Gram Stain Kits and Reagents 8820191JAA 2008/06 Èesky Gram Stain Kit 1 Kat. è. 212539 Gram Crystal Violet Pro diferenciaèní barvení bakterií. Gram Iodine (stabilizovaný) Gram Decolorizer Gram Safranin Gram Stain Kit 1 212524 Gram Crystal Violet Pro diferenciaèní barvení bakterií. Gram Iodine (nestabilizovaný) Gram Decolorizer Gram Safranin Gram Crystal Violet Pro diferenciaèní barvení mikroorganismù 4 x 250 ml 212525 dle Grama. 1 x 3.8 L 212526 Gram Iodine (stabilizovaný) Pro diferenciaèní barvení mikroorganismù 4 x 250 ml 212542 dle Grama. 1 x 3.8 L 212543 Gram Iodine ( nestabilizovaný) Pro diferenciaèní barvení mikroorganismù 4 x 250 ml 212529 dle Grama. 1 x 3.8 L 212530 Gram Decolorizer Pro diferenciaèní barvení mikroorganismù 4 x 250 ml 212527 dle Grama. 1 x 3.8 L 212528 Gram Safranin Pro diferenciaèní barvení mikroorganismù 4 x 250 ml 212531 dle Grama. 1 x 3.8 L 212532 Gram Basic Fuchsin Pro diferenciaèní barvení mikroorganismù 4 x 250 ml 212544 dle Grama. 1 x 3.8 L 212545 úèel použití Sady a èinidla pro Gramovo barvení slouží k barvení mikroorganismù z kultur nebo vzorkù pomocí diferenciaèního Gramova barvení. SHRNUTÍ A VYSVÌTLENÍ Gramovo barvení vynalezl v roce 1884 Christian Gram pøi pokusu o diferenciaci bakteriálních bunìk z infikované tkánì. Aèkoli Gram sledoval to, èemu dnes øíkáme Gramova reakce, nedocenil taxonomickou hodnotu svého postupu. Gramovo barvení se nyní používá k diferenciaci neporušených, morfologicky podobných bakterií do dvou skupin na základì barvy bunìk po barvení. Kromì toho jsou patrnými znaky také tvar, velikost a detaily struktury bunìk. Tyto pøedbìžné informace jsou dùležitými vodítky pro stanovení pøítomného typu organismu (organismù) a dalších postupù vyžadovaných k jejich stanovení. Jelikož anorganický jód rychle oxiduje a ztrácí svou úèinnost jako moøidlo 1, liší se sada Gram Stain Kit (Sada pro Gramovo barvení kat. è. 212539) od pùvodního pøípravku pro Gramovo barvení tím, že nabízí stabilnìjší organický jódový komplex, L-polyvinylpyrrolidon-jód. ZÁSADY postupu Postup Gramova barvení 2 se skládá z tìchto krokù: Barvení fixovaného nátìru krystalovou violetí. Aplikace jódu, který funguje jako moøidlo. Odbarvení primárního barvení alkoholem nebo acetonem a kontrastní barvení safraninem nebo bazickým fuchsinem. V protoplastu (ne v bunìèné stìnì) všech organismù barvených tímto postupem se vytváøí komplex krystalové violeti a jódu. Organismy, které jsou po odbarvení schopny zachovat tento komplex barviv, jsou oznaèeny jako gram-pozitivní organismy; naproti tomu organismy, které lze odbarvit a poté kontrastnì nabarvit, jsou oznaèeny jako gram-negativní. Po porušení nebo odebrání bunìèné stìny lze protoplast gram-pozitivních (i gram-negativních) bunìk odbarvit, a tak dojde ke ztrátì gram-pozitivity. Proto se jeví, že princip Gramova barvení souvisí s pøítomností neporušené bunìèné stìny, která je schopna fungovat jako bariéra odbarvení primárního barvení. Obecnì lze øíci, že bunìèná stìna je neselektivnì propustná. Má se za to, že bìhem Gramova barvení je bunìèná stìna gram-pozitivních bunìk v odbarvovacím roztoku dehydratována alkoholem a ztrácí svou propustnost, což má za následek zachování primárního barvení. Bunìèná stìna gram-negativních bunìk má však vyšší obsah lipidù a po aplikaci alkoholu se stává propustnìjší; to má za následek ztrátu primárního barvení. Molekulární základ Gramova barvení nebyl dosud stanoven.
Èinidla Pøibližné množství* na jeden litr Gram Crystal Violet PRIMÁRNÍ BARVENÍ Krystalová violeť.......................... 3,0 g Izopropanol............................. 50,0 ml Etanol/metanol.......................... 50,0 ml Destilovaná voda........................ 900,0 ml Gram Iodine MOØIDLO (pracovní roztok pøipravený z rozpouštìdla pro Gramovo barvení Gram Diluent a jódu pro Gramovo barvení Gram Iodine 100X) Krystaly jódu............................. 3,3 g Jodid draselný............................ 6,6 g Destilovaná voda.......................... 1,0 L Stabilized Gram Iodine MOØIDLO Komplex polyvinylpyrrolidon-jódu......... 100,0 g Jodid draselný........................... 19,0 g Destilovaná voda.......................... 1,0 L Gram Decolorizer ODBARVOVACÍ ROZTOK Aceton................................. 250,0 ml Izopropanol............................ 750,0 ml Gram Safranin KONTRASTNÍ BARVENÍ Práškový safranin O (èisté barvivo)........... 4,0 g Etanol/metanol......................... 200,0 ml Destilovaná voda........................ 800,0 ml Gram Basic Fuchsin KONTRASTNÍ BARVENÍ Bazický fuchsin............................ 0,08 g Fenol.................................... 2,6 g Izopropylalkohol.......................... 4,5 ml Destilovaná voda........................ 993,0 ml *Upraveno a/nebo doplnìno dle požadavkù tak, aby byla splnìna kritéria úèinnosti. Varování a bezpečnostní opatření: In vitro diagnostikum. U bazického fuchsinu Gram Basic Fuchsin používaného u Gramova barvení se tøemi kroky se èasem mùže vytvoøit jemný precipitát. Ten však úèinnost produktu neovlivní. Gram Crystal Violet (Krystalová violeť pro Gramovo barvení): Pøi vdechnutí nebo po požití je zdraví škodlivá. Dráždí oèi, dýchací soustavu a pokožku. Nebezpeèí nevratných nežádoucích úèinkù. Udržujte kontejner neustále tìsnì uzavøený. Uchovávejte mimo dosah zdrojù tepla kouøení je zakázáno. Nevdechujte plyny, výpary apod. Noste vhodný ochranný odìv a vhodné ochranné rukavice. Gram Iodine 100X (Jód 100X pro Gramovo barvení): Po vdechnutí, pøi styku s pokožkou a po požití je zdraví škodlivý. Udržujte kontejner neustále tìsnì uzavøený. Nevdechujte plyny, výpary apod. Chraòte pøed kontaktem s pokožkou a oèima. Noste vhodný ochranný odìv. Gram Iodine (Jód pro Gramovo barvení) stabilizovaný: Pøi styku s pokožkou je zdraví škodlivý. Zpùsobuje popáleniny. Dráždí oèi, dýchací soustavu a pokožku. Udržujte kontejner neustále tìsnì uzavøený. Nevdechujte plyny, výpary apod. Chraòte pøed kontaktem s pokožkou a oèima. Noste vhodný ochranný odìv. Gram Decolorizer (Odbarvovací roztok pro Gramovo barvení): Dráždí oèi, dýchací soustavu a pokožku. Udržujte kontejner neustále tìsnì uzavøený a uskladnìný na dobøe vìtraném místì. Uchovávejte mimo dosah zdrojù tepla kouøení je zakázáno. Nevdechujte plyny, výpary apod. Chraòte pøed kontaktem s pokožkou a oèima. Gram Safranin (Safranin pro Gramovo barvení): Pøi vdechnutí nebo po požití je zdraví škodlivý. Dráždí oèi, dýchací soustavu a pokožku. Udržujte kontejner neustále tìsnì uzavøený. Uchovávejte mimo dosah zdrojù tepla kouøení je zakázáno. Noste vhodný ochranný odìv a vhodné ochranné rukavice. Gram Basic Fuchsin (Bazický fuchsin pro Gramovo barvení): Mùže zpùsobit rakovinu. Mùže zapøíèinit dìdièné genetické poškození. Dráždí oèi. Udržujte kontejner neustále tìsnì uzavøený. Nevdechujte prach. Chraòte pøed kontaktem s pokožkou a oèima. Noste vhodný ochranný odìv. V pøípadì zasažení oèí je ihned vypláchnìte velkým množství vody a vyhledejte lékaøskou pomoc. Gram Iodine 100X (Jód 100X pro Gramovo barvení): Ihned si sundejte veškeré kontaminované obleèení. Dojde-li ke styku s pokožkou, okamžitì omyjte zasažené místo velkým množstvím vody. Pøi vdechnutí odveïte postiženého na èerstvý vzduch. Pokud postižený nedýchá, proveïte umìlé dýchání. Pokud je dýchání obtížné, aplikujte kyslík. Vyhledejte lékaøskou pomoc. V pøípadì požití vyhledejte ihned lékaøskou pomoc. Ukažte lékaøi kontejner nebo jeho štítek. Skladování: Po pøevzetí skladujte pøi teplotì 15 30 C. Datum expirace se vztahuje pouze na produkt v neotevøených lahvích uskladnìných dle pokynù. Otevøete až bezprostøednì pøed použitím. Tradièní pracovní roztok jódu pro Gramovo barvení použijte do 3 mìsícù po pøípravì; nesmíte však pøekroèit datum expirace žádné z jeho složek. Zhoršování kvality produktu: Po rekonstituci, nestabilizovaný jód Gram Iodine, že v roztoku již není k dispozici dostatečné množství jódu, může při Gramově barvení vyvolat různé výsledky. Nevystavujte roztok jódu nadměrnému působení vzduchu, světla a tepla. ODBÌR A PØÍPRAVA VZORKÙ Aplikujte testovaný vzorek na èisté podložní sklíèko proveïte tenký, rovnomìrný nátìr. Správnou denzitu získáte emulgací kolonií z 18 24 hodinové kultury ve fyziologickém roztoku. Nechejte nátìr volnì zaschnout. Zafixujte nátìr na sklíèku jedním z tìchto zpùsobù: 1. Tepelnì 2 3 krát pøejeïte sklíèko slabým plamenem. Pøed zahájením barvení nechejte podložní sklíèko ochladit na pokojovou teplotu. POZNÁMKA: Sklíèko nepøehøívejte; nadmìrné zahøátí mùže zpùsobit atypické zbarvení. 2. Metanolem na 1 2 minuty pøelijte sklíèko absolutním metanolem; pøed zahájením barvení opláchnìte vodou z kohoutku. 3 2
POZNÁMKA: Abyste dosáhli lepší fixace, skladujte absolutní metanol v hnìdé láhvi se šroubovacím uzávìrem a každé dva týdny pracovní roztok doplòujte. Postup Pøíprava èinidla Pøipravte tradièní pracovní roztok jódu pro Gramovo barvení pøidejte celou 2,5 ml ampuli jódu 100X (Gram Iodine 100X) do 250 ml rozpouštìdla pro Gramovo barvení (Gram Diluent) nebo celou 40 ml lahvièku jódu 100X do 3,8 L rozpouštìdla; dùkladnì promíchejte. Dodaný materiál: Krystalová violeť Gram Crystal Violet, jód Gram Iodine nebo stabilizovaný jód Gram Iodine, odbarvovací roztok Gram Decolorizer a safranin Gram Safranin nebo bazický fuchsin Gram Basic Fuchsin. Potøebný materiál, který není souèástí dodávky: Podložní sklíèka pro mikroskop, Bunsenùv kahan nebo metanol, bakteriologická klièka, tampóny, sací papír, mikroskop s imerzním objektivem a podložní sklíèko pro Gramovo barvení. Provedení testu: 1. Proveïte primární barvení fixovaného nátìru (Gram Crystal Violet) a nechejte 1 minutu pùsobit. 2. Studenou vodou z kohoutku vrstvu primárního barvení opatrnì vypláchnìte. 3. Pøelijte podložní sklíèko moøidlem (jódem Gram Iodine nebo stabilizovaným jódem Gram Iodine) a nechejte na sklíèku 1 minutu pùsobit. 4. Vodou z kohoutku vrstvu moøidla opatrnì vypláchnìte. 5. Odbarvìte (Gram Decolorizer); pokraèujte, dokud rozpouštìdlo stékající ze sklíèka nebude zcela bezbarvé (3 60 sekund). 6. Opatrnì sklíèko vypláchnìte studenou vodou z kohoutku. 7. Proveïte kontrastní barvení (Gram Safranin nebo Gram Basic Fuchsin) a nechejte 30 60 sekund pùsobit. 8. Vypláchnìte sklíèko studenou vodou z kohoutku. 9. Osušte sacím papírem nebo papírovým ubrouskem, pøípadnì nechejte volnì uschnout. 10. Vyšetøete nátìr pod imerzním objektivem. Kontrola jakosti uživatelem Požadavky na kontrolu kvality musí být splněny v souladu s platnými místními, státními a federálními zákony nebo požadavky na akreditaci a se standardními postupy kontroly kvality vaší laboratoře. Doporučujeme, aby si uživatel prostudoval informace o správném provádění kontroly jakosti v příslušných směrnicích CLSI (dříve NCCLS) a předpisech CLIA. Kontroly provádìjte pomocí sklíèka BBL Gram Slide (Podložní sklíèko pro Gramovo barvení kat. è. 231401) nebo 18 24 hodinových kultur známých gram-pozitivních a gram-negativních mikroorganismù. Doporuèujeme použít tyto testovací kmeny: Organismus ATCC Oèekávané výsledky Staphylococcus aureus 25923 gram-pozitivní koky Escherichia coli 25922 gram-negativní tyèky Omezení postupu Gramovo barvení poskytuje informace pouze na základì nepøímé identifikace, nemá nahrazovat kultivaèní studie vzorku. Výsledky Gramova barvení je nutné ovìøit dalšími postupy, napøíklad pøímými testy antigenù nebo kultivací na médiu. Pøedchozí léèba antibakteriálními léky mùže zpùsobit, že se gram-pozitivní organismy ze vzorku budou jevit jako gramnegativní. Pro dosažení nejlepších výsledkù doporuèujeme použít 18 24 hodinové kultury, jelikož èerstvé buòky mají k vìtšinì barviv vìtší afinitu než staré buòky. To platí pøevážnì u mnoha organismù tvoøících spory, které jsou silnì gram-pozitivní, pokud je vyšetøíte v èerstvé kultuøe, pozdìji se však mìní na gram-variabilní nebo gram-negativní. Reakce Gramova barvení se zmìní následkem fyzického narušení bunìèné stìny nebo protoplastu bakterií. Bunìèné stìny gram-pozitivních bakterií vytváøejí bariéru, která zabraòuje extrakci komplexu barviva z cytoplazmy. Bunìèné stìny gramnegativních bakterií obsahují lipidy rozpustné v organických rozpouštìdlech, které jsou následnì k dispozici pøi odbarvení cytoplazmy. Proto mikroorganismus, který je fyzicky narušen nadmìrným teplem, nebude reagovat na Gramovo barvení podle oèekávání. Aby byly výsledky pøesné, je nutné peèlivì dodržovat kroky postupu a interpretaèní kritéria. Pøesnost z velké èásti závisí na praxi a zkušenostech mikrobiologa. 2 Výsledky Gramova barvení, vèetnì morfologie organismù, mohou být ovlivnìny stáøím izolátu, bakteriemi obsahujícími autolytické enzymatické systémy, kulturami pøenesenými z médií obsahujících antibiotika a vzorkù odebraných od pacientù léèených antibiotiky. 4 Látky a artefakty na pozadí mohou rovnìž interpretaci ovlivnit. Precipitát gram-pozitivního barvení se obvykle jeví jako nepravidelné kokoidní útvary nebo jako hvìzdice podobné hyfám hub. 4 OÈEKÁVANÉ VÝSLEDKY a SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚÈINNOSTI 1-4 Reakce Gram Safranin Gram Basic Fuchsin Gram-pozitivní Fialovoèerné buòky Svìtle fialové až fialovoèerné buòky Gram-negativní Rùžové až èervené buòky Svìtle rùžové až rudé buòky 3
Odkazy 1. Magee, C.M., G. Rodenheaver, M.T. Edgerton, and R.F. Edlich. 1975. A more reliable Gram staining technique for diagnosis of surgical infections. Am. J. Surg. 130:341-346. 2. Kruczak-Filipov, P., and R.G. Shively. 1994. Gram stain procedures, p. 1.5.1-1.5.18. In H.D. Isenberg (ed.), Clinical microbiology procedures handbook, vol.1. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindley. 1984. Methanol fixation. An alternative to heat-fixation of smear. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2:129-137. 4. Chapin, K. 1995. Clinical microscopy, p. 33-51, In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4
5
Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland 21152 USA 800-638-8663 BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: 353-61-47-29-20 Fax: 353-61-47-25-46 ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 2008 BD.