Vliv morfinu na cirkadiánní systém potkana

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyziologie Vliv morfinu na cirkadiánní systém potkana Bc. Michaela Platilová Praha 2013 Vedoucí diplomové práce: RNDr. Zdeňka Bendová, Ph.D.

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci zpracovala samostatně a použila pouze literaturu uvedenou v seznamu. 2

3 Poděkování Ráda bych na tomto místě poděkovala RNDr. Zdeňce Bendové, Ph.D. za odborné vedení práce a vstřícnou spolupráci, kterou přispěla k vypracování této diplomové práci. 3

4 Abstrakt Cirkadiánní rytmy savců jsou řízeny endogenními biologickými oscilátory. Hlavní oscilátor je umístěn v suprachiasmatických jádrech hypotalamu a synchronizuje fáze podřízených periferních oscilátorů uložených v mnoha orgánech a tkáních. V přirozených podmínkách jsou cirkadiánní rytmy synchronizovány s vnějším 24hodinovým dnem, především střídáním světla a tmy. Cirkadiánní systém je citlivý i k řadě nesvětelných stimulů, jako je vynucená pohybová aktivita nebo sociální interakce, ale také stres, farmaka, alkohol a opiáty. Časované podávání opiátů způsobuje fázové posuny cirkadiánních rytmů v chování a negativně ovlivňuje i světelnou synchronizaci. Tato práce se zabývá studováním vlivu akutně podávaného morfinu na aktivitu buněčných signálních kaskád v buňkách SCN, důležitých pro funkci cirkadiánního pacemakeru, a pokouší se objasnit molekulární podstatu interakce opioidního a cirkadiánního systému. Naše výsledky ukazují, že akutní aktivace opioidní signalizace ovlivňuje cirkadiánní pacemaker pravděpodobně nepřímo a suprachiasmatické jádro získává informace aferentacemi z jiných mozkových struktur. Vedlejším výsledkem našich experimentů je snížení hladin perk1/2 a pgsk3β dvě hodiny po světelném pulsu, které ještě nebylo popsáno. Klíčová slova: cirkadiánní rytmy, suprachiasmatická jádra, opioidy, morfin 4

5 Abstract Circadian rhythms are controlled by endogenous mammalian biological oscillators. The main oscillator is located in the suprachiasmatic nuclei in the hypothalamus and entrains the phases of slave peripheral oscillators located in many organs and tissues. Under natural conditions, circadian rhythms are synchronized with an external 24-hour day, by light-dark changes during the day. In addition, the circadian system is sensitive to a number of non-photic stimuli, such as arousal or social interactions, severe stress, medicines, alcohol or opiates. Timed application of opioids causes phase shifts of the circadian rhythmicity in behaviour and negatively affects light synchronization. The aim of this work is to explore the effect of acute morphine on the activity of cellular signaling cascades in SCN cells, that are essential for the proper function of the circadian clock, and to elucidate the molecular interaction between opioid and circadian system. Our data suggest that acute activation of opioid signalization affect the circadian clock indirectly, and suprachiasmatic nuclei obtain the information via afferents form other part of brain. Besides that, the side data of our work show the decrease of perk1/2 a pgsk3β within two hours after the light pulse, which is the observation that has not been yet published. Keywords: circadian rhythms, the suprachiasmatic nucleus, opioids, morphine 5

6 Obsah Seznam zkratek Úvod Literární přehled Cirkadiánní systém Suprachiasmatická jádra (SCN) Světelná a nesvětelná synchronizace cirkadiánního systému Opioidy a jejich význam Opioidní receptory (OR) Vliv opioidů na cirkadiánní systém perk (phosphorylated Extracellular signal Regulated Kinase) pgsk (phosphorylated Glycogen Synthase Kinase) pstat (phosphorylated Signal Transducers and Activators of Transcription) Cíle diplomové práce Materiál a metody Experimentální zvířata Experimentální paradigma EXPERIMENT 1: Vliv akutní aplikace morfinu na expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β, a transkripčních faktorů STAT v SCN potkana EXPERIMENT 2: Vliv akutní aplikace morfinu na světlem indukované změny v expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β v SCN potkana Stanovení exprese vybraných hodinových genů pomocí imunohistochemie Materiál a vybavení

7 Protokol imunohistochemie Analýza obrazu Výběr oblasti Počítání buněk v SCN Zpracování dat Přepočet na procenta Statistická analýza Výsledky Vliv akutní aplikace morfinu na expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β, a transkripčních faktorů STAT v SCN potkana Vliv akutní aplikace morfinu na světlem indukované změny v expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β v SCN potkana Diskuse Vliv akutní aplikace morfinu na expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β, a transkripčních faktorů STAT v SCN potkana Vliv akutní aplikace morfinu na světlem indukované změny v expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β v SCN potkana Závěr Literatura

8 Seznam zkratek 1 Ab 2 Ab ABC AC Akt AMK AVP BMAL-1 BSA BW373U86 Ca 2+ CaM camp CBP CBP/p300 CKI ε CLOCK CNS CREB Cry CT DAB DADLE DAMGO DD dmscn ERK EtOH Gi/Go primární protilátka sekundární protilátka avidin-biotin komplex adenylátcykláza protein kináza B aminokyselina arginin-vasopresin brain and muscle Arnt-like protein-1 bovine serum albumine, hovězí sérový albumin 4-[(R)-[(2S,5R)-2,5-dimethyl-4-prop-2-enylpiperazin-1-yl]-(3- hydroxyphenyl)methyl]-n,n-diethylbenzamide vápenatý iont calmodulin cyclic guanosine monophosphate CREB-binding protein CREB-binding protein/e1a binding protein p300 casein-kináza 1ε circadian locomotor output cycles kaput centrální nervová soustava calcium/camp response element binding protein Cryptochrome circadian time, cirkadiánní čas 3,3 -diaminobenzidin D-Ala 2, D-Leu 5 ]-Enkephalin [D-Ala 2, N-MePhe 4, Gly-ol]-enkephalin dark-dark, stálá tma dorsomedial suprachiasmatic nuclues, dorsomediální část suprachiasmatických jader extracellular signal regulated kinase ethanol G inhibitory/ G other 8

9 GIRK G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channels GPCR G protein coupled receptor GRP gastrin-releasing peptid GSK Glycogen synthase kinase GTP guanosine-5'-triphosphate H histon H 2 O 2 peroxid vodíku HSF-1 heat shock factor protein 1 IHC imunohistochemie IP3 inositol trisphosphate JAK Janus kináza JNK c-jun N-terminal kinase LD light-dark, režim světlo-tma MAPK mitogen-activated protein kinases mrna messenger ribonucleic acid NGS normal goat serum NRS normal rabbit serum OR opioidní receptor ORL opioid receptor-like PACAP pituitary adenylate cyclase-activating peptide PAP peroxidáza-anti-peroxidáza PBS phosphate-buffered saline, fosfátový pufr Per Period PFA paraformaldehyd PLC phospholipase C PNS periferní nervová soustava RHT retinohypotalamickým traktem RoRα RAR-related orphan receptor α SB (3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5- dione SCN suprachiasmatic nuclei, suprachiasmatické jádro Ser serin SNC-80 4-[(R)-[(2S,5R)-4-allyl-2,5-dimethylpiperazin-1-yl](3- methoxyphenyl)methyl]-n,n-diethylbenzamide 9

10 SP1 specificity protein 1 STAT signal transducers and activators of transcription VIP vazoaktivní intestinální polypeptid vlscn ventrolateral suprachiasmatic nucleus, ventrolaterální část suprachiasmatických jader vs. versus ZT zeitgeber time 10

11 1. Úvod Všechny organismy v přírodě vykazují denní rytmy ve většině svých fyziologických a behaviorálních procesů. U savců jsou tyto rytmy koordinovány tzv. cirkadiánním pacemakerem, který leží v suprachiasmatických jádrech (SCN) předního hypotalamu. Cirkadiánní systém musí umožňovat adaptaci organismu ke změnám ve vnějším prostředí a je proto citlivý k synchronizátorům, cyklickým signálům z vnějšího prostředí. V přirozených podmínkách je dominantním synchronizátorem střídání světla a tmy během dne a noci, které synchronizuje endogenní cirkadiánní periodu s přesným 24 hodinovým solárním dnem. Cirkadiánní systém je ke světlu citlivý pouze v noční fázi dne; světlo zvečera fázově zpožďuje, světlo v pozdní noci nebo zrána zrychluje pacemaker fázovým předběhnutím. Poškození cirkadiánního systému, ať již mutacemi hodinových genů nebo častým narušováním přirozené světelné synchronizace např. přelety přes časová pásma nebo prací na směny, vede k desynchronizaci celého cirkadiánního systému a následně k vážným zdravotním problémům. Ty zahrnují jednak spánkové poruchy, ale i radikální zvýšení incidence metabolického syndromu, kardiovaskulárních chorob, diabetu typu 2 a rakoviny prsu, tlustého střeva a prostaty. Cirkadiánní systém je kromě světla citlivý i k řadě jiných přirozených stimulů, tzv. nesvětelných, jako je vynucená pohybová aktivita nebo sociální interakce, které modulují funkci SCN. Avšak některé patologické stavy jako je silný stres, některá farmaka, alkohol, nebo opiáty způsobují fázové posuny celého cirkadiánního systému a negativně ovlivňují i světelnou synchronizaci. Tato práce se zabývá studováním vlivu akutně podávaného morfinu na aktivitu buněčné signální kaskády v buňkách SCN, která je nepostradatelná pro správné fungování molekulárního hodinového mechanismu a je spojována také s přenosem informace o světle na cirkadiánní systém. 11

12 2. Literární přehled 2.1. Cirkadiánní systém Cirkadiánní (lat. circa = přibližně, dies = den) rytmus je biologický rytmus s periodou o délce přibližně jednoho dne. Během evoluce se vyvinul molekulární mechanismus vytvářející rytmický signál, který časově reguluje fyziologické funkce a připravuje organismus na pravidelné střídání činností během dne, jako je fyzická aktivita, spánek, příjem potravy a mnoha dalších. Tento molekulární mechanismus je založen na vzájemně propojených transkripčních pozitivně-negativních zpětnovazebných smyčkách tzv. hodinových genů. U savců tvoří proteiny hodinových genů CLOCK (the circadian locomotor cycles kaput) a BMAL-1 (brain and muscle Arnt-like protein-1) heterodimer a působí jako hlavní transkripční aktivátory hodinových genů Per1, Per2 a Per3 (Period), Cry 1 a Cry2 (Cryptochrome), RoRα (RAR-related orphan receptor α) a RevErbα vazbou na E-box jejich promotorů (Falcón and McClung, 2009). Proteiny genů PER a CRY tvoří dimery v cytoplasmě, vrací se do jádra a blokují aktivitu heterodimeru CLOCK/BMAL1. Tím blokují svojí vlastní transkripci. RoRα a RevErbα regulují pozitivně a negativně transkripci genu Bmal1. Zároveň jsou proteiny hodinových genů posttranslačně modifikovány v cytoplasmě, zejména fosforylací casein-kinázou 1ε (CKI ε) a glykogen syntázou kinázou 3 beta (GSK3β), a tím uvedeny do degradačního procesu. Negativní inhibice komplexu CLOCK/BMAL1 je tak uvolněna a celý proces může začít znovu. Tyto interakce vytváří molekulární podstatu endogenních cirkadiánních oscilací, které probíhají s periodou o několik minut kratší nebo delší než je 24 hodin v závislosti na druhu organismu (Fu and Lee, 2003; Paul et al., 2012; Takahashi et al. 2008). Bylo zjištěno, že v organismu savců je takovýmto mechanismem vybavená téměř každá buňka těla. Je přítomen například v buňkách orgánů, jako jsou játra, ledviny, srdce, plíce apod. (Schibler et al. 2003). U savců však existují centrální biologické hodiny uložené v hypotalamu v párových shlukách neuronů, tzv. suprachiasmatických jádrech (obr. 1). Endogenní oscilace generované v těchto jádrech jsou seřizovány stimuly z vnějšího prostředí, zejména pravidelným střídáním dne a noci a zajišťují tak periodu, která je rovna periodě rotace Země kolem své osy (Abe et al., 2002). Centrální hodiny synchronizují následně fáze 12

13 periferních oscilátorů tak, aby fyziologické funkce organismu byla ve vzájemném časovém souladu (Schibler et al., 2003). Obr. 1 Poloha SCN (převzato online z Suprachiasmatická jádra (SCN) Suprachiasmatická jádra jsou ve svých vlastnostech heterogenní, i co se týče jejich aferentních a eferentních drah. Dělí se na dvě hlavní části: jádro, neboli ventrolaterální část SCN (vlscn) a obal, neboli dorsomediální část SCN (dmscn). Topografická organizace těchto částí naznačuje funkční rozdělení SCN. VlSCN je umístěna nad optickým chiasma a je charakterizována neurony, které syntetizují vazoaktivní intestinální polypeptid (VIP) a gastrin-releasing peptid (GRP). Je ohraničena dmscn, jež obsahuje neurony syntetizující arginin-vasopresin (AVP) a calretinin (Golombek and Rosenstein, 2010). VlSCN přijímá aferentní signály z retiny, intergenikulátního 13

14 lístku talamu, kterými přichází informace o světle a nesvětelných podnětech prostřednictvím genikulohypotalamického traktu, a také serotonergní inervaci z mediálního raphe. DmSCN přijímá většinu signálů z vlscn a vedou sem také nervová zakončení z paraventrikulárního jádra talamu a limbických oblastí (Leak and Moore, 2001). I když dmscn působí jako silnější autonomní oscilátor, jeho neuronální oscilace jsou synchronizované rytmickým uvolňováním VIP z vlscn. Buňky vlscn reagují na světelný podnět během subjektivní noci nárůstem exprese hodinových genů rodiny Per1 a Per2 a časných raných genů rodiny Fos, zatímco dmscn vykazuje cirkadiánní oscilace jejich exprese (Golombek and Rosenstein, 2010). Hodinové geny Per1 a Per2 jsou také rozdílně regulovány ve vlscn a dmscn. Ke světelné indukci i endogenní expresi Per dochází nejprve ve vlscn, a teprve potom se rozšíří do dmscn (Challet et al., 2003) Světelná a nesvětelná synchronizace cirkadiánního systému Jak již bylo zmíněno v úvodu, za normálních podmínkek je dominantním synchronizátorem střídání světla a tmy. Cirkadiánní systém je ke světlu citlivý pouze v noční fázi dne; světlo zvečera fázově zpožďuje, světlo v pozdní noci nebo zrána zrychluje pacemaker fázovým předběhnutím (Golombek and Rosenstein, 2010). Informace o světle je vedená do SCN monosynaptickým retinohypotalamickým traktem (RHT) ze sítnice. Ten po aktivaci světlem vylučuje glutamát a aktivované glutamátové receptory v SCN pak zvyšují intracelulární hladinu vápníku a spouští kaskádu buněčné signalizace, jejíž hlavním členem je kináza ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2), která vede k fosforylaci transkripčního faktoru CREB (calcium/camp response element binding protein) (Golombek and Rosenstein, 2010; Hirota and Fukada, 2004; Meijer and Schwartz, 2003; Travnickova-Bendova et al., 2002; Naruse et al., 2004). Fosforylovaný CREB váže protein CBP (CREB-binding protein), který funguje jako histonová acetyltrasferáza a celý komplex aktivuje transkripci genu Per1 (Lahti et al., 2012; Zhu and Zee, 2012), (obr. 2). Světlo takto zvyšuje hladinu Per1 v době, kdy je jeho endogenní hladina nejnižší. Tím se mění dynamika 14

15 molekulárního mechanismu a dochází k fázovým posunům celého cirkadiánního systému. Obr. 2 Molekulární regulace světelného signálu v SCN. Sítnice je spojená s SCN retinohypotalamickým traktem, který uvolňuje glutamát a PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating peptide) po světelném pulsu. Aktivované glutamátergní nebo PAC1 a VPAC2 receptory způsobí depolarizaci membrány a vtok Ca 2+. Výsledkem je aktivace ERK1/2 kinázy, která způsobí fosforylaci CREB. Aktivovaný CREB váže CBP protein v promotorové oblasti genů Per1 a Per2 a aktivuje jejich transkripci (Tardito et al., 2010). Podobně působí i řada nesvětelných synchronizátorů. Vynucená pohybová aktivita, stres nebo exogenní podávání hormonů, např. melatoninu způsobují také fázové posuny, cirkadiánní systém je ale k nesvětelným synchronizátorům citlivý zejména v denní fázi dne a reaguje na ně především fázovým předběhnutím (Kosobud et al., 2007; Bilu and Kronfeld-Schor, 2013; Pandi-Perumal et al., 2008). Podobně jako přirozené nesvětelné synchronizátory působí i řada farmak a chemických látek, které se do organismu dostávají jako léčiva nebo jako drogy. Velkou skupinu takových látek tvoří opiáty. Jejich působení na cirkadiánní systém je již prokázán, mechanismus jejich působení však doposud není znám. 15

16 2.2. Opioidy a jejich význam Jako opioidy jsou označovány látky peptidické povahy, které se vážou na opioidní receptory (OR). Opioidní receptory se nacházejí zejména v centrální nervové soustavě (CNS), v menší míře v periferní nervové soustavě (PNS), a také v dalších tkáních savců (Harrison et al., 1998; Minami and Satoh, 1995). Opioidy mají mnohé farmakologické účinky. Jsou nenahraditelným typem analgetik určených ke zmírnění intenzivní bolesti akutní, nádorové a v řadě případů chronické nenádorové bolesti. Jejich adekvátní používání může být někdy komplikováno opiofobií - nadměrným strachem z účinku opioidů, např. ze vzniku závislosti a přehnané obavy ze vzniku nezvládnutelných vedlejších účinků. Těch má dlouhodobé užívání opiátů celou řadu. Může to být dechová deprese, nauzea a zvracení, sedace a deprese kognitivních funkcí, obstipace, svědivka, fyzická závislost a tolerance, psychická závislost a další (Davis and Pasternak, 2005; Passik and Weinreb, 2000). Morfin působí v CNS na opioidní receptory spřažené s G-proteiny (Trescot et al., 2008; Byku et al., 2000a). Mechanismus působení akutního a chronického podání morfinu a jeho vysazení se od sebe výrazně liší. Zatímco jednorázová aplikace morfinu inhibuje adenylátcyklázu (AC) a snižuje tím hladinu intracelulárního camp (cyclic adenosine monophosphate), chronické podávání ji naopak zvyšuje. Podobně se mění i aktivita MAPK (mitogen-activated protein kinases) kinázy v řadě mozkových struktur (Narita et al., 2002). Morfin zvyšuje hladinu noradrenalinu v hypotalamu potkanů (Glavin et al., 1983) a v cílových strukturách limbického systému zvyšuje dopamin (Carboni et al., 2000). Vysazení chronického opiátu naopak redukuje dopamin a zvyšuje hladinu noradrenalinu po stresových stimulech (Glavin et al., 1983; Diana et al., 1999; Maldonado, 1997). V poslední době se intenzivně studuje vliv chronicky podávaného morfinu a jeho vysazení na posttranslační modifikace histonů, tedy jeho vliv na epigenetickou regulaci genové transkripce. Zjistilo se, že zatímco aplikace morfinu indukuje fosforylaci histonu H3 ve striatu (Mashayekhi et al., 2012), jeho vysazení má za následek metylaci a acetylaci histonu H3, které kulminuje 7. den po vysazení morfinu (Sanchis-Segura et al., 2009). 16

17 Opioidní receptory (OR) Opioidní receptory patří do skupiny receptorů spřažených s G proteiny (GPCR), což je velká skupina receptorů s typickými heterotrimerními GTPvázajícími regulačními proteiny známými jako G proteiny. Opioidní receptory se dělí na čtyři podtypy: δ, κ, µ a ORL1 (opioid receptor-like) receptor. OR tvoří sedm transmembránových domén. První exon kóduje N-konec a první transmembránovou doménu, druhý exon kóduje další tři transmembránové domény a třetí exon kóduje poslední tři transmembránové domény a C-konec (obr. 3). Jedinou výjimkou je µor, který má navíc čtvrtý exon na 3 -konci, který kóduje posledních 12 aminokyselin (AMK) na intracelulárním C-konci (Davis and Pasternak, 2005). Obr. 3 Struktura δ a κ OR (Davis and Pasternak, 2005). Agonisty OR lze rozdělit na endogenně produkované (např. enkefaliny, endorfiny, dynorfiny, nociceptin), a exogenně podávané (např. morfin, DAMGO, DADLE). Dle účinků lze agonisty dělit na plné-vyvolávající maximální účinek (např. DAMGO pro µ receptory), a parciální-vyvolávající pouze částečný účinek (např. morfin pro µ, δ i κ receptory). Tradičními antagonisty OR jsou naloxon, metyl-naltrexon, alvimopan, naltrindol. Dále mohou na receptory působit látky, které působí na jednom 17

18 receptoru jako agonisté či parciální agonisté a na jiném receptoru jako antagonisté (např. nalbufin). OR jsou spojeny s inhibičními G proteiny skupiny Gi/Go citlivými k pertusis toxinu. Výsledkem jejich aktivace jsou inhibice AC a napěťově ovládaných Ca 2+ kanálů, stimulace G proteiny ovládaných dovnitř usměrňujících K+ kanálů (GIRK), zvýšení intracelulární hladiny Ca 2+, aktivace MAPK kináz a aktivace signální dráhy fosfolipázy C (PLC) (Davis and Pasternak, 2005; Williams et al., 2001), (obr. 4). OR interagují i s jinými signálními molekulami jakými jsou kalmodulin (CaM) (Wang et al., 1999) či aktivátory transkripce STAT5A (Mazarakou and Georgoussi, 2005). CaM je na receptoru vázán na stejné vazebné místo jako G proteiny. Po aktivaci receptorů je vytěsněn kompetujícími G proteiny a aktivuje další signalizační kaskády (Wang et al., 1999). STAT5A je po aktivaci receptorů fosforylován, dimerizuje a je transportován do jádra, kde zahajuje transkripci příslušných genů (Mazarakou and Georgoissi, 2005). Obr. 4 Schematické znázornění signalizace µ OR aktivovaného agonistou. Aktivace receptoru agonistou katalyzuje disociaci G proteinu na α podjednotku s vázaným GTP a komplex podjednotek βγ. Ty pak regulují aktivitu řady efektorů (AC, MAPK, PLC, iontové kanály), z nichž některé katalyzují tvorbu signálních molekul (camp, IP3) vyvolávajících buněčnou odpověď (podle Taylor and Fleming, 2001). 18

19 2.3. Vliv opioidů na cirkadiánní systém Cirkadiánní systém je citlivý zejména k synchronizačním účinkům světla, ale také k řadě nesvětelných stimulů. Jedním z nich je například vynucená pohybová aktivita, která zvyšuje v organismu hladinu endogenních opioidů. Neurochemické studie ukazují, že aferentní projekce do vlscn z intergenikulátního lístku talamu nesou kromě jiných peptidů také enkefaliny (Miller et al., 1996; Morin and Blanchard, 2001). Enkefaliny se vážou ke všem typům OR, ale s nejvyšší afinitou k δ-or (Kosterlitz et al., 1985). V SCN byly identifikovány mrna pro δ-or a µ- OR a byla testována řada agonistů OR, z nichž většina způsobila fázové změny v cirkadiánních rytmech, pokud byla aplikovaná v subjektivním dni (Mansour et al., 1994). Například agonisté δ-or a µ-or BW373U86, SNC-80, morfin nebo fentanyl způsobily fázové předběhnutí v lokomoční aktivitě křečka po podání v pozdním subjektivním dni (Marchant and Mistlberger, 1995; Byku and Gannon, 2000a; Byku and Gannon, 2000b). Morfin sulfát je nejčastěji používaným antinocicepčním opioidem. Interaguje se všemi třemi podtypy OR (δ, κ, µ), ale nejvyšší afinitu má k µ-or. Fentanyl je selektivni agonista, který se váže zejména k µ-or. Několik studií se zabývalo vlivem morfinu a fentanylu na cirkadiánní rytmicitu generovanou cirkadiánním pacemakerem, ale také vlivem na světelnou synchronizaci cirkadiánního systému. Akutní podání fentanylu způsobilo nejen fázové předběhnutí rytmu v pohybové aktivitě křečka, ale zablokovalo také indukci fázového posunu světlem v pozdní subjektivní noci (Vansteensel et al., 2003; Vansteensel et al., 2005). Fentanyl také významně snížil světlem indukovanou hladinu hodinového genu Per1 a snížil i endogenní hladinu Per2 (Vansteensel et al., 2005). Tyto výsledky naznačují přímou interakci signálních drah aktivovaných opioidy a světlem v buňkách SCN, i přímý vliv opioidů na mechanismus generování cirkadiánních oscilací. Konkrétní molekuly, které mohou spojovat cirkadiánní a opioidní systém ale nejsou známy. V této práci jsme testovali vliv morfinu na několik molekul, které by mohly splňovat roli integrátorů a převádět informace o opioidní signalizaci na molekulární procesy v SCN. 19

20 2.4. perk (phosphorylated Extracellular signal Regulated Kinase) Intracelulární signální kaskády jsou hlavními drahami v komunikaci mezi plasmatickou membránou a místy regulace v různých intracelulárních kompartmentech. Postupná aktivace kináz je společným mechanismem přenosu signálu v mnoha buněčných procesech. Mitogenem-aktivovaná protein kináza je dobře popsaná skupina spolu souvisejících intracelulárních signálních kaskád. Existují čtyři hlavní skupiny MAPK kináz: extracellular signal-regulated protein kinázy 1 a 2 (ERK1/2), p38 MAPK, c-jun N-terminal kináza (JNK), a extracellular signal-regulated protein kináza 5 (ERK5), které převádějí široké rozmezí extracelulárních podnětů do různých intracelulárních transkripčních i jiných vnitrobuněčných regulací (Seger and Krebs, 1995). MAPK jsou považovány za regulátory buněčné proliferace, diferenciace, učení a paměti. V poslední době se ukazuje, že mají důležitou roli i v regulaci bolesti a tlumí zánětlivé a neuropatické bolesti (Chen and Sommer, 2009; Ji et al., 2009). Aktivace ERK1/2 byla prokázána v oblastech mozku, které hrají důležitou roli v toleranci a závislosti vyvolané opakovaným podávání morfinu (Narita et al., 2002). Například jednorázové i opakované subkutánní injekce morfinu zvýšilo hladinu fosforylovaného ERK1/2 (perk1/2) v nucleus accumbens u myší (Liu et al., 2007). Dosavadní studie ukazují, že fosforylace ERK1/2 může být modulována morfinem i v buněčných kulturách neurálního a non-neurálního původu (Chen and Sommer, 2009). Aktivovaný ERK1/2 fosforyluje řadu substrátů v cytosolu, a v závislosti na síle podnětu se translokuje do jádra a usnadňuje transkripci celé řady genů (Butcher et al., 2005). V cirkadiánním systému hraje ERK1/2 velmi důležitou roli. Světelná stimulace během noci nebo subjektivní noci, ale nikoliv během dne, spouští okamžitou silnou fosforylaci ERK1/2 na threoninu 202 a tyrosinu 204 ve vlscn s maximem do 15 minut po osvětlení (Butcher et al., 2002; Dziema et al., 2003; Doi et al., 2007). Narušení MAPK aktivace blokuje jak světlem indukovanou expresi genů, tak i světelnou synchronizaci behaviorálních rytmů (Butcher et al., 2002). To ukazuje na to, že ERK/MAPK dráha je důležitá součást mechanismu, který propojuje světelnou stimulaci a fázové změny cirkadiánního systému (Butcher et al., 2002; Dziema et al., 2003). 20

21 V SCN existují také dva endogenní rytmy v hladině perk s různými fázemi. Jeden rytmus s maximem během subjektivního dne v dmscn a druhý s maximem během noci ve vlscn (Obrietan et al., 1998; Nakaya et al., 2003). Tato endogenní oscilace má pravděpodobně vliv na endogenní molekulární podstatu cirkadiánních oscilací prostřednictvím fosforylace proteinu hodinového genu Bmal1 (Sanada et al., 2002). Vzhledem k širokému spektru vnějších signálů, které aktivují ERK1/2 v různých částech mozku, se můžeme domnívat, že v SCN se hladina perk1/2 může měnit nejen po světelné, ale i po nesvětelné stimulaci a tím integrovat různé synchronizační signály do jednotné odpovědi cirkadiánního systému pgsk (phosphorylated Glycogen Synthase Kinase) Glycogenové syntázové kinázy 3 jsou serin/threoninové kinázy, které byly původně objevené jako regulační enzymy glukózového metabolismu (Wang et al., 2012). Existují dvě základní formy, GSK3α a GSK3β, které jsou kódované dvěma geny a sdílejí 97% homologii v kinázové doméně (Rayasam et al., 2009). GSK3β negativně reguluje fosforylaci CREB na Ser129 (DaRocha-Souto et al., 2012). GSK3 kinázy regulují celou řadu buněčných procesů jako je metabolismus glykogenu, insulinová signalizace, buněčná proliferace a má také řadu neuronálních funkcí. Na rozdíl od jiných kináz je konstitutivně aktivní a je inaktivována fosforylací v rámci buněčné signalizace (Harwood, 2001; Doble and Woodgett, 2003). Zejména fosforylace na serinu 9 má inhibiční účinek a je studována zejména v souvisloti s regulací insulínové signalizace (Stambolic and Woodgett, 1994; Cross et al., 1995). Tento serinový zbytek je fosforylován zejména kinázou Akt, která hraje důležitou roli v regulaci metabolismu, transkripci a vývoji buněčného cyklu (Cross et al., 1995; Frame and Cohen, 2001; Fayard, 2005). Změny v GSK3 aktivitě jsou asociovány s celou řadou psychiatrických a neurodegenerativních onemocnění jako je Alzeimerova choroba, schizofrenie a autismus. Inhibitor GSK3 lithium se dlouhodobě používá jako složka antidepresivních léčiv (Grimes and Jope, 2001; Bartzokis, 2012). 21

22 Kináza GSK3β je významnou součástí molekulárního cirkadiánního mechanismu savců. Její aktivní fosforylovaná forma (pgsk3β) na Ser9 se v SCN a játrech mění během cirkadiánního cyklu. Má nejvyšší hladinu v ZT2 a nejnižší v ZT14. Hlavní úloha pgsk3β v cirkadiánním systému je ve fosforylaci proteinů hodinových genů PER2, CRY2, Rev-erbα a BMAL1 a regulace jejich vnitrobuněčné distribuce (Iitaka et al., 2005; Wei et al., 2011). Nedávné studie poukázaly na zapojení GSK3β do signalizační dráhy OR. Podání inhibitoru GSK3 SB216763, nebo 6-bromoindirubin-3'oximu zablokovalo rozvoj tolerance k chronicky podávánému morfinu a obnovilo jeho analgetický účinek na akutní bolest testovanou tail-flick testem. Zrušení morfinové tolerance injekcí kteréhokoliv inhibitoru bylo spojeno se zvýšením množství pgsk3β. Tato zjištění naznačují, že chronické podávání morfinu zvyšuje hladinu pgsk3β, která je zodpovědná za vznik tolerance k morfinu (Parkitna et al., 2006) pstat (phosphorylated Signal Transducers and Activators of Transcription) Rodina genů STAT se skládá ze sedmi členů (STAT1,STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B a STAT6), které fungují jako transkripční faktory a zprostředkovávají vliv řady ligandů, např. cytokinů, růstových faktorů, řady hormonů a také opiodů, na expresi mnoha cílových genů. Navázáním ligandu na receptory spojené s tyrosinkinázami JAK a Src dochází k fosforylaci proteinů STAT a jejich aktivaci. Aktivované STATy vytvářejí homo- a heterodimery, které translokují do jádra, kde se váží na specifické sekvence v promotorech příslušných genů a modulují jejich expresi. Nedávno bylo zjištěno, že proteiny STAT mohou zprostředkovávat genovou expresi i v jejich nefosforylovaném stavu, přestože cílové geny mohou být jiné (Yang and Stark, 2008). Kromě jejich přímé vazby k promotoru cílových genů, mohou STAT proteiny interagovat s jinými transkripčními faktory, jako jsou SP1 nebo HSF-1, nebo s koaktivátory transkripce jako CBP/p300, s kinázou ERK2 a několika membránovými receptory (Chatterjee-Kishore et al., 2000). Jednotlivé STATy mohou být aktivovány mnoha různými stimuly v závislosti na tkáni. Stejná molekula STAT může být aktivována 22

23 několika extracelulárními signály a několik tyrosinových receptorů může aktivovat více než jeden STAT protein. STAT1 a STAT2 jsou hlavními cíly cytokinů a mohou fungovat jako nádorové supresory (Najjar and Fagard, 2010). STAT4 a STAT6 jsou aktivovány také interleukiny a jsou spojovány zejména s revmatickými onemocněními (Luan et al., 2012; Yamaoka and Tanaka, 2009). Aktivace STAT3 je spojena s růstovými hormony a interleukinem-6 (Colomiere et al., 2009; Bates and Myers, 2004). V periferních orgánech, jako jsou ledviny nebo srdce zprostředkovává STAT3 morfinem indukované změny v buněčné proliferaci a mechanismu opioidy indukované kardioprotekce (Gross et al., 2006). STAT5 byl původně objeven jako transkripční faktor, který zprostředkovává odpověď epiteliálních buněk mléčné žlázy na prolaktin (Watson and Burdon, 1996). Nedávná pozorování ale ukázala, že obě formy STAT5, STAT5a a STAT5B, také fyzicky interagují s C-terminální doménou OR. STAT5a interaguje µ-or a STAT5b s δ-or (Mazarakou and Georgoussi, 2005; Georganta et al., 2010). Oba STAT5 se tak mohou přímo účastnit opioidní signalizace v buňce. Přítomnost proteinů STAT v SCN nebyla dosud prokázána. Existuje pouze několik teoretických prací, které předpokládají expresi STAT3 v SCN (Bozek et al., 2009; Yan et al., 2008). Předběžné studie naší laboratoře ale odhalily přítomnost STAT3 a STAT5a i STAT5b v SCN a nabízejí tak otázku, zdali proteiny STAT v SCN nemohou hrát roli v opiodní signalizaci cirkadiánního systému. 23

24 3. Cíle diplomové práce Cílem této práce bylo zjistit vliv akutního podání morfinu na hladiny exprese fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK-3β, a transkripčních faktorů STAT v SCN dospělého potkana. Také nás zajímalo, jaký bude mít vliv akutní aplikace morfinu na světlem indukované změny v expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK-3β v SCN dospělého potkana. Navrženým hlavním pracovním postupem byla imunohistochemické detekce specifických proteinů s využitím imunologické vazby antigenu a protilátky. 24

25 4. Materiál a metody 4.1. Experimentální zvířata Pro naše pokusy byli použiti dospělí potkani (Rattus norwegicus) samčího pohlaví kmene Wistar o hmotnosti cca 300 g od firmy Velaz, s.r.o. Česká republika. Zvířata byla krmena standardní laboratorní krmnou směsí. K potravě a pitné vodě měla přístup ad libitum. Teplota ve zvěřinci byla udržována na 23 C ± 2 C. Denní sv ětlo bylo zajištěno 40 W zářivkami, intenzita osvětlení se pohybovala mezi 150 a 250 lux, podle umístění chovných klecí. Definované světelné režimy byly kontrolovány automatickými spínacími hodinami Experimentální paradigma EXPERIMENT 1: Vliv akutní aplikace morfinu na expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β, a transkripčních faktorů STAT v SCN potkana Samci potkanů byli chováni ve zvěřinci na světelném režimu LD12:12, a měli světlo od 8:00 do 20:00 po dobu dvou týdnů. Po této adaptaci se provedl pokus, kdy byl potkanům aplikován intraperitoneálně morfin (1 mg/kg) v ZT7 (zeitgeber time 7), tj. 7 hodin po rozsvícení. Odběry mozků byly prováděny v různých časových intervalech od 30 minut až do 25 hodin po aplikaci spolu s kontrolními zvířaty (obr. 5 a obr. 6). V každém časovém bodě byli usmrceni 3 potkani s aplikovaným morfinem a 3 kontrolní potkani. Po usmrcení byly mozky potkanů vyjmuty a zpracovány dle protokolu imunohistochemie (IHC) popsaného níže pro stanovení exprese fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β, a transkripčních faktorů STAT. 25

26 Obr. 5 Časová osa odběrů vzorků pro IHC (perk1/2, pgsk3β). Aplikace morfinu modrá šipka, odběr vzorků černé šipky s pořadím odběrů vzorků, směr odběru vzorků červená šipka. Obr. 7 Časová osa odběrů vzorků pro IHC (STAT). Aplikace morfinu modrá šipka, odběr vzorků černé šipky s pořadím odběrů vzorků, směr odběru vzorků červená šipka. 26

27 EXPERIMENT 2: Vliv akutní aplikace morfinu na světlem indukované změny v expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β v SCN potkana Cílem tohoto experimentu bylo zjistit, jaký vliv má aplikace morfinu na světlem vyvolané změny v expresi perk1/2 a pgsk3β. Samci potkanů byli chováni ve zvěřinci na světelném režimu LD12:12, a měli světlo od 8:00 do 20:00 po dobu dvou týdnů. V den pokusu byli potkani ve stálé tmě (DD), tzn., že jim v obvyklý čas nebylo rozsvíceno. V CT14 (circadian time 14) jim byl podán intraperitoneálně morfin (1 mg/kg) a následně jim v CT15 byl aplikován 30 minutový světelný puls. Odběry mozků byly prováděny v různých časových intervalech od 15 minut až do 8 hodin po aplikaci světelného pulsu spolu s kontrolními zvířaty, kterým byl aplikován pouze světelný puls a další skupinou intaktních zvířat, držených v DD (obr. 7). V každém časovém bodě byla usmrcena 3 zvířata s aplikovaným morfinem a světelným pulsem, 3 světlem pulsovaná zvířata a 3 kontrolní zvířata. Po usmrcení byly mozky potkanů vyjmuty a zpracovány dle protokolu imunohistochemie popsaného níže pro stanovení exprese fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β. Obr. 7 Časová osa odběrů vzorků pro IHC (perk1/2, pgsk3β). Aplikace morfinu modrá šipka, aplikace světelného pulsu žlutá šipka, odběr vzorků černé šipky s pořadím odběrů vzorků. 27

28 4.3. Stanovení exprese vybraných hodinových genů pomocí imunohistochemie Imunohistochemie je metoda, jejímž základním cílem je detekce specifických antigenních determinant (molekul či jejích částí) s využitím imunologické vazby, tj. na principu vazby antigenu a protilátky. Je několik základních typů imunohistochemických metod: Přímá metoda Nepřímá dvoustupňová metoda Nepřímé trojstupňové metody o Metoda peroxidáza-anti-peroxidázového komplexu (PAP) o Metoda avidin-biotin komplexu (ABC) komplexem. Pro naše stanovení jsme používali nepřímou trojstupňovou metodu s ABC Materiál a vybavení Přístroje: Kryokat Leica CM 1850 Světelný mikroskop Olympus Provis Běžné laboratorní vybavení Chemikálie: Fosfátový pufr, ph = 7,4 (PBS, phosphate-buffered saline; Sigma) Paraformaldehyd, 4% (PFA), (v 0,1M fosfátovém pufru, ph=7,2; Sigma) Peroxid vodíku, 0,5%, 30% (H 2 O 2 ; Penta) Hovězí sérový albumin, 0,3%, 1% (BSA, bovine serum albumine; Sigma) 3,3 -diaminobenzidin (DAB; Sigma) Sacharosa, 20% (v 0,1M fosfátovém pufru, ph=7,2; Penta) Ethanol, 70%, 96% (EtOH; Penta) Xylen (Penta) DPX Mountant for histology (Sigma) 28

29 Thiopental sodný (INC Czech Republic a.s.) Heparin (Zentiva) Triton-x, 0,3% (Sigma) Želatina (Carl ROTH) Domestos (Unilever Hungary Ltd.) Cryomount (zalévací médium pro zmrazené řezy; Bamed s.r.o.) Kity: Vectastain ABC KIT PK-6105 Goat IgG PK-6101 Rabbit IgG Primární protilátky: perk1/2, ředění 1:1500 (Cell Signalling Technology) pgsk3β, ředění 1: 600 (Cell Signalling Technology) STAT3, ředění 1:500 (Cell Signalling Technology) pstat3, ředění 1:500 (Cell Signalling Technology) STAT5a, ředění 1:500 (Invitrogen) Protokol imunohistochemie Schéma: Odběr a fixace tkáně Krájení řezů na free-floating techniku IHC Zablokování endogenních peroxidáz Zablokování nespecifického pozadí Vazba primární protilátky (1 Ab) Vazba sekundární protilátky (2 Ab) Amplifikace signálu pomocí avidin-biotin-horseradish peroxidásy (ABC) Detekce komplexu pomocí DAB reakce Nanesení řezů na skla Dehydratace a montáž preparátů pod krycí sklíčko 29

30 a) Odběr a fixace tkáně Odběr tkáně (mozku) probíhal po intraperitoneální perfusi potkanů 4% paraformaldehydem. Zvířata byla nejprve uspána thiopentalem sodným (50 mg/kg). Po uspání byl aplikován do srdce heparin (cca 500 U/l dospělého potkana) a zavedena kanyla přes levou srdeční komoru do aorty k provedení perfuse. V první fázi bylo přes kanylu aplikováno PBS (3 minuty) a poté 4% PFA (5 minut). Odebraný mozek byl dán k post-fixaci opět do 4% PFA na cca 12 hodin. Z PFA byl přenesen pro kryoprotekci do 20% sacharosy přes noc. Poté již mohl být zamražen a uchován v -80 C pro další zprac ování. b) Krájení řezů na free-floating techniku IHC Mozky byly krájeny na kryokatu Leica na 30 µm silné řezy. Teplota při krájení byla ± -23 C. Jednotlivé řezy se vkládaly do PBS pomocí štětce. c) Zablokování endogenních peroxidáz K zablokování endogenní aktivity peroxidáz se řezy inkubovaly po 10 minut v 0,5% H 2 O 2 v PBS a následně důkladně promyly 3x5 minut v PBS. d) Zablokování nespecifického pozadí Po promytí se blokovalo nespecifické pozadí 2% sérem, které bylo zvoleno podle druhu 2 Ab. Bylo použito 2% Normal Goat Serum (NGS), nebo 2% Normal Rabbit Serum (NRS) z kitu Vectastain ELITE v BSA pufru (1% BSA, 0,3% Triton-x v PBS). Inkubace v séru trvala 60 minut. 30

31 e) Vazba primární protilátky (1 Ab) Ze séra byly řezy přeneseny do primární protilátky ředěné v BSA pufru (v poměrech uvedených výše) a ponechány v inkubaci přes noc ve 4 C. Druhý den se řezy promyly 3x5 minut v 0,3% BSA. f) Vazba sekundární protilátky (2 Ab) Řezy se inkubovaly 60 minut při pokojové teplotě se sekundární protilátkou ředěnou v poměru 1:600 v 0,3% BSA (podle kitu Vectastain ELITE ABC reagent), a následně znovu promyly 2x5 minut v 0,3% BSA. g) Amplifikace signálu pomocí avidin-biotin-horseradish peroxidásy (ABC) Komplex avidin-biotinu s křenovou peroxidázou bylo nutné připravit 30 minut před použitím. Ředění ABC bylo 1:400 v 0,3% BSA (podle Vectastain ELITE ABC reagent). Inkubace trvala 60 minut při pokojové teplotě (cca 21 C) a nakonec byly řezy promyty 1x5 minut v 0,3% BSA a poté 3x5 minut v PBS. h) Detekce komplexu pomocí chromogenu Chromogenová tableta 3, 3 - diaminobenzidinu (10 mg) se rozpustila ve 20 ml PBS. Po rozpuštění se přidalo 7 µl 30% H 2 O 2 a řezy se inkubovaly dle potřeby 20 s 20 min. Řezy byly promyty 2x5 minut v PBS. i) Nanesení řezů na skla Řezy byby nanášeny pomocí jemných štětců na želatinovaná skla. Po nanesení se skla s řezy nechala uschnout. 31

32 j) Dehydratace a montáž preparátů Skla s řezy se dehydratovala: 5 min v 70% EtOH 2x5 min v 96% EtOH Prosycení rozpouštědlem: 3x5 min v xylenu Dehydratovaná a prosycená skla s řezy se pokapala DPX médiem a zakryla krycím sklem. Takto zamontovaná skla se minimálně jeden den, nejlépe však dva dny sušila při pokojové teplotě (cca 21 C). Po zaschnutí se skla očistila pomocí žiletky a vyleštila alkoholem Analýza obrazu Výběr oblasti Z každého mozku byla vybrána reprezentativní část mediální oblasti SCN (obr. 8). Výběr probíhal v počítači po nafocení všech preparátů světelným mikroskopem Olympus Provis. Obr. 8 Výběr oblasti. Ukázka výběru nevhodné příliš kaudální (a) a vhodné - mediální (b) oblasti SCN. SCN jsou vyznačena černou elipsou. 32

33 Počítání buněk v SCN Určení počtu buněk ve Vl a Dm části SCN se vyhodnocovalo manuálně pomocí Cell counter pluginu jako součásti softwaru ImageJ (NIH). SCN se rozdělilo na ventrolaterální a dorsomediální část podle exprese perk1/2, jak je ukázáno na obrázku 9. Šablony se uložily a používaly pro analýzu jednotlivých obrazů. Při počítání se započítávaly všechny buňky uvnitř a všechny buňky ležící na hraně ohraničených částí SCN. Obr. 9 Rozdělení SCN na Vl a Dm část v ImageJ programu Zpracování dat Přepočet na procenta Hodnoty byly převedeny na procenta maximální hodnoty získané v jedné IHC eseji. 33

34 Statistická analýza Data byla vyhodnocena základními statistickými metodami: aritmetický průměr: x = Σxi / n směrodatná odchylka: SD = [ (1/n 1) * Σ(xi x)2 ]1/2 střední chyba průměru: S.E.M. = SD/n1/2 Rozdíly mezi skupinami byly hodnoceny jednocestnou analýzou variance ANOVA s hodnotou P<0,05 potřebnou pro statistickou významnost. 34

35 5. Výsledky 5.1. Vliv akutní aplikace morfinu na expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β, a transkripčních faktorů STAT v SCN potkana. V prvním experimentu jsme sledovali vliv akutní aplikace morfinu na expresi perk1/2, pgsk3β, STAT3, pstat3 a STAT5a. Morfin byl podán intraperitoneálně v ZT7, tj. 7 hodin po rozsvícení. Odběry mozků byly prováděny v různých časových intervalech od 30 minut až do 25 hodin pro perk1/2 a pgsk3β a od 2 hodin pro stanovení STAT po aplikaci morfinu spolu s kontrolními zvířaty (viz kapitola 4.2.1). Naše výsledky ukázaly, že perk1/2 vykazuje denní rytmus s vysokými hladinami v noci ve vlscn (obr. 10A a 10C) a během dne v dmscn (obr. 10B a 10C). Morfin zvýšil významně hladinu perk1/2 pouze v dmscn 30 minut po aplikaci (P=0,0085, obr. 10B). Po jedné hodině byla ještě hladina mírně zvýšená, ale již nevýznamně. Dále jsme zjistili, že exprese pgsk3β naznačuje denní rytmus s maximem v noci. Akutní aplikace morfinu způsobila významný pokles hladiny pgsk3β v ZT9 v dmscn (P=0,0325, obr. 11A i 11B). Jiné změny nebyly statisticky významné. Výsledky týkající je změn v expresi proteinů STAT jsou založeny pouze na malém množství vzorků a jsou proto pouze orientační. Nefosforylovaná forma proteinu STAT3 naznačila rytmus s maximem v ZT22 v SCN u kontrolních, a v ZT18 u morfinem stimulovaných potkanů (obr. 12A). Morfin způsobil zvýšení jeho hladiny mezi ZT9 a ZT18 a tím rychlejší nástup maximálních hodnot. Hladina fosforylované formy pstat3 téměř kopírovala rytmus její nefosforylované formy. Vliv morfinu na expresi pstat3 neměl jednoznačný trend. (obr. 12A). Hladina transkripčního faktoru STAT5a v SCN nevykazovala žádné významné změny a po aplikaci morfinu se neměnila. Pokles hodnoty v ZT22 po aplikaci morfinu byl ojedinělý a vzhledem k nízkému počtu vzorků jej nelze považovat za významný (obr. 13A). 35

36 Obr. 10 Vliv akutní aplikace morfinu na expresi perk1/2 v SCN. Množství perk1/2 po aplikaci morfinu v ZT7 ve vlscn (A) a v dmscn (B) (modré sloupce). Kontrolní zvířata (černé sloupce). Data jsou vyjádřena jako procenta maximálního množství perk1/2 v celém SCN stanovené v jedné eseji. Každý sloupec představuje průměr ± SEM z 3-6 zvířat. C) Příklady imunohistochemické detekce perk1/2 v ZT 18, tj. době její maximální exprese ve vlscn a v ZT3, tj. době její maximální exprese v dmscn u obou skupin zvířat. 36

37 Obr. 11 Vliv akutní aplikace morfinu na expresi pgsk3β v SCN. Množství pgsk3β po aplikaci morfinu v ZT7 ve vlscn (A) a v dmscn (B) (modré sloupce). Kontrolní zvířata (černé sloupce). Data jsou vyjádřena jako procenta maximálního množství pgsk3β v celém SCN stanovené v jedné eseji. Každý sloupec představuje průměr ± SEM z 3-6 zvířat. C) Příklady imunohistochemické detekce pgsk3β v ZT 13, tj. době její minimální exprese v SCN a v ZT22, tj. době její maximální exprese v SCN u obou skupin zvířat. 37

38 Obr. 12 Vliv akutní aplikace morfinu na expresi Stat3 a pstat3 v SCN. A) Množství STAT3 (černé a šedé sloupce) a pstat3 (světle a tmavě oranžové sloupce) po aplikaci morfinu v ZT7 v SCN u kontrolních zvířat (černé a tmavě oranžové sloupce) a po aplikaci morfinu (šedé a světle oranžové sloupce). Data jsou vyjádřena jako procenta maximálního množství STAT3 a pstat3 v celém SCN stanovené v jedné eseji. B) Příklady imunohistochemické detekce STAT v ZT 11, tj. době minimální exprese v SCN a v ZT18, tj. v době s největším rozdílem exprese v SCN u kontrolních a morfinem ovlivněných zvířat. 38

39 39

40 5.2. Vliv akutní aplikace morfinu na světlem indukované změny v expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β v SCN potkana V našem druhém experimentu jsme sledovali vliv akutní aplikace morfinu na světlem vyvolané změny v expresi perk1/2 a pgsk3β. Morfin byl podán intraperitoneálně jednu hodinu před světelným pulsem v CT15. Odběry mozků byly prováděny od 15 minut až do 8 hodin po světelném pulsu spolu s kontrolními zvířaty (viz kapitola 4.2.2). Výsledky ukázaly, že perk1/2 je významně indukován do 15 minut po světelném pulsu v obou částech SCN (CT15 vs. P+15 min; P=0,0001). Po dvou hodinách po světelném pulsu dále došlo k významnému poklesu hladiny perk1/2 pod úroveň exprese naměřené u kontrolních zvířat, a to ve vlscn (CT17 vs. P+2h; P=0,0002), a po čtyřech hodinách i v dmscn (CT19 vs. P+4h; P= 0,0069). Významně snížená hladina přetrvávala 4 hodiny po pulsu ještě i ve vlscn (CT19 vs. P+4h; P= 0,0069) Morfin neměl žádný významný účinek na světlem indukované změny perk1/2. (obr. 14A a 14B). U fosforylované formy GSK3β došlo také ke snížení hladiny exprese dvě hodiny po světelném pulsu, ale pouze ve vlscn (CT17 vs. P+2h; P= 0,0002), (obr. 16A). Osm hodin po světelném pulsu se jeho hladina významně zvýšila ve vlscn (CT23 vs. P+8h; P= 0,0086), a na hranici významnosti bylo i zvýšení v dmscn (CT23 vs. P+8h; P= 0,0387). Morfin opět neměl žádný významný vliv na expresi pgsk3β v SCN. Zdánlivé změny hladiny pgsk3β 30 minut a 1 hodinu po pulsu u zvířat s aplikací morfinu nejsou statisticky významné. 40

41 Obr. 14 Vliv morfinu (M-morfin) na světelem indukovanou expresi perk1/2 v SCN (P-puls). Množství perk1/2 u kontrolních bez morfinu a světelného pulsu zvířat (černé sloupce), po světelném pulsu v CT15 (žluté sloupce) a po světelném pulsu v CT 15, který následoval 1 h po aplikaci morfinu v CT14 (modré sloupce) ve vlscn (A) a v dmscn (B). Data jsou vyjádřena jako procenta maximálního množství perk1/2 v celém SCN stanovené v jedné eseji. Každý sloupec představuje průměr ± SEM z 3-6 zvířat. 41

42 Obr. 15 Vliv morfinu (M-morfin) na světelem indukovanou expresi perk1/2 v SCN (P-puls). Příklady imunohistochemické detekce perk1/2 v době maximální světelné indukce perk1/2 v SCN v CT15 u kontrol, 30 min po světelném pulsu v CT15 a 30 min po světelném pulsu s předchozí aplikací morfinu, a v CT17, tj. 2 h po světelném pulsu v době světlem indukovaného poklesu perk1/2 v SCN pod úroveň u kontrolních zvířat. 42

43 Obr. 16 Vliv morfinu (M-morfin) na světelem indukovanou expresi pgsk3β v SCN (P-puls). Množství pgsk3β u kontrolních zvířat (černé sloupce), po světelném pulsu v CT15 (žluté sloupce) a po světelném pulsu v CT15, který následoval 1 h po aplikaci morfinu v CT14 (modré sloupce) ve vlscn (A) a v dmscn (B). Data jsou vyjádřena jako procenta maximálního množství pgsk3β v celém SCN stanovené v jedné eseji. Každý sloupec představuje průměr ± SEM z 3-6 zvířat. 43

44 44

45 6. Diskuse V této práci jsme se zabývali vlivem akutní aktivace opiodního systému jednorázovým podáním morfinu v dávce 1 mg/kg na hladinu fosforylovaných kináz ERK1/2 a GSK3β v dorsomediálním SCN, jako místě generování endogenních oscilací, a ventrolaterálním SCN jako struktuře, která integruje světelné a nesvětelné stimuly, které ovlivňují cirkadiánní systém. Obě kinázy mají důležitou úlohu v udržování endogenních cirkadiánních oscilací a v jejich synchronizaci s vnějšími podmínkami a jsou zároveň molekulami, které se účastní opioidní signalizace v jiných částech mozku. Transkripční faktory STAT3 a STAT5 jsou studované v souvislosti s opioidní signalizací v periferních orgánech nebo v systémech in vitro. Jsou substrátem jak ERK1/2, tak GSK3β kináz (Pircher et al., 1999; Beurel and Jope, 2008). Jejich přítomnost v SCN je novým nálezem této studie Vliv akutní aplikace morfinu na expresi fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK3β, a transkripčních faktorů STAT v SCN potkana Fosforylovaná forma ERK1/2 vykazovala v našich experimentech denní rytmus s vysokou hladinou v noci ve vlscn, a ve dne v dmscn, a rytmus v hladině pgsk3β s vysokými hodnotami v noci v celém SCN. Tyto výsledky se shodují s publikovanými nálezy a potvrzují, že naše experimenty byly metodicky provedeny správně (Obrietan et al., 1998; Nakaya et al., 2003; Iitaka et al., 2005). Akutní aplikace morfinu zvýšila expresi perk1/2 po 30 minutách a způsobila mírný, přesto statisticky významný pokles pgsk3β v ZT9 tj. dvě hodiny po podání. Obě změny se významně projevily pouze v dmscn a nikoliv ve vlscn. Dorsomediální SCN je část pacemakeru generující a udržující endogenní oscilace nezávisle na okolním prostředí. Přijímá proto velmi málo aferentací z okolních struktur. Hlavní spojení má s retinorecipientní vlscn a prokázané byly také aferentace z paraventrikulárního jádra thalamu a zejména pak z limbického systému (Alamilla and Aguilar-Roblero, 2010; Moga and Moore, 1996; Silver and Schwartz, 2005; Albrecht, 2013). Právě struktury limbického systému reagují nejsilněji na podání opioidů a jsou hojně studovány z hlediska buněčné opioidní 45

46 signalizace. Výsledky těchto studií ukazují, že akutní podání morfinu snižuje hladinu perk1/2 v nucleus accumbens a amygdale u myší, ale zvyšuje jí naopak v caudate putamen. Jiná studie ukazují, že 30 minut po aplikaci morfinu dochází k aktivaci ERK1/2 v anteriorní cingulátní kůře, somatosenzorické kůře a asociační kůře, a také v locus ceruleus (Muller and Unterwald, 2004; Eitan et al., 2003). Několik in vitro studií prokázalo, že aktivace OR vyvolává u transfekovaných buněčných linií rychlé a přechodné zvýšení aktivity ERK (Li and Chang, 1996; Fukuda et al., 1996). Rytmická exprese perk1/2 a pgsk3β v SCN je důležitá pro udržení cirkadiánní periody a fáze (Guillaumond et al., 2007; Kurabayashi et al., 2006). Okamžitá změna jejich hladiny může vést ke změně časovaného vstupu proteinů hodinových genů do jádra, nebo jejich řízené degradaci, a tím může dojít ke změně dynamiky celé molekulární smyčky hodinového mechanismu. Endogenní hladina perk1/2 v dmscn je v ZT7 poměrně vysoká, přesto její indukce morfinem byla statisticky velmi významná. Podobně endogenní hladina pgsk3β v ZT9 je v dmscn nízká, přesto byla morfinem ještě snížena. V dalších experimentech bude nutno zjistit, jak se změní obě hladiny po podání morfinu v nočních hodinách, kdy je endogenní hladina perk1/2 v dmscn nízká a hladina pgsk3β naopak vysoká. Společně mohou oba výsledky naznačit funkční propojení mezi dmscn a limbickým systémem, kterým mohou opioidy ovlivňovat fázi pacemakeru nezávisle na vlscn. Transkripční faktory STAT jsou důležitými faktory v celé řadě fyziologických procesů, avšak jejich přítomnost v SCN dosud nebyla experimentálně ukázána. Naše výsledky poprvé demonstrují přítomnost STAT3 a STAT5a v SCN a naznačují rytmus STAT3 a jeho fosforylované formy v SCN s maximální hodnotou v ZT22. Akutní aplikace morfinu zvýšila hladinu STAT3 po dvou hodinách od aplikace a maximální hodnoty dosáhla v ZT18, tj. o 4 hodiny dříve než u kontrolních zvířat. V posledním bodě bylo naopak po morfinu naznačeno snížení hladiny STAT3 oproti kontrolním zvířatům. Přestože stanovení hladin proteinů STAT bylo pouze orientační a z dosažených výsledků nelze udělat statisticky podložený závěr, výsledky naznačují, že by akutně podaný morfin v polovině subjektivního dne mohl posunout fázi rytmu proteinu STAT3 ve smyslu fázového předběhnutí tak, že nočních maximálních hladin je dosaženo dříve než u kontrolních zvířat, a následně také dochází k časnějšímu poklesu hladiny ve dne. 46