi

4 Bakteriální mikroflóra zubů -izolace sběr materiálu stomatologické pracoviště dětské nemocnice stěr zpovrchu na transportní medium odběr zkanálku injekční stříkačkou transport do CCM ke zpracování izolace cíleně zaměřena na: -viridující koky -aktinomycéty -anaerobní bakterie

5 Bakteriální mikroflóra zubů -kultivace provádí se vccm nutné bezprostřední zpracování izolace dominantní mikroflóry mikroaerofilníkultivace anaerobní kultivace J pomnoženíabb 37 C, 5% CO 2 37 C, 80%N 2 +10%H 2 +10%CO 2 J VLAC J VLAC J VLGP L VLGN J MRS K VLGP K CHA L MRS

6 Bakteriální mikroflóra zubů -kultivace kritéria výběru bakteriálních kmenů morfologie odpovídající studovaným skupinám morfologicky shodné izoláty zpovrchu zubu akanálku morfologicky shodné izoláty zfrontálních adistálních zubů morfologicky neobvyklé izoláty grampozitivní tyčky až vlákna rostoucí na MRS agaru kryokonzervace vybraných izolátů při 70 C

7 Typizace bakteriálních izolátů -fenotypizace grampozitivníbakterie komerční soupravy konvenční testy koky STREPTOtest 16, KAT,HEM, PYR, VPT,... tyčky API 50CH, KAT,GLG, NH 3,15 C, 45 C,... anaeroby API 20A,ANAEROtest 23, KAT,...

8 Typizace bakteriálních izolátů výsledky fenotypizace koky (38) tyčky (22) anaeroby (5) S. peroris/infantis (9) L. salivarius (3) Actinomyces sp. (3) S. salivarius (5) L. casei (2) Clostridium sp. (1) S. mutans (5) L. cellobiosus (2) NI (1) S. mitis (3) L. plantarum (1) S. peroris (2) L. acidophilus (1) S. infantis (1) L. fermentum (1) S. sanguinis (1) Lactobacillus sp. (7) S. pneumoniae (1) NI koryneformní (3) Streptococcus sp. (8) NI nepravidelné (2) A. otitis (2) A. christensenii (1)

9 Typizace bakteriálních izolátů výsledky fenotypizace Streptococcus infantis a Streptococcus peroris původně skupina S. mitis, viridující osídlují povrch zubů, biochemicky podobné prokázán ve vzorcích ze 7pacientů

10 Typizace bakteriálních izolátů výsledky fenotypizace L. salivarius (3) L. cellobiosus (2) L. casei (2) L. acidophilus (1) L. plantarum (1) L. fermentum (1) Lactobacillus sp. (7)

11 Typizace bakteriálních izolátů výsledky fenotypizace anaerobní bakterie gramnegativní tyčky nezachyceny grampozitivní tyčky ojediněle

12 Typizace bakteriálních izolátů výsledky (GTG) 5 -PCR vhodné pro Lactobacillus spp. ijiné bakterie primery komplementární ke krátkým repetitivním sekvencím rozmístěny vmnoha kopiích vgenomu bakterií ERIC, BOX, REP,(GTG) 5,... druhová identifikace 7izolátů

13 Typizace bakteriálních izolátů výsledky (GTG) 5 -PCR lokální databáze CCM ~1500 LAB podobnost (%) P1371. P1372. P /A. P1374. P1319. P1324. P1310. P1323. P1386. P1325. P1373. P1320. P1326. P /C. P1321 Lcb. cellobiosus Lcb. cellobiosus. Lcb. fermentum. Lcb. plantarum x Lcb. fermentum Lcb. salivarius x Lcb. fermentum. Lcb. casei. Lcb. casei. Lactobacillus sp. x Lcb. fermentum. Lcb. salivarius x Lactobacillus sp.. Lcb. salivarius x Lactobacillus sp.. Lactobacillus sp.. Lactobacillus sp.. Lactobacillus sp.. Lactobacillus sp.. Lactobacillus sp.. Lactobacillus sp.. Lcb. acidophilus x Lactobacillus sp.

14 Typizace bakteriálních izolátů ribotypizace selektivní hybridizace a následná detekce restrikčních fragmentů genomové DNA nesoucích geny pro rrna buněčná kultura izolace DNA štěpení restrikčním enzymem gelová elektroforéza přenos na membránu hybridizace a detekce fragmentů obsahujících geny pro rrna

15 Bakteriální izoláty xdentální materiály dominantnímikroflóra -biofilm plánováno vnásledujícím období mléčné bakterie aviridující streptokoky studium adheze kolonizace povrchu produkce exopolymerů

16 DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST