Univerzita Karlova v Praze. Přírodovědecká fakulta. Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie Kamila Weissová Cirkadiánní synchronizace světlem a dalšími exogenními podněty Circadian entrainment by light and other exogenous cues Bakalářská práce Školitel: PharmDr. Alena Sumová DSc. Praha, 2012 1

Poděkování: Poděkování patří zejména mé školitelce PharmDr. Aleně Sumové DSc., která mi v moha ohledech vyšla vstříc a i přes její pracovní vytížení si vždy našla dostatek času, aby mi pomohla. Za řadu neocenitelných rad a především trpělivost a podporu vděčím také svému partnerovi. Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, 8.5.2012 Kamila Weissová 2

Abstrakt: Cirkadiánní systém umožňuje organismům adaptovat se na proměnlivé podmínky na Zemi, a to zejména ty, které souvisí se střídáním dne a noci. Systém uspořádání cirkadiánního systému, který se skládá z jednoho či více centrálních oscilátorů a řadou periferních oscilátorů se mezi jednotlivými živočišnými druhy liší, ale výstupní rytmus a schopnost synchronizace s denní dobou je velmi podobná. Endogenní výstupní rytmus generovaný cirkadiánním systémem vykazuje vlastní druhově specifickou periodu. Tato perioda je neustále synchronizována pomocí exogenních podnětů s rytmicky se měnícími podmínkami okolního prostředí. Jako synchronizátory mohou působit jak podněty světelné tak i nesvětelné. Největší synchronizační účinek má denní světlo, které umožňuje přizpůsobení měnícím se světelným podmínkám během dne i během celého roku. Díky tomu mohlo dojít k rozdělení zvířat na druhy s noční a denní aktivitou. Kromě světelných synchronizátorů je řada druhů živočichů schopna využívat i nesvětelné synchronizace. Cirkadiánní aktivita je také ovlivňována dostupností potravy a případně zvýšenou pohybovou aktivitou. U druhů s vyšší mírou sociality se uplatňují mechanismy sociální synchronizace. Sociální synchronizace je většinou spjata s hlavním komunikačním kanálem daného druhu. U většiny drobných savců to bývá čich, popřípadě sluch. Savcům je v této práci věnována větší pozornost, jelikož fyziologickým modelem většiny experimentů, zkoumající cirkadiánní systém obratlovců, jsou převážně hlodavci. Cílem této práce je shrnout dosavadní fyziologické poznatky o mechanismech synchronizace a její význam ve volné přírodě. Klíčová slova: cirkadiánní rytmy, světelná synchronizace, nesvětelná synchronizace, 3

Abstract: The circadian system enables adaptation of organisms to periodic environmental changes on the Earth, especially to those related with the alternation of day and night. The circadian system is formed by of one or more central oscillators and numeral peripheral oscillators. Their organization varies among animal species, but the output rhythm and the ability of entrainment is very similar. Endogenous output rhythms, that are generated by the circadian system, exhibit species specific period. This period is continuously entrained by exogenous cues according to rhythmical changes in environmental conditions. The entrainment may be caused by photic and non photic cues. The greatest entraining effect has the daylight, which allows adaptation to changing light conditions during the day and throughout the year. As a result, the animals could divide into nocturnal and diurnal species. In addition to photic entrainment, many species can also use non photic cues for entrainment. Also, circadian activity may be influenced by food availability and possibly by increased physical activity. The mechanisms of social entrainment apply for species with a higher degree of sociality. Usually, social entrainment is associated with the way of the communication within the species. In most of small mammals, the entrainment is associated with the olfactory or auditory stimuli. In this work, the greatest attention is devoted to mammals, mainly rodents, because they are most often used as physiological models in experiments that investigate the circadian system of vertebrates. The aim of this paper is to summarize current knowledge about the physiological mechanisms of entrainment and its importance in the wild. Keywords: circadian rhythms, photic entrainment, non photic entrainment 4

Seznam zkratek: 5 HT 5 hydroxytryptamin 8 OH DPAT 8 hydroxy 2 (di n propylamino) tetralin AA NAT arylalkyl amin N acetyltransferáza AVP arginin vasopresin Bmal1 brain and muscle Amt like protein 1 camp cyklický adenozinmonofosfát cgmp cyklický guanozinmonofosfát CK1ε kasein kináza1 ε Clock Circadian locomotor output cycles kaput CNS centrální nervový systém CRE camp response element CREB calcium/camp response element binding protein Cry1,2 Cryptochrom c Fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog CT circadian time, cirkadiánní čas DBP deep brain photoreceptor D:D dark: dark, světelný režim stálá tma DMH dorsomediální hypotolamus dmscn dorsomedial SCN, dorsomediální část suprachiasmatického jádra DRN dorsal nucleus raphe, dorsální ncl. raphe FAA food anticipatory activity GABA γ aminomáselná kyselina GC guanylát cyklázu GHT genikulohypotalamický trakt 5

GMP guanylát monofosfát GRP gastrin releasing peptid L:D light dark, světelný režim světlo tma L:L light light, podmínky stálého světla MAPK mitogen activated protein kinase MRN medial raphe nucleus. Mediální ncl. raphe mscn medialní SCN MT1,2 melatoninový receptor 1,2 NMDA N methyl D aspartát NO oxid dusnatý NOS NO syntáza NPY neuropeptid Y PACAP pituitary adenylate cyclase activating polypeptid, hypofyzární adenylát cyklázu aktivující protein Per1,2 Period 1,2 PKA protein kináza A PKC protein kináza C PKG protein kináza G PK2 prokineticin 2 PRC phase response curve, fázově responzní křivka RAR receptory pro kyselinu retinovou RF restricted feeding RGC retinal ganglion cell, retinalní gangliové buňky RHT retinohypotalamický trakt Rora RAR related orphan receptor A SCN suprachiasmatic nucleus, suprachiasmatické jádro 6

τ (tau) vnitřní perioda oscilátoru T perioda VIP vasoaktivní intestinální peptid VLPO ventrolaterální preoptická oblast vlscn ventrolateral SCN, ventrolaterální část suprachiasmatického jádra vscn vizuální SCN 7

Obsah 1 Úvod...9 2 Časový systém...10 2.1 Organizace časového systému ptáků...10 2.2 Organizace časového systému plazů...12 2.3 Organizace časového systému ryb...13 2.4 Organizace časového systému savců...14 2.4.1 Suprachiasmatická jádra...14 2.4.2 Vstupní a výstupní dráhy...15 3 Molekulární podstata biologických hodin...17 4 Synchronizace světelná...18 4.1 Světelná synchronizace a fázově responsní křivka...19 4.2 Molekulární mechanismus světelné synchronizace u savců...21 5 Synchronizace nesvětelná...22 5.1 Mechanismus nesvětelné synchronizace...22 5.2 Experimentální studie nesvětelné synchronizace...24 5.2.1 NPY...24 5.2.2 Serotonin...25 5.2.3 Melatonin...26 5.2.4 Potrava...27 6 Denní a noční aktivita...28 7 Synchronizace v přírodě...31 7.1 Světelná synchronizace...31 7.2 Synchronizace v prostředí s nedostatkem světelných synchronizátorů...33 7.2.1 Význam čichu v sociální synchronizaci...33 7.2.2 Synchronizace v subnivální zóně...34 7.2.3 Život v podzemí...34 7.2.4 Synchronizace pomocí zvukových projevů...36 7.2.5 Schopnost synchronizace v afotické zóně na dně oceánu...37 8 Závěr...37 9 Seznam použité literatury...38 8

1 Úvod Cirkadiánní systém je evolučně velmi starý a široce rozšířený mezi všemi organismy na Zemi. Struktura a uspořádání tohoto systému je velmi variabilní. Ovšem jeho funkční význam je pro všechny druhy stejný. Funkční systém biologických hodin byl pravděpodobně dostatečně významný pro přežití, a proto se široce rozšířil napříč všemi druhy. V průběhu evoluce prodělal řadu změn zefektivňujících jeho funkci. Je zřejmá tendence od nižších obratlovců po vyšší v centralizaci a sjednocování oscilátorů. V souvislosti s životní strategií a s ekologickou nikou, kterou jednotlivé druhy obývají, došlo k řadě specifických změn ovlivňujících chod hodin. Různé vnější podněty, které mohou hodiny seřizovat, mohou mít u různých druhů velmi odlišný účinek na cirkadiánní systém. Změny nejsou jen mezidruhové, ale jsou také patrné rozdíly vnitrodruhové i mezipohlavní. Významnou roli v míře odpovědi na synchronizační podnět hraje i denní doba a roční doba, ve které podnět působí. Podněty seřizující nastavení hodin lze rozdělit podle typu na světelné a nesvětelné. Světelná synchronizace je pro většinu druhu majoritní a synchronizační účinek světla je silnější než účinek nesvětelných podnětů. Se schopností organismů adaptovat se na velmi variabilní prostředí, ve kterém žijí, se ovšem světelná synchronizace stala pro některé druhy nedosažitelnou. Některé druhy obydlely i takové prostory na Zemi, kde se nemohou se světlem běžně nebo vůbec nesetkávat. Tyto druhy proto více uplatňují nesvětelné synchronizační podněty pro seřízení svých hodin. Rozvoj cirkadiánního systému umožnil rozdělení niky nejen prostorově, ale i časově, čímž usnadnil a zefektivnil například hledání potravy či sexuálního partnera a snížil riziko predace usměrněním aktivity do časového úseku minimální aktivity predátora. Druhy s podobnými prostorovými nároky, které se dokázaly adaptovat na noční nebo denní způsob života, mohly spoluobývat stejný prostor aniž by docházelo k mezidruhové kompetici. Na základě různých světelných podmínek se měnila citlivosti hodin k působení světla a s rostoucí mírou sociality se zvyšovala účast nesvětlých synchronizátorů na seřizování biologických hodin. Cílem této práce bylo shrnout poznatky o mechanismech, kterými jsou seřizovány cirkadiánní hodiny, a to nejen ty, které jsou zkoumány v laboratorních experimentech, ale také ty, které jsou uplatňovány u zvířat žijících v přírodě. 9

2 Časový systém Časový systém obratlovců řídí řadu procesů tak, že vykazují rytmy. Některé z těchto rytmů se opakují s přibližně denní periodou a jsou proto nazývány cirkadiánní rytmy. Jedná se o rytmy endogenní, tj. generované vnitřním/i oscilátorem/oscilátory a tedy běžící i za konstantních podmínek. Organismy se tak adaptovaly na život na Zemi, kde jsou vystavovány změnám ve vnějším prostředí v souvislosti s délkou astronomického dne. V konstantních podmínkách se však perioda těchto rytmů pouze blíží 24 hodinám a je proto nutné, aby byly hodiny neustále seřizovány pomocí vnějších synchronizátorů udávajících denní dobu. Nejdůležitějším z nich je střídání světlé a tmavé fáze dne, kdy především světlo působí jako silný synchronizátor (Daan a Pittendridgh, 1976a). Synchronizace cirkadiánního systému se však účastní i řada nesvětelných podnětů, především projevy sociálních interakcí, vliv dostupnosti potravy nebo podněty stimulující pohybovou aktivitu. Časový systém se během evoluce vyvíjel a u různých živočišných druhů se liší ve své organizaci ( viz kap. 1.1. až 1.4.). Obecně se cirkadiánní systém skládá z centrálního či centrálních oscilátorů, které jsou nezbytné pro zachování rytmického chování a z periferních oscilátorů, které jsou uloženy v různých buňkách a orgánech v těle. Tyto periferní oscilátory jsou funkčně podřízeny centrálním oscilátorům a jejich odstranění nevede ke ztrátě rytmického chování zvířete. 2.1 Organizace časového systému ptáků Ptačí časový systém patří mezi takzvaný multi oscilátorový systém. Centrální úlohu hraje několik oscilátorů, které jsou vzájemně propojeny a jejich kooperací vzniká jednotný endogenní rytmus. Jedním z endogenních nezávislých oscilátorů u ptáků je epifýza (Takahashi et al., 1980), která rytmicky syntetizuje melatonin. Nejvyšší hladina melatoninu je během noci a s nástupem dne jeho hladina klesá. Tento rytmus si epifýza udrží v podmínkách konstantní tmy (DD) a to nejen v podmínkách in vivo, ale i in vitro (Natesan et al., 2002). Epifýza ptáků má i přímou schopnost fotorecepce, nacházejí se v ní buňky obsahující fotosenzitivní protein pinealopsin (Okano et al., 1994). Dalším endogenním oscilátorem ptáků je retina, která také rytmicky syntetizuje melatonin (Underwood et al., 1990). A třetí součástí multiocilátorového systému 10

ptáků je struktura v hypotalamu, která je homologní s centrálním oscilátorem savců suprachiasmatická jádra (SCN) (Gwinner et al., 1997). SCN jsou funkčně rozdělena na 2 vzájemně propojené struktury, mediální část (mscn) a vizuální část (vscn) (Cantwell a Cassone 2006a, b). Přenos světelného signálu je do SCN veden třemi dráhami. První přímá dráha monosynapticky propojuje sítnici a vscn tzv. retinohypotalamickou dráhou (RHT). RHT částečně přivádí světlo i do mscn. Druhá nepřímá dráha do vscn vede z perirotundalní oblasti a genikulátních jader. A třetí dráha vstupuje do mscn a informaci o světelném signálu přivádí z encephalických receptorů (DBP, z angl. Deep brain photoreceptors) z paraventrikulárních jader hypotalamu a ze septa (Cantwell a Cassone, 2006b). DBP jsou jednotlivé buňky rozptýlené v uvedených oblastech mozku exprimující fotosenzitivní pigment. Jako fotosensitivní pigment ptáků byl u holuba popsán rhodopsin (Wada et al., 2000). Jejich schopnost synchronizovat cirkadiánní rytmy potvrdil u vrabce domácího v roce 1968 Menaker a zároveň se ukázalo, že hrají významnou roli ve vnímání změny fotoperiody (Menaker, 1968). Informace o světle jsou tedy zpracovávány všemi třemi oscilátory, které se vzájemně ovlivňují a informují. Melatonin produkovaný během noci z retiny a epifýzy, se váže na specifické melatoninové receptory, nacházející se na vscn, čímž inhibuje metabolickou aktivitu a výstupy z SCN. S příchodem dne se produkce melatoninu snižuje a aktivita vscn narůstá, a zároveň je aktivita epifýzy inhibována sympatickým autonomním nervovým systémem (Cassone et al., 1990). I když je cirkadiánní systém ptáků závislý na více oscilátorech, existuje významná mezidruhová variabilita v jejich úloze při řízení rytmu v chování. U vrabce domácího, Passer domesticus, samotné odstranění epifýzy vedlo ke zrušení cirkadiánního lokomočního rytmu poté, co byl vrabec umístěn do DD podmínek (Gaston, 1968; Meneker, 1968). Na rozdíl od toho u japonské křepelky, Coturnix coturnix japonica, pinealoktomie neměla tak zásadní vliv. Po odstranění očí, tedy retiny, která také syntetizuje melatonin, došlo u křepelky ke zrušení cirkadiánní aktivity (Underwood a Siopes, 1984), zatímco u vrabce odstranění retiny nemělo vliv na cirkadiánní aktivitu. U holuba, Columba livia, bylo ke zrušení cirkadiánní pohybové aktivity třeba jak odstranění očí, tak i odstranění epifýzy. Současně se zrušením pohybové rytmicity došlo i ke ztrátě rytmu v tělesné teplotě (Oshima et al., 1989). Z výsledků vyplývá, že epifýza má klíčový význam především u pěvců jako je vrabec domácí, zatímco retina hraje důležitější roli u kuřete nebo křepelky. 11

Melatonin se u ptáků účastní regulace reprodukční aktivity, jelikož působí inhibičně na pohlavní žlázy (Cassone et al., 2008). S prodlužováním fotoperiody se zkracuje interval noční syntézy melatoninu a současně ke zmenšování gonád. Během zimy jsou gonády velmi malé, s příchodem jara a s tím spojeným prodlužováním fotoperiody se interval produkce melatoninu zkracuje a gonády se začnou zvětšovat (Whitfield Rucker, 1996). Následně se zvyšuje produkce testosteronu, který aktivuje a centra zpěvu hlavní řídící jádro tzv. Area X a nucleus robustus v koncovém mozku. Jádra se mnohonásobně zvětší a pěvci začnou zpívat (Gahr, 2007). Chronické podávání melatoninu významně utlumí sezonní změny ve velikosti centra zpěvu (Bentley et al., 1999). Obr.1: Schématická znázornění multioscilátorového systému ptáků a jejich interakcí (Cassone et al. 2009). 2.2 Organizace časového systému plazů Podobně jako u ptáků je cirkadiánní sytém plazů založen na kooperaci několika vzájemně provázaných oscilátorů. Tuto funkci u plazů plní retina, SCN a pineální komplex tvořený epifýzou a parietálním okem u ještěrek a hatérií nebo frontálním orgánem u žab. Stejně jako u ptáků význam jednotlivých oscilátorů v cirkadiánním systému je mezi různými druhy variabilní. Frontální orgán se nachází mezi očima žáby a buňky podobné čípkům obsahují fotosenzitivní protein iodopsin a rhodopsin (Bertolucci a Foá 2004). Adler v roce 1971 prokázal, když žábě Rana clamitans odstranil oči i epifýzu, že frontální orgán byl schopný zprostředkovat světelnou synchronizaci (Adler, 1971). Předpokládá se ovšem, že spíše slouží žábě k orientaci jako sluneční kompas (Taylor et al., 1973). Parietalní oko má velmi podobnou 12

strukturu stavbě laterálního oka, je tvořeno čočkou, retinou i rohovkou. Retina je tvořena fotoreceptivními a gangliovými buňkami utvářejících parietální nerv. Parietální nerv projikuje do thalamu, hypothalamu a některých oblastí telencephala (Engbretson, 1992, ). Parietalní oko je schopné syntézy melatoninu, ale v mnohem menší míře než epifýza (Firth et al. 1987 ). Odstraněním pineálního komplexu u leguána zeleného, Iguana iguana, dojde sice ke změněně lokomočního rytmu, ale daleko významněji ovlivní teplotní cirkadiánní rytmus (Tosini a Meneker, 1998). Odstraněním pineálního komplexu je minimalizována noční produkce melatoninu, jehož funkcí je mimo jiné potlačovat produkci tepla během noci. Jelikož plazi patří mezi homoiotermy, bude tento zásah mít pravděpodobněji významnější vliv na jejich energetický metabolismus. Poslední fotoreceptivní strukturou u plazů byly identifikovány DBP u Iguana iguana (Grace et al., 1996). Jejich existence je zřejmá, ale jejich vliv na cirkadiánní systém nijak jasný. 2.3 Organizace časového systému ryb Hlavní cirkadiánní pacemaker u ryb nebyl dosud jednoznačně popsán. Schopnost generovat a udržovat rytmicitu byla v produkci melatoninu popsána u epifýzy a retiny. Obě tyto struktury vykazovaly rytmus i v in vitro podmínkách na světelném režimu (LD, z angl. light/dark) i několik dní po přemístění do nočního režimu DD (Bolliet et al., 1996; Hurd a Cahill, 2002). Ovšem, když byla u drobné akvarijní rybky Danio pruhované, Danio rerio, provedena Obr. 2: Molekulární mechanismus cirkadiánních hodin Danio rerio. Zpětnovazebná smyčka znázorňující několikanásobné hodinové geny (Vatine et al. 2011). 13

pinealektomie a současně i odstraněna retina, lokomoční rytmicita byla zachována. Narušení cirkadiánního rytmu se potvrdilo po odstranění epifýzy u embryonálních a larválních stadií Dania, které pravděpodobně ještě nemají dostatečně vyvinuté jiné fotoreceptivní struktury (Hurd et al., 2002). Ovšem zdá se, že obdobnou funkci jako mají u savců SCN, by u ryb mohla zastávat preoptická oblast hypotalamu (area preoptica hypothalami). Do této struktury vedou terminály RHT. Avšak doposud neexistují studie dostatečně podporující tuto hypotézu (Cahill 2002). Zajímavostí u ryb Danio rerio bylo popsání fototransduktivního mechanismu a endogenní oscilace v ledvinách a srdci (Whitmore et al., 1998). Jedná se zatím o jediné známé obratlovce, v jejichž periferních orgánech byla zjištěna schopnost přímé synchronizace endogenní rytmicity se světelným režimem (Whitmore et al. 2000). Tato přímá synchronizace periferních orgánů světlem je umožněna skutečností, že tělo těchto ryb je transparentní a světlo tak může na jejich periferní orgány přímo dopadat. Vedle této zvláštnosti u nich byl objeven znásobený počet hodinových genů Cry, Per, Clock, Bmal. Translačně transkripční zpětnovazebná smyčka je sice o něco komplikovanější než běžně presentovaná savčí, ale mechanismus její funkce je téměř shodný (Obr. 2). Bylo popsáno šest Cry genů: Cry1a, 1b, 2a, 2b, 3 a 4 (Kobayashi et al. 2000), tři Clock geny: Clock1a, 1b, 2, tři Bmal geny : Bmal1a, 1b, 2 (Wang, 2009) a čtyři Per geny: Per1a, 2b, 3, 4 (Wang, 2008). 2.4 Organizace časového systému savců U časového sytému savců došlo k centralizaci oscilátorů do jednoho hlavního řídícího centra. Řada ostatních oscilátorů si sice zachovala vlastní schopnost generovat endogenní rytmus, ale především kvůli zachování jednotné synchronizace, byla funkčně podřízena jednomu řídícímu centru. Kromě retiny ztratily ostatní orgány fotoreceptivní schopnost, která byla vlastní multioscilátorovému uspořádání výše zmíněných obratlovců. Z tohoto důvodu bylo nutné řídit synchronizaci z jednoho centra přímo propojeného s fotoreceptivním orgánem, tj. retinou. 2.4.1 Suprachiasmatická jádra U savců hraje centrální úlohu v cirkadiánním systému pouze jeden oscilátor, který je funkčně hierarchicky nadřazený všem ostatním oscilátorům. Ty sice vykazují vlastní endogenní rytmus, ale bez centrálního oscilátoru by savci byli arytmičtí. Centrální biologické 14

hodiny jsou u savců uloženy v SCN (Rusak a Zucker, 1979). SCN jsou párová jádra v hypotalamu, kdy každé jádro je u hlodavců tvořeno shlukem 8000 10000 těl neuronů. Každý neuron je schopný generovat nezávisle na ostatních neuronech SCN vlastní rytmus a jednotný výstupní cirkadiánní rytmus vzniká až na úrovni neuronální sítě (Welsh et al., 1995; Liu et al., 1997). Morfologicky i funkčně lze jádra rozlišit na několik částí. Ve ventro dorsálním směru se dělí na dorsomediální (dmscn) a ventrolaterální (vlscn) (Leak a Moore, 2001). dmscn je jinak také označováno jako core (z angl.) a vlscn jako shell (z angl.). Obě podjednotky SCN jsou tvořeny funkčně odlišnými neurony, které jsou v rámci podjednotek vzájemně propojené. Neurony, tvořící core, produkují vazointestinální peptid (VIP) a gastrin releasing peptid (GRP), zatímco neurony shell produkují především arginin vazopresin (AVP). Většina neuronů SCN produkuje jako neurotransmiter také kyselinu γ aminomáselnou (GABA) (van den Pol, 1980, Abrahamson et al., 2001; Albus et al., 2005). V rostro kaudálním směru se SCN funkčně dělí na populace neuronů v rostrální, mediální a kaudální části (Hazlerigg et al., 2005).Vzájemná komunikace mezi těmito podjednotkami se uplatňuje při mechanismu, jakým SCN reaguje na změnu fotoperiody. Na dlouhé fotoperiodě je exprese hodinových genů v kaudální části fázově předběhnuta oproti rostrální části. Rozdílná odpověď jednotlivých částí SCN na délku fotoperiody by mohla pomáhat v rozpoznávání změny ročního období a dějů s nimi spjatými (Hazlerigg et al., 2005). 2.4.2 Vstupní a výstupní dráhy Vnitřní endogenní rytmus SCN je nutné synchronizovat s vnějším prostředím. Nejúčinnější synchronizátor je světlo. Jelikož u savců je na rozdíl od nižších obratlovců jediným fotoreceptivním orgánem oko, musí být utvořen komunikační kanál spojující SCN se sítnicí (retinou). Propojení sítnice a SCN je uskutečněno pomocí monosynaptické RTH. Za převod světelného signálu z retiny do SCN odpovídají fotoreceptivní retinální gangliové buňky (RGC), které exprimují fotosensitivní pigment melanopsin a cryptochromy CRY1 a CRY2 (Miyamoto a Sancar, 1999). Tyto buňky se neúčastní přenosu vizuálního vjemu, vedou informaci o světle přímo do SCN a dále se účastní pupilárního reflexu. Tyčinky a čípky se přenosu signálu do SCN přímo neúčastní (Foster et al., 1991), což bylo zjištěno na základě experimentu s myšími modely, které byly geneticky zbaveny tyčinek a čípků (rdta/cl) a přesto u nich zůstala synchronizace s vnějšími světelnými podmínkami zachovaná (Freedman et al. 1999). Cryptochromy nejsou u savců nezbytné pro světelnou signalizaci, ale jsou důležité pro funkci 15

hodin (viz dále) (Vitaterna a Selby, 1999). RHT odchází ze sítnice společně s optickým nervem, odděluje se v oblasti chiasma opticum a je první odbočující dráhou z optického nervu. Terminály RHT jsou v SCN lokalizovány do vlscn. (Leak et Moore, 2001). Hlavní neurotransmiter této dráhy je glutamát, který se váže na N metyl D aspartátové receptory (NMDA) (Ebling, 1996). Druhá dráha zajišťující informaci o světle do SCN je nepřímá, vede z retiny do intergenikulátních lístků thalamu (IGL) a odkud pokračuje jako genikulohypotalamický trakt (GHT) do vlscn. V intergenikulátním lístku se integrují informace ovlivňující SCN jak světelného, tak hlavně nesvětelného charakteru. Hlavním neuropřenašečem v GHT je neuropeptid Y (NPY) (Morin a Blanchard, 1995, Harrington, 1997). Třetí vstupní dráha do vlscn je aferentace ze středního mozku, jádra nuclei raphe (Moga a Moore 1997, Meyer Bernstein a Morin, 1996). Touto dráhou přicházejí do SCN podněty nesvětelného charakteru. Neurotransmiterem je serotonin (Bloom et al., 1972). Do dmscn vedou především aferentace o nesvětelných podnětech z různých oblastí mozku, jako hypotalamu, limbického systému, thalamu, mozkového kmene a také přepojovací dráhy z core SCN. Bylo zjištěno, že dráhy vedou i v opačném směru z shell do core, ale jen velmi sporadicky (Daikoku et al., 1992; Leak et al., 1999). Zdá se, že na eferentaci ze SCN se významněji podílí obě části SCN. Převážná část eferentních drah ale vychází z dmscn. V této části SCN dochází k integraci signálů z vlscn, tzn. hlavně signálů o synchronizačním účinku světla, s informacemi z limbického systému a bazálního telencefala. Z vlscn vedou výstupní dráhy do některých oblastí hypotalamu a dále vzestupné dráhy do thalamu a zpět do bazálních oblastí telencefala. (Abrahamson et al., 2001). Polysynaptická výstupní dráha z SCN přes cervikální ganglion vede do epifýzy, tímto propojením je řízen rytmický výlev melatoninu (Klein a Moore, 1979) 16

3 Molekulární podstata biologických hodin Endogenní rytmický signál je tvořen na úrovni jedné buňky. Mechanismus pravděpodobně spočívá v pravidelné oscilaci ve spínání hodinových genů. Rozdíl mezi centrálním a periferním oscilátorem je dán především mechanismem synchronizace těchto oscilací, v základním principu vzniku je však podobný. Mechanismus oscilace probíhá na základě pozitivně a negativně se ovlivňujících transkripčně translačních zpětnovazebných smyček (Obr.3). Mezi proteiny, které se podílejí na tvorbě endogenního rytmu patří PER (period), CRY (cryptochrom), BMAL1, CLOCK, REV ERBα, RORα a CKIε (shrnuto Golombek et al., 2010). Hladina CLOCK a CKIε je v SCN konstantní (Sumová et al., 2003). Exprese genu Per1, Per2, Cry1 a Cry2 je nejvyšší během subjektivního dne, exprese Bmal1 dosahuje svého maxima během subjektivní noci. Exprese genů Per1,2, Cry1,2, Rev erbα a Rora je aktivována heterodimerem CLOCK/BMAL1. Expresi aktivuje přes E box, který je součástí promotoru těchto genů. V cytoplazmě po translaci mrna dochází účinkem kasein kináza epsilon (CKIε) k fosforylaci CRY a PER proteinů. PER je pravděpodobně pomocí CRY stabilizován, zabraňuje předčasné degradaci v proteasomu. Vzniklý komplex PER/CRY vstupuje do jádra, kde se váže na heterodimer CLOCK/BMAL1, čímž inhibuje jeho aktivační působení a následně tím negativně ovlivňuje expresi vlastního genu. Rytmus v expresi Bmal1 je závislý na přítomnosti REV ERBα,, který je translokován z cytoplazmy zpět do jádra, kde se váže na Obr.3: Zjednodušený model molekulárního mechanismu hodin u savců. Mechanismus zahrnuje pozitivní a negativní zpětnovazebné smyčky. Heterodimery CLOCK:BMAL1 aktivují transkripci Per, Cry a Rev erbα. Fosforylovaný komplex PER:CRY se váže na heterodimery CLOCK:BMAL1 a tím inhibuje transkripcisvých genů. Přídatná smyčka zahrnuje inhibici transkripce Bmal1 prostřednictvím REV ERBα a aktivaci jeho transkripce prostřednictvím RORA. Pro bližší porozumění viz text výše (Golombek et al 2010). 17

RORE element v promotoru genu pro Bmal1 a zabraňuje tím jeho expresi. RORa expresi Bmal1 naopak aktivuje. Tímto mechanismem je uzavřena druhá negativní zpětnovazebná smyčka (shrnuto Golombek et al., 2010). Perioda, s jakou se tyto smyčky opakují, je přibližně 24hodin. 4 Synchronizace světelná Je zřejmé, že cirkadiánní synchronizace organismu se během evoluce vyvinula jako adaptace na podmínky životní prostředí, především pravidelné střídání dne a noci. Předpokládá se, že na počátku života na Zemi se organismy pomocí tohoto mechanismu mohly chránit před Obr. 4: Průběh světelné fázově responzní křivky. Znázorňuje citlivost ke světelným pulzům v průběhu dne (Diego at al 2010). UV zářením. U některých jednobuněčných organizmů je známo, že podle světelných podmínek soustřeďují UV citlivé procesy, jako je replikace DNA, do temné fáze dne (Nikaido et al., 2000). Endogenní rytmicita každého druhu byla pod pozitivním selekčním tlakem jako adaptabilní výhoda (Johnson et al., 1999), proto se zřejmě jedná o evolučně fixovanou široce rozšířenou schopnost všech organismů. Vnitřní perioda τ (tau) vždy přibližně odpovídá periodě vnějšího prostředí (T) a její hodnota se liší v závislosti na živočišném druhu. Perioda výstupných rytmů je výsledkem souhry endogenního rytmu centrálního/ centrálních oscilátorů a různě se měnících cyklů vnějšího prostředí. Během synchronizace je τ upravována, tj. seřizována, tak, že přesně odpovídá T. Podněty schopné přizpůsobit periodu i fázi endogenního rytmu podmínkám vnějšího prostředí označil J. Aschoff jako Zeitgeber (z něm. udávající čas ). V přirozených podmínkách se organizmy setkávají běžně se dvěma typy cyklických 18

změn světelných podmínek tj. solární a lunární cykly. Účinek slunečního záření má v synchronizaci nejsilnější účinek, i když u dnešního člověka a druhů, jejich život je s člověkem pevně spjat se s rozvojem umělého prostředí civilizace její význam ztrácí. Slabé měsíční světlo jsou k synchronizaci schopné použít jen některé druhy. Tato schopnost je známá u řady mořských organismů, kde je měsíční fáze tj. i intenzita měsíčního světla, spjata se slapovými jevy, tedy nejedná se pravděpodobně pouze o samotný účinek světla, ale i o působení tzv. cirkatidálních rytmů, což jsou rytmy seřízené se střídáním přílivu a odlivu. Největší význam lunárních rytmů souvisí se synchronizací reprodukční aktivity bezobratlých organismů. Známé jsou lunární rytmy zástupce dvoukřídlého hmyzu Clunio marinus (Neumann, 1985) nebo reprodukční cykly Eunice viridis (Caspers, 1984). 4.1 Světelná synchronizace a fázově responsní křivka Vzhledem k tomu, že vnitřní perioda se u organismů obvykle nerovná přesně 24 hodinám, dochází v podmínkách konstantní tmy k tzv. volnému běhu lokomočního rytmu (z angl. free running ). V závislosti na délce periody τ tak dochází k předbíhání, pokud je perioda kratší než 24 hodin, nebo k opožďování, pokud je perioda delší než 24hodin. Aby se aktivita organismu opakovala s denní periodu T, musí docházet k seřízení volně běžícího rytmu. Tento mechanismus umožňuje organizmům flexibilně reagovat na změny dne a noci a také délky světelné periody během ročních období. Zda světlo vyvolá fázový posun endogenního rytmu či ne závisí na tom, v jaké denní době světlo působí, tzn. v jaké fázi se zrovna oscilátor nachází. Pokud světlo působí během subjektivního dne, nezpůsobí žádné fázové posunutí a tento interval je také nazýván mrtvá zóna (z angl. dead zone). Pokud však působí v době subjektivní noci, vyvolá fázový posun, jehož směr je závislý na čase. Pokud světlo působí v první polovině noci, vyvolá fázové zpoždění a naopak ve druhé polovině noci fázové předběhnutí. Experimentálně bylo dokázáno, že ke kompletní synchronizaci vnitřních hodin stačí i jeden jediný světelný pulz, pokud je aplikován v období citlivosti hodin na světlo. Organismy s τ < 24hodin tak potřebují světelný pulz zvečera, který hodiny opožďuje. Organismy s τ > 24hodin potřebují světelný pulz zrána, který je urychluje. Citlivost endogenního oscilátoru ke stejnému světelnému stimulu v různou denní dobu vyjadřuje fázově responsní křivka (PRC, z angl. phase response curve) (Daan a Pittendrigh, 1976). Citlivost SCN k synchronizačním světelným stimulům v různých časech nejlépe odráží schopnost světla indukovat expresi časných raných 19

genů ve vlscn. Nejčastěji používaný ukazatelem je indukce exprese c Fos světlem. Pokud má světelný podnět synchronizační účinek, dojde k okamžité indukci jeho exprese. Výsledkem odpovědi na stimul je v různou dobu různá míra odpovědi exprese c Fos (Earnest et al., 1990). Největší indukce exprese c Fos je během subjektivní noci, tj. v CT (z angl. circadian time) 12 až 24. Fázový posun může probíhat i v několika cyklech, závisí na velikosti časového posunu. Každodenní synchronizace vnitřní periody s periodou vnějšího prostředí nevyžaduje žádné přechodné cykly, organismy se do druhého dne plně synchronizují. V experimentálních podmínkách nebo při přeletu časových pásem, kdy je fázový posun náhlý a několika hodinový, je synchronizační proces záležitostí i několika přechodných, tzv. tranzientních, cyklů. Průběh PRC a rychlost odpovědi na Zeitgeber probíhá individuálně mezi druhy i mezi jedinci téhož druhu (Obr.5). Změna fotoperiody ovlivňuje kromě hladiny melatoninu i interval, kdy je možné světelným pulzem indukovat přímo v SCN transkripci časného raného genu c fos, který je na krátké fotoperiodě delší než na dlouhé (Sumová et al., 1995). Je tedy zřejmé, že fotoperioda ovlivňuje přímo rytmicitu centrálního pacemakeru. Změna z dlouhé fotoperiody (LD 16:8) na krátkou (LD 8:16) vyžaduje delší dobu přizpůsobení, trvá přibližně dva týdny. K prodlužování intervalu, kdy lze indukovat expresi c Fos, dochází pozvolna. V opačném směru je přizpůsobení velmi rychlé, nastává během 3 dnů (Sumová et al., 1995). Zkracování či prodlužování fotoperiody tak například vede ke změnám sexuální aktivity, Obr.5: Srovnání PRC jednotlivých druhů. Fázové předběhnutí značí kladná část osy, fázové zpoždění je v záporných hodnotách (Reffineti, 2006). hmotnosti nebo zabarvení srsti (Follett et Milette, 1982). 20

4.2 Molekulární mechanismus světelné synchronizace u savců Základní mechanismus synchronizace spočívá ve schopnosti světla indukovat expresi Per1 a Per2 genů v době, kdy je jeho endogenní hladina nízká, tj. v noci. Po osvětlení dochází k aktivaci RHT, jejíž hlavním mediátorem je glutamát (Ebling, 1996). Na přenosu signálu se také podílí hypofyzární adenylát cyklázu aktivující protein (z angl. pituitary adenylate cyclase activating peptide, PACAP) a substance P (Chen et al. 1999, Hamada et al. 1999). Mechanismus fázového předběhnutí nebo zpoždění má některé části průběhu společné. V obou případech dochází k vylití glutamátu a jeho vazba na N metyl D aspartátové (NMDA) receptory na postsynaptické membráně SCN neuronu. Následně je fosforylován transkripční faktor CREB (camp response element binding protein), který se váže na CRE vazebný element (camp response element) v oblasti promotoru genů. Vazba na CRE spustí genovou expresi hodinových Per genů. Díky tomu dochází k fázovému posunu periody transkripčně translačních smyček (viz kap. 3) a seřízení periody τ. Rozdíly v mechanismu fázového předbíhání a zpožďování jsou na úrovni signálních drah, kterými je CREB fosforylován. Po vazbě glutamátu na NMDA receptor dojde ke vstupu extracelulárního Ca2+ do buňky. Pokud světlo působí v první polovině subjektivní noci, vylití glutamátu aktivuje MAP kinázovou (z angl. mitogen activated protein kinase) dráhu. Extracelulární Ca2+ se váže na ryanodinové receptory a indukuje tím vyplavení intracelulárních Ca2+ iontů, které přes vazbu s kalmodulinem pomáhají aktivovat MAP kinázu. MAP kináza fosforyluje CREB, který se naváže do promotoru hodinových genů pomocí CRE elementu a aktivuje jejich expresi. Pokud světelný signál působí ve druhé polovině noci, Ca2+ indukuje Ca2+ dependentní kalmodulin protein kinázu, která aktivuje NO syntázu (NOS). Zvýšená produkce oxidu dusnatého aktivuje guanylát cyklázu (GC), která z vytváří z necyklického guanylát monofosfátu (GMP) cyklický (cgmp). CGMP aktivuje cgmp dependentní protein kinázu (PKG), která fosforyluje CREB (shrnuto v Golombek et al., 2010). Molekulární i behaviorální mechanismus synchronizace je u nočních i denních savců téměř stejný. 21

Obr. 6: Molekulární mechanismus světelné synchronizace (Golombek et al., 2010). 5 Synchronizace nesvětelná Ačkoliv je známo, že nejsilnější synchronizační účinek má střídání světelné a tmavé fáze dne, důležitou roli v synchronizaci cirkadiánní aktivity hrají také nesvětelné faktory. Význam této synchronizace se projevuje především u sociálně žijících druhů, u organismů, které se světlem nepřijdou nikdy do styku nebo u druhů, kde matky pečují o potomstvo (viz kapitoly 7.2.1, 7.2.2, 7.2.3, 7.2.4, 7.2.5). 5.1 Mechanismus nesvětelné synchronizace Synchronizace nesvětelnými stimuly, musí stejně jako světelná synchronizace, ovlivňovat fázi a periodu centrálního oscilátoru. Nesvětelné podněty jsou schopné vyvolat pouze fázové předběhnutí (Obr. 7). Informace o synchronizačních účincích nesvětelného podnětu do SCN vstupují hned několika různými dráhami. První dráhou je genikulohypotalamická dráha (GHT). Přenosu nervového signálu se účastní GABA, neuropeptid Y a endorfiny (Harrington, 1997; Mrosovsky, 1995). Druhou dráhou je serotonergní dráha z mediálního ncl. raphe (Meyer Bernstein a Morin, 1996; Mintz et al., 1997). Obě dráhy projikují do vlscn. GHT aktivuje, 22

vylitím neurotransmiteru na presynaptické Y2 receptory, signální kaskádu přes protein kinázu C (PKC) (Huhman et al., 1996). Serotonergní dráha vazbou serotoninu na 5 HT1A/7 receptory vlscn aktivuje PAK (protein kinázu A) (Prosser, 2003). Aktivace těchto drah působí inhibičně na expresi hodinových genů Per1 nebo Per2 ( Fukuhara et al., 2001; Horikawa et al., 2000). Seřízení hodin v SCN nesvětelným stimulem bylo u nočních hlodavců doprovázeno snížením exprese Per genů (Maywood et al., 1999; Horikawa et al., 2000). U denních zvířat však molekulární mechanismus účinku fázového posunutí není dosud znám. Regulace exprese obou těchto genů je tak zapojena jak do světelné synchronizace, kdy je exprese aktivována (viz kapitola 4.2), tak do nesvětelné synchronizace, kdy je jejich exprese inhibována. Interakcí světelného pulzu a fázového předběhnutí vyvolaného během subjektivního dne nesvětelným podnětem dojde k vyrušení účinku nesvětelné synchronizace. Ale i nesvětelné podněty mohou mít vliv na synchronizační účinek světla. Fázový předběhnutí způsobené světelným pulzem během subjektivní noci může být utlumeno behaviorálním vybuzením nebo účinkem NPY (Weber a Rea, 1997) a serotoninu (Weber a Rea, 1998). Ovšem nemají vliv na fázové zpoždění. Obr. 7: Nesvětelná fázově responzní křivka. Znázorňuje citlivost oscilátoru k fázovému posunu způsobenou nesvětelným podnětem. V bodě 4 nesvětelný podnět způsobí fázový posun. V bodě 5, tj. v průběhu subjektivní noci, fázový posun nezpůsobí (Diego et al., 2010). 23

5.2 Experimentální studie nesvětelné synchronizace Nesvětelná synchronizace byla kromě několika málo studií provedených v přírodních podmínkách, sledována především v laboratorních experimentech. Tyto experimenty pomohly objasnit detailněji mechanismy podílející se na nesvětelné synchronizaci, a také odhalit vzájemný vztah a interakce světelných a nesvětelných podnětů. Díky těmto experimentům se podařilo popsat dráhy nesoucí informaci o nesvětelných synchronizačních podnětech, byly popsány nejvýznamnější mozkové struktury zapojené do mechanismu nesvětelné synchronizace a prostudována úloha jednotlivých neurotransmiterů a lokalizace jejich receptorů. 5.2.1 NPY Neuropeptid Y (NPY) je mediátorem GHT propojující IGL a SCN. Do IGL kromě dráhy z retiny, tzv. retinogenikulátní dráhy, vedou také serotonergní aferentace z dorzálního ncl. raphe (DRN z angl. dorsal raphe nukleus) (Moore a Card, 1994). Proto signalizace z IGL do SCN zprostředkovává pomocí NPY jak nesvětelné vstupy tak i světelné informace. Behaviorální signál, jako je například běhání v otočném kolečku, který je schopen vyvolat fázový posun, aktivuje DRN, odkud je serotonergní dráhou jednak aktivováno mediální ncl. raphe (MRN z angl. medial raphe nucleus) (viz kap. 5.2.2) a zároveň IGL (Grossmann et al. 2004). Poškozením GHT nebo zablokování účinku NPY dojde k zamezení fázového posunu vyvolaného umístěním zvířete do běhacího kolečka (Janik a Mrosovsky, 1994). Světelný stimul zvyšuje aktivitu neuronů IGL (Harrington a Russak 1989) a zvýší se i hladina c Fos v neuronech IGL (Edelstain a Amir 1996). Význam IGL a jeho propojení s retinou a SCN se zdá být především ve schopnosti zlepšení synchronizace s měnící se fotoperiodou. Myši npy / vykazovaly horší schopnost synchronizace na krátkou (6:18) fotoperiodou (Kim a Harrington, 2008). Vstup světelné a nesvětelné dráhy do IGL s pouze jedním výstupem do SCN vytváří z IGL integrační strukturu, která se při střetu podnětů z obou drah pravděpodobně podílí na charakteru behaviorálního výstupu (Glass et al., 2010). Fázový posun, způsobený umístěním zvířete do běhacího kolečka nebo přímo aplikací NPY, je světelným pulzem inhibován (Biello a Mrosovsky, 1995). Pokud byl světelný pulz aplikován během pozdní noční fáze a současně s ním bylo zvíře umístěno do běhacího kolečka, nebo mu byla aplikována dávka NPY, došlo k 24

inhibici účinku světla a k očekávanému fázovému posunu nedošlo. IGL je tedy ovlivňován oběma typy vstupů, světelnými i nesvětelnými (Ralph a Mrosovsky, 1992, Biello et al., 1994). 5.2.2 Serotonin Serotonin (5 hydroxytryptamin) (5 HT) je důležitým neurotransmiterem cirkadiánní nesvětelné synchronizace. Účastní se přenosu informace o nesvětelném synchronizačním stimulu z ncl. mediálního raphe do vlscn (Meyer Bernstein a Morin, 1996) a z dorzálního ncl. raphe do IGL. Aktivaci serotonergní dráhy je třeba behaviorálního vybuzení (Rueter a Jacobs 1996). Behaviorálního vybuzení je v experimentu dosaženo vynucením aktivity v době, kdy je zvíře neaktivní, např. jeho umístěním do běhacího kolečka nebo injekční aplikací malé dávky fyziologického roztoku do podkoží spojené s manipulací se zvířetem (Sumová et al. 1996). Behaviorální aktivaci 5 HT dráhy lze také nahradit aplikací agonistů 5 HT. Nejčastěji používaným agonistou je [8 hydroxy 2 (di n propylamino) tetralin (8 OH DPAT) specificky působící na receptory 5 HT1A a 5 HT7.(Bobrzynska et al., 1996) Účinek 8 OH DPAT se liší u nočních a denních savců. Jeho aplikace během subjektivní noci nočnímu hlodavci způsobila velmi malý nebo žádný fázový posun (Tominaga et al., 1992; Cutrera et al., 1996), zatímco u denních hlodavců způsobila aplikace 8 OH DPAT fázové předběhnutí. Během subjektivního dne způsobila aplikace 8 OH DPAT u nočních hlodavců významné fázové předběhnutí, zatímco u denních neměla žádný účinek. 5 HT působí ovšem na celou řadu post i pre synaptických receptorů. Kvůli jednoznačnému potvrzení účinku a identifikaci podtypu 5 HT receptorů bylo třeba řady experimentů s použitím různých receptorově specifických antagonistů, např. ritanserinu, který se specificky váže na 5 HT7 či pindololu, který má silnou afinitu k 5 HT1A, ale jen velmi slabou k 5 HT7.receptoru (Lovenberg et al., 1993). Aplikací 8 OH DPAT a současně aplikací ritanserinu došlo k signifikantnímu snížení fázového předběhnutí (Obr. 8) (Lovenberg et al., 1993). Podání dalšího antagonisty, ketanserinu, který se specificky váže na 5 HT2 receptor, mělo velmi podobný účinek jako podání ritanserinu (Sumová et al. 1996). Seřízení hodin v SCN u nočních hlodavců nesvětelným stimulem bylo doprovázeno snížením exprese Per genů (Maywood et al., 1999; Horikawa et al., 2000). U denních živočichů není molekulární mechanismus nesvětelné synchronizace dosud znám. 25

Obr.8: Serotonergní fázové předběhnutí je pravděpodobně výsledkem aktivace 5 HT7 receptorů. Aplikace agonisty 8 OH DPAT (DPAT) a specifického antagonisty 5 HT7 ritanserinu signifikantně snížilo fázové předběhnutí (Lovenberg et al. 1993) 5.2.3 Melatonin Melatonin je syntetizován z L tryptofanu pomocí enzymu N acetyltransferázy (NAAT) v epifýze (Illnerová a Vaněček, 1988). Jeho hladina dosahuje maximálních hodnot během subjektivní noci, nezávisle na pohybové aktivitě. SCN kontroluje cirkadiánní rytmicitu syntézy melatoninu a zároveň jsou na membránách SCN neuronů exprimovány melatoninové receptory Mel 1a (MT1) a Mel 1b (MT2), přes které je jeho aktivita zpětně ovlivňována (Vaněček et al. 1987; Pevet et al., 2006). Působením na MT1 receptory inhibuje melatonin v SCN neuronální aktivitu. Působením na MT1 a MT2 receptory vyvolává melatonin fázové posuny pacemakeru (Liu et al. 1997). Účinek melatoninu na SCN je u nočních i denních savců stejný (Pitrosky et al., 1999; Slotten et al. 2002). Opakovaná aplikace melatoninu potkanům synchronizovala u nich volně běžícím rytmus v pohybové aktivitě (Redman 1997). Injekce melatoninu je schopná vyvolat fázové předběhnutí, avšak pouze je li podán v pozdní fázi subjektivního dne (Pitrosky et al. 1999; Slotten et al. 2002). Tento jeho účinek se využívá pro synchronizaci slepců nebo při léčbě jet lag syndromu (Arend et al., 1986; Sack et al. 1991). Díky tomu, že je melatonin tvořen pouze v noci, informuje délka jeho signálu organismus o denní a roční době. V zimě, 26

kdy jsou noci dlouhé, je melatoninový signál dlouhý, v létě, kdy jsou noci krátké, je naopak krátký (Illnerová et al., 1984). Na molekulární úrovni melatonin neovlivňuje změnu exprese hodinových genů Per1 a Per2, jako tomu u světelné a nesvětelné synchronizace. Místo toho melatonin podaný během soumraku mění expresi dvou jaderných sirotčích (orphan) receptorů, podílejících se na chodu endogenního rytmu, aktivuje expresi Rev erbα a prodlužuje zvýšenou hladinu Rorα mrna (Agez et al., 2007).. 5.2.4 Potrava Dokud je potrava dostupná neomezeně, jak tomu bývá ve standardních laboratorních podmínkách, je příjem potravy řízen cirkadiánními hodinami v SCN tak, že zvířata přijímají potravu převážně v době své aktivní fáze (Mistlberger, 1991). Při nedostatku potravy dokáží některé noční druhy přesunout svoji aktivitu do denní fáze dne (Challet et al., 2000; Blank a Desjardins, 1985). Jakmile je přístup k potravě omezen pouze na určitý časovém úseku, stává se období dostupnosti potravy obdobím aktivity zvířete (Mistlberger, 1991). Omezený přístup k potravě je označován jak tzv. restricted feeding (RF). Hodiny v SCN nejsou během RF synchronizovány s dobou příjmu potravy a zachovávají si svou fázi podle LD režimu (Hara et al., 2001). Na rozdíl od toho periferní oscilátory, např. v játrech, ledvinách, srdci, slinivce, střevě apod., jsou v důsledku RF seřízeny podle doby dostupnosti potravy (Stokkan et al., 2001, Damiola et al., 2000). Zmíněné periferní orgány mají schopnost autonomní oscilace, ale vzhledem k tomu, že nejsou u savců schopné vnímat světelné signály, je jejich synchronizace s vnějšími světelnými podmínkami seřizována signály z centrálního oscilátoru. Přesný způsob přenosu není dosud zcela objasněn, pravděpodobně se bude jednat o neuro humorální přenos (Balsalobre, 2002). Pokud jsou zvířata opakovaně vystavena RF, začínají být po čase aktivní ještě před dobou, kdy je jim umožněn přístup k potravě vykazují tzv. anticipační aktivitu (FAA z angl. food anticipatory activity). Tuto aktivitu vykazují i v případě, že jim byla odstraněna SCN (Stokkan et al., 2001). FAA trvá i několik hodin před podáváním potravy a je doprovázena zvýšenou aktivitou, ať už spontánní nebo aktivitou v běhacím kolečku, častějším pobývání v blízkosti krmítka, zvýšením tělesné teploty, nárůstem hladiny kortizolu a zvýšenou sekrecí duodenálních disacharidás (Stephan, 2002; Hara et al. 2001). Řada studií se zabývala hledáním oscilátoru v CNS, který řídí FAA. Z nedávných výsledků vyplývá, že jedním z nich by mohlo být dorsomediální jádro hypotalamu (DMH) (Gooley et al. 2006; Landry et al. 2006; Fuller et al. 2008). Zřejmě se však jedná o multioscilátorový systém. Synchronizace pohybové 27

aktivity s dostupností potravy i FAA byla zjištěna i u ryb Danio rerio. Ani u nich nebyla prokázána změna exprese hodinových genů v mozku (Sachez et al. 2009). Dostupnost potravy v přírodě je často omezená do určité denní fáze a nebo její shánění v určitou dobu může být spojeno s vysokým rizikem predace. Proto je pro živočichy ve volné přírodě důležitá schopnost synchronizace jejich aktivitu s dostupností potravy. Nebo pokud je potravy nedostatek, může změna aktivního období zvýšit možnost nalezení potravy v jiné časové nice (Challet 2010). 6 Denní a noční aktivita Jedním z možných evolučních důvodů vzniku cirkadiánních hodin bylo pravděpodobně i rozdělení niky podle času. Vytvoření odlišných chronotypů umožnilo znásobit využití prostoru jedné niky. Potravní i prostorová konkurence se díky vzniku různých chronotypů rozložila a umožnila soužití více organismů s podobnými potravními a prostorovými nároky v rámci jedné niky. Evoluční a ekologická výhoda je zřejmá. Jaký mechanismus zodpovídá za rozvržení aktivity do noční nebo denní fáze dne? Jedná se rozdílný mechanismus fungování biologických hodin u nočních a denních organismů? Poměrně přesně známe mechanismus vstupů (viz kap. 2.4.2) a způsob vzniku endogenního rytmu v SCN (viz kap. 3), ale je známo relativně málo o mechanismu, kterým centrální oscilátor přenáší časovou informaci vnějšího prostředí na výstupní behaviorální rytmy. Podle dosavadních výzkumů se zdá, že rozdíly ve struktuře centrálního oscilátoru, mechanismu jeho funkce a schopnosti synchronizace nejsou téměř žádné (viz níže). Průběh PRC si je též velmi podobný (Obr. 10). Chronotypy, které můžeme rozlišit např. pomocí snímání pohybové aktivity, dělíme na noční, denní a soumračný. Někteří jedinci jsou schopni měnit svoji aktivitu během života podle okolností (Oster at al., 2002, Kas et al., 1999, Mrosovsky et al., 2005). V laboratoři lze sledovat aktivitu zvířat poměrně snadno a to buď spontánní Obr. 9 : Aktogram typicky noční a denní aktivity (Blanchong et al., 1999) aktivitu pomocí detektorů infračerveného záření nebo vybuzenou aktivitu pomocí otočného 28

kolečka, ve kterém zvíře běhá. Záznam, neboli aktogram, nám umožní vyhodnotit, zda se jedná o denní nebo noční zvíře (Obr. 9). V přírodě ale často nelze jednotlivé druhy označit jako striktně denní nebo striktně noční. Vysoká plasticita cirkadiánní aktivity je známá především u ryb. Juvenilové se často rodí s jinou denní aktivitou než dospělci. Jedním z důvodů může být, že se živí jiným typem potravy. U teritoriálních druhů tento rozdíl v aktivitě může mít ochrannou funkci juvenilů před dospělci vlastního druhu. Další faktory, které byly sledovány v závislosti na schopnosti měnit aktivitu jedince během života jsou změna predačního nebo kompetičního tlaku, reprodukční období, teplota vody, dostupnost potravy nebo roční období (Reebs et al.; 2002). Schopnost měnit svůj chronotyp byla sledována i u některých savců (Mrosovsky et al., 2005; Kas et al., 1999; Oster et al., 2002). Nejznámějším studovaným modelem je osmák degu, Octodon degus. Běžně bývá v experimentech používán jako jeden z mála laboratorních modelů savce s denního aktivitou (většina laboratorních hlodavců jsou zvířata noční), protože jeho spontánní aktivita je v laboratorních podmínkách denní. V přírodě se také řadí mezi druhy s denní aktivitou. Ovšem jeho střídání spánkového a pohybového rytmu často přechází do krepuskulární (soumračné) aktivity. Experimentálně bylo prokázáno, že pravidelným umísťováním běhacího kolečka do klece dochází k přesunutí jeho aktivity do noční fáze dne (Kas et al., 1999). Flexibilita cirkadiánního sytému je charakteristická pro méně domestikované či volně žijící druhy. V přírodě je vysoká míra flexibility většinou běžná, domestikovaná zvířata tuto schopnost ztrácí nebo je u nich výrazně omezena. Flexibilita cirkadiánního systému se však projeví i v případě laboratorního zvířete, pokud je umístěno do semi přírodních podmínek (viz 7.1.). 29