ZPRÁVA O VÝVOJI NOVÝCH TECHNOLOGIÍ CHOVU RYB

ZPRÁVA O VÝVOJI NOVÝCH TECHNOLOGIÍ CHOVU RYB Název projektu: Vývoj technologie likvidace odpadních kalů z RAS pro chov ryb pomocí vermikompostování Registrační číslo projektu: CZ.1.25/3.1.00/11.00257 1

Příjemce dotace: Název nebo obchodní jméno: Josef Bláhovec Adresa: Žár 25, 384 86 Vacov IČ: 67172695 Registrační číslo projektu: CZ.1.25/3.1.00/11.00257 Název projektu: Vývoj technologie likvidace odpadních kalů z RAS pro chov ryb pomocí vermikompostování Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna příjemce dotace zastupovat: Josef Bláhovec Vědecký ústav: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany IČ: 60076658 Místo a datum zpracování zprávy: Vodňany, 30. 11. 2012 Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna vědecký ústav zastupovat: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. Zpracovatel zprávy: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany IČ: 60076658 Místo a datum zpracování zprávy: Vodňany, 30. 11. 2012 Jména a příjmení osob, které zpracovaly zprávu: Ing. Antonín Kouba, Ph.D. Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna zpracovatele zprávy zastupovat: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. 2

Souhlas s publikací zprávy: Souhlasím se zveřejněním této zprávy projektu v rámci opatření 3.1. Společné činnosti, záměr b) podpora spolupráce mezi vědeckými ústavy, odborným školstvím a hospodářskými subjekty v odvětví rybářství z Operačního programu Rybářství 2007 2013 na internetových stránkách Ministerstva zemědělství a s využíváním výsledků této zprávy všemi subjekty z odvětví rybářství. Podpis osoby oprávněné zastupovat: 1. Příjemce dotace: Josef Bláhovec 2. Partnera projektu (vědecký ústav): prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. 3. Zpracovatele zprávy: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. 3

Obsah: 1. CÍL...5 1.1. Co je cílem projektu...5 1.2. V čem tkví inovativnost vyvíjené technologie/výrobku...5 1.3. Proč je nutná vyvíjená inovace...6 2. ÚVOD...7 3. MATERIÁL A METODIKA...8 4. VÝSLEDKY...22 5. ZÁVĚR...44 4

1. Cíl 1.1. Co je cílem projektu Cílem tohoto projektu bylo uceleně vyhodnotit možnosti likvidace odpadních kalů z intenzivního recirkulačního akvakulturního sytému (RAS) pro chov ryb pomocí vermikompostování, tj. způsobu kompostování za využití žížal s výslednou produkcí kvalitního vermikompostu a biomasy žížal. 1.2. V čem tkví inovativnost vyvíjené technologie/výrobku Dostupné informace týkající se možností likvidace odpadních kalů z intenzivního recirkulačního sytému pro chov ryb pomocí vermikompostování byly pouze předběžné a proto vyžadovaly další verifikaci založenou nejlépe na spolupráci vědecké a aplikační sféry. Za daných okolností je možné předložené výsledky považovat za vysoce inovativní. Jednalo se primárně o faktické prokázání možného vermikompostování kalů z RAS za specifických podmínek daných technologickým zázemím příjemce a to jak z pohledu původu (vůbec poprvé byly otestovány různé typy kalů z RAS), tak i zastoupení kalů ve vermikompostovaných substrátech. Byly sledovány reprodukční dynamiky nasazených žížal, jejichž biomasa byla finálně zhodnocena i z pohledu obsahu těžkých kovů, který do značné míry ovlivňuje jejich další využití. Získané vermikomposty byly analyzovány taktéž z hlediska obsahu živin, jakožto klíčové charakteristiky kompostů úzce související s jejich následným použitím. Testovány však byly i další specifické problematiky nezbytné pro ucelené zhodnocení praktické využitelnosti této technologie. Mezi ně mimo jiné patřily vyhodnocení toxicity kalů jakožto limitace jejich přídavku do vermikompostovaných substrátů, preferenční krmný test mezi substráty s identickým zastoupením jednotlivých kalů a další, již poloprovozní testy, související s možnostmi zavedení této technologie na straně žadatele. 5

1.3. Proč je nutná vyvíjená inovace Akvakultura je v celosvětovém měřítku dlouhodobě nejrychleji rostoucím sektorem živočišné výroby s průměrným růstem okolo 7 % po dobu posledních 40 let (FAO, 2012). V návaznosti na tento růst však začíná být poukazováno na negativní dopady tohoto sektoru na životní prostředí (např. nízká kvalita vypouštěné vody). S cílem omezit tyto dopady začaly být zaváděny některé šetrnější technologie, z nichž jedny z nejrozšířenější jsou různé typy RAS. Výhodou RAS je mimo jiné získávání vysoce koncentrovaných odpadních kalů (viz Úvod). Tyto mohou být likvidovány několika metodami, řada z nich však má určitá omezení. Vzhledem k těmto skutečnostem začalo být uvažováno také o ekologické likvidaci těchto kalů pomocí vermikompostování. Komplexnímu zhodnocení této problematicky však musel předcházet projekt, jehož výsledky jsou stručně shrnuty v této zprávě. 6

2. Úvod V roce 1988 se podílela akvakultura, s rybami jakožto nejčastěji chovanou skupinou vodních organismů, na celosvětové produkci 14,8 %. V roce 2008 se její zastoupení již blížilo k hranici 43 % s perspektivou dalšího růstu. Současně s intenzifikací a rozvojem akvakultury však začalo být poukazováno na negativní vlivy některých chovatelských technologií vůči životnímu prostředí. Zpravidla se jednalo o různé průtočné systémy a rozsáhlé klecové chovy, s minimálně účinným či žádným systémem pro čištění využité vody (Colt, 1991; Maillard a kol., 2005). Zvyšující se nároky na kvalitu vypouštěné vody ze strany veřejných autorit v kombinaci s nedostatkem vhodných míst majících přiměřený a dostatečně kvalitní zdroj vody pro konvenční způsoby chovu ryb vedla k rozvoji výstavby recirkulačních akvakulturních systémů (RAS) v Evropě a Severní Americe (van Rijn, 1996). Tyto systémy navzdory vyšším investičním nákladům při výstavbě a zvýšeným nárokům na elektrickou energii při svém provozu poskytují řadu podstatných výhod (Wik a kol., 2009) a do budoucna je předpokládán jejich další rozvoj (Martins a kol., 2010). Chov v RAS je v současnosti dobře propracován u více než 10-ti druhů ryb, v popředí se pstruhem duhovým, jakožto významným zástupcem lososovitých (Bureau a Hua, 2010), často chovaným v RAS tzv. dánského typu (Jokumsen a Svendsen, 2010). RAS jsou ale s úspěchem aplikovány i v mořské akvakultuře. Při chovu ryb dochází k produkci nerozpuštěných látek (kalů). V tomto smyslu mají RAS nespornou výhodu v porovnání s průtočnými technologiemi. Množství vody odtékající z RAS je totiž mnohonásobně nižší a koncentrace kalů je naopak podstatně vyšší. Ošetření takovéto vody před vypuštěním do recipientu je tedy v porovnání s běžnými průtočnými technologiemi mnohem účinnější a levnější (Blancheton a kol., 2007). I přes vysokou stravitelnost předkládaných komerčních směsí končí 15 % krmiva ve formě výkalů (Reid a kol., 2009) a v průměru 3 5 % krmiva není rybami vůbec přijato (Cromey a kol., 2002; Bureau a kol., 2003). V případě RAS se navíc z biologických filtrů uvolňuje narostlá biomasa mikroorganismů. Všechny tyto složky jsou mimořádně bohaté na obsah živin a organické hmoty (Chen a kol., 1997), a tudíž lze uvažovat o jejich dalším využití. Tento kal je zpravidla aplikován jako hnojivo na zemědělské plochy. Musí však být před svým použitím stabilizován a určitou dobu skladován (Bergheim a kol., 1998). Stejně tak může být přímo využit na výrobu bioplynu (del Campo a kol., 2010) nebo kompostu (Cripps a Bergheim, 2000). Na základě jedné pilotní studie je patrné, že také tyto kaly mohou být 7

úspěšně vermikompostovány (Marsh a kol., 2005). Vedle ekologicky šetrného způsobu zpracování odpadních kalů je pak výsledkem i vysoce ceněný vermikompost a biomasa žížal, tedy produkty mající široké pole uplatnění. 3. Materiál a metodika V rámci projektu bylo realizováno celkem pět experimentů, které poskytly odpovědi na rozdílné, ve skutečnosti však úzce související a navzájem se doplňující otázky. Tři pokusy byly provedeny v zázemí vědeckého subjektu a měly spíše laboratorní charakter. Dva pak v provozních podmínkách příjemce dotace. Podrobná metodika jednotlivých prací je detailněji uvedena níže. Pro všechny pokusy byla využita násada žížal zakoupená od Jiřího Tomečka, http://www.hnojnizizaly.cz, který se jejich chovem dlouhodobě zabývá. V celosvětovém měřítku jsou pro účely vermikompostování zřejmě nejvyužívanější dva epigeické1 druhy žížal, kterými jsou Eisenia fetida a E. andrei. Morfologicky jsou však tyto žížaly od sebe velmi špatně, zdali vůbec odlišitelné (V. Pižl, os. sděl., 2012) a řadu let se dokonce hovořilo pouze o dvou morfotypech, popř. podruzích. V posledních letech je ale spíše přijímán druhový koncept (Domínguez a kol., 2005). Řada biochemických, spektroskopických (využití fluorescence), genetických (gelová elektroforéza allozymů) a reprodukčních studií se pokoušela nalézt klíč k jejich jednoznačné druhové determinaci. Tyto však měly jisté limity a ke slovu nakonec přišly pokročilejší molekulární studie zaměřené na analýzu mitochondriální, potažmo jaderné DNA (Pérez-Losada a kol., 2005). Jedna z těchto metod byla recentně vyvinuta v Mikrobiologickém ústavu AV ČR, v. v. i. v Praze Krči. Tento exaktní způsob druhové determinace byl poprvé zmíněn ve studii Škanta a kol. (2010) a je založen na nalezení rozdílů v primární sekvenci genu cytochrom c oxidázy zmíněných druhů. Na základě těchto odlišností byly navrženy sady primerů specifických výlučně buď pro E. fetida nebo E. andrei. Pro druhovou determinaci byly v rámci naší studie použity vzorky částí těla ze dvou náhodně vybraných jedinců. Z těchto dvou vzorků byla paralelně vyizolována RNA. Po izolaci byly vzorky sloučeny a na NanoDropu 2000c (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) byla stanovena koncentrace směsného vzorku a ověřena čistota RNA. 500 ng celkové RNA bylo použito na přepis do cdna. Výsledná cdna byla templátem PCR s primery 1 Druhy žížal žijící pouze ve svrchních vrstvách půdy. Tato skupina je velikostně poměrně malá, jejich tělo je zpravidla červenohnědě zbarvené. 8

specifickými pro gen cytochrom c oxidázu. Bylo provedeno 6 PCR reakcí s různými kombinacemi druhově specifických primerů. PCR produkty byly separovány pomocí agarózové elektroforézy, DNA byla vizualizována pomocí barviva SYBR GREEN. Vzniklé PCR produkty byly druhově specifické pro E. andrei (J. Dvořák, os. sděl., 2012), tedy druh, který je díky svému rychlejšímu růstu a reprodukci pro účely vermikompostování spíše doporučován (Reinecke a Viljoen, 1991; Elvira a kol., 1996; Domínguez a kol., 2005). Experiment 1 První experiment byl pro celý projekt zcela stěžejní. Z toho důvodu byl velmi komplexně pojatý a řešil několik zásadních otázek týkajících se možností vermikompostování kalů z RAS. Testovány byly jak různé kaly, tak i jejich zastoupení. Sledována byla reprodukční a růstová dynamika nasazených žížal. Finální vermikomposty byly živinově charakterizovány a stejně jako u odchovaných žížal u nich byla na konci pokusu vyhodnocena přítomnost těžkých kovů. Na základě těchto informací byla rovněž zhodnocena další využitelnost finálních vermikompostů i biomasy žížal. Tento pokus byl z důvodu silných mrazů na konci ledna a počátku února 2012 zahájen až 8. března. Nezbytné kaly z recirkulačního systému totiž byly z důvodu jeho zámrazu pro experimentální účely nedostupné. Z chovatelské technologie byly získány tři typy čerstvých kalů. Jednalo se o kal z odchovné části (dále značený jako O ), z biofiltru ( B ) a sedimentačního rybníka ( R ), který slouží k dočišťování odtékající vody. Kal z odchovu byl získáván pomocí sítěného nářadí v místech jeho sedimentace v této části odchovném systému. Přebytečná voda byla odstraněna filtrací jemným sítem uhelonem2 o velikosti ok 109 µm. Kal z biofiltru byl získáván pomocí výkonných čerpadel při čištění jeho jednotlivých sekcí. Čerpaný kal s vodou byl filtrován pomocí nádrží se síty různé hustoty. Hrubá síta (uhelon s velikostí ok 1 a 2 mm) byla použita pro separaci hrubých částí. Těmi byly především elementy samotného biofiltru (RK BioElements, RK Plast A/S, Skive, Dánsko). Tyto mají pro představu výšku 1,5 cm a průměr 1,45 cm). Stejně tak byly odstraněny i veškeré další větší nečistoty, jako např. listí. Nejjemnějším sítem (uhelon, 109 µm) již byl získáván používaný kal. V případě sedimentační nádrže byly kaly získávány jejich odškrábnutím z vrchní vrstvy 2 Uhelon je obvykle velmi jemné síto tkané z polyamidových vláken. 9

sedimentu pomocí nerezového síta na dlouhé násadě. Přebytečná voda byla odstraněna filtrací přes uhelon s oky 109 µm. Tyto kaly byly smíchány s nadrcenou pšeničnou slámou. K nadrcení slámy bylo přistoupeno z důvodu předpokládaného urychlení procesu vermikompostování a ulehčení manipulace se substráty během pokusu. Pšeničná sláma samotná pak byla vybrána s ohledem na její širokou dostupnost pšenice je totiž nejčastěji pěstovanou obilovinou v ČR s přibližně 50% zastoupením (MZe, 2011) a zásadní skutečností je rovněž fakt, že akvakulturní kaly jsou typické svou vysokou vodnatostí. Nadrcená sláma tuto vodu absorbuje a zároveň zajistí vnos nezbytného organického uhlíku. Kaly z RAS totiž obsahují vysoké zastoupení dusíkatých látek, které je již pod optimálním poměrem uhlíku a dusíku pro vermikompostování. Související skutečností je rovněž snížení toxicity v kalech obsaženého amoniaku. Po smíchání příslušných množství pak vznikly substráty s 5, 10, 20 a 30% zastoupením příslušných kalů v sušině (dále značené jako 5, 10, 20 a 30 ). Čistě slámová varianta byla považována za kontrolní skupinu (K). 200 g sušiny od každé, třikrát opakované varianty byly vloženy do speciálně navržených inkubátorů (obr. 1). Při iniciální vlhkosti 75 % se jednalo o 800 g čerstvého substrátu. Požadovaná vlhkost byla dosažena přídavkem destilované vody. Tělo inkubátoru tvořilo polypropylenové (PP) odpadní HT potrubí s průměrem 12,5 cm a celkovou výškou 22,5 cm. Ve spodní části byl rozpůlenou přesuvkou příslušného průměru fixován uhelonem s velikostí ok 109 µm. Toto síto zajišťovalo jak odtok přebytečné vody, tak částečnou výměnu vzduchu, která byla umožněna i přes zátku umístěnou shora. V jejím středu byl totiž vyvrtán otvor o průměru 2,2 cm, který byl rovněž překryt uhelonem. Naplněné inkubátory byly následně postaveny na PP misky o průměru 17 cm, které zachycovaly případnou nadbytečnou vodu. Ta byla déle během pokusu využívána k nezbytnému dovlhčování substrátů. V případě jejího nedostatku byly příslušné substráty dovlhčovány destilovanou vodou. K tomuto však docházelo pouze výjimečně, neboť naprostá většina vody v inkubátorech opět kondenzovala. Celkem čtyři inkubátory byly osazeny teplotními registračními čidly Minikin (Environmental Measuring Systems, Brno) s hodinovým záznamem. Jednalo se o varianty O10, B20, R30 a kontrolu. V průběhu pokusu byla zaznamenávána i teplota vzduchu. Namíchané substráty byly kvůli obavám o přežití násady žížal ve variantách s vyšším obsahem kalů, a s tím souvisejícím vysokým koncentracím amoniaku, ponechány po dobu jednoho týdne v místnosti s průměrnou teplotou (± SD) 14,4±0,3 ºC. Teplota samotných substrátů byla mírně vyšší (15,5±0,5 ºC). Tato hodnota odpovídá průměrné teplotě získané ze čtyř lišících se variant substrátů zmíněných výše, neboť mezi nimi nebyly pozorovány žádné 10

teplotní rozdíly. Po tomto týdenním předkompostování byly inkubátory jednotně osazeny velikostně vyrovnanými dospělci E. andrei v počtu 10 ks na inkubátor. Dospělé jedince bylo možné snadno určit na základě přítomnosti klitela opasku (obr. 2). Obr. 1. Rozložený (vlevo) a složený (vpravo) trubkový inkubátor využívaný v experimentu 1. Obr. 2. Násadový materiál Eisenia andrei patrná je přítomnost opasku (klitela) charakteristického pro dospělé jedince. 11

Vážení žížal probíhalo individuálně po odstranění všech zbytků substrátu na vlhkém papíru s využitím jemné entomologické pinzety a analytických vah (Kern & Sohn GmbH, Balingen, Německo). Počáteční váha nasazených žížal byla mezi jednotlivými inkubátory totožná (F38,351 = 0,030, p = 1,0) a v průměru činila 399,3±88,7 mg. Zátky inkubátorů byly při této příležitosti zalepeny izolepou s cílem zamezit nechtěnému úniku žížal. Toto opatření se do budoucna opakovalo po každém otevření inkubátorů. Inkubátory byly umístěny po dobu dalšího týdne v místnosti s teplotou 18,7±0,5 ºC, teplota vlastních substrátů byla vzhledem k již probíhajícím rozkladným procesům mírně vyšší (19,5±0,6 ºC). Hlavním důvodem pro nasazení do těchto, z pohledu vermikompostování ještě poměrně nízkých teplot byla skutečnost, že násadový materiál pocházel ze zazimovaného vermikompostu o teplotě pouze několika ºC. Po týdnu bylo zjištěno přežití nasazených dospělců (14 den experimentu, 7 den od nasazení žížal). To bylo představováno přebráním substrátů ze všech inkubátorů. Při této příležitosti byly opětovně zalepené inkubátory přeneseny do poslední, nejteplejší místnosti. Zde probíhala nejdelší část vermikompostovacího procesu. Teplota zdejšího vzduchu byla 26,4±1,6 ºC, přičemž teplota samotných substrátů byla opět mírně vyšší (27,0±1,5 ºC). Průběh NASAZENÍ ŽÍŽAL výše popsaných teplotních změn ilustruje obr. 3. PŘEDKOMPOSTOVÁNÍ Obr. 3. Průběh teplot v experimentu 1. Patrné je týdenní předkompostování, po kterém následovalo nasazení žížalí násady, stejně jako dvojí zvýšení teploty během vlastního procesu vermikompostování. 12

21. den experimentu (14. den od nasazení žížal) bylo realizováno přepočítání násady dospělých žížal v substrátech. Při něm bylo zjištěno jejich přežití a dále byla stanovena jejich individuální hmotnost způsobem popsaným výše. Následná přepočítání byla realizována každé dva týdny (tj. ve dnech 35, 49, 63, 77, 91, 105, 119 a 133, kdy byl experiment ukončen) a postupem času při něm začaly být sledovány i počty nakladených kokonů a juvenilních jedinců. Kokony jsou charakteristické svou žlutou až světlehnědou barvou a mají tvaru citronu. Provedené rozbory Vstupní kaly i pšeničná sláma byly podrobeny fyzikálně-chemickým rozborům. Jednalo se o stanovení sušiny, aktivního a výměnného ph (poměry vyluhovacího roztoku a půdy 5:1), obsahu organických látek (vypočtený jako sušina po odečtení popelovin), hořčíku, fosforu, draslíku, sodíku, vápníku a celkového dusíku (dle Kjeldahla) v akreditované laboratoři AGRO-LA, spol. s r.o. v Jindřichově Hradci s využitím standardizovaných metod. Obsah organického uhlíku byl proveden na Biologickém centrum AV ČR, v. v. i., konkrétně na Ústavu půdní biologie v Českých Budějovicích. Nad rámec finančního krytí tímto projektem byly také provedeny rozbory na stanovení obsahu těžkých kovů. Konkrétně se jednalo rtuť, nikl, olovo, kadmium, měď, chrom a zinek. Tyto analýzy byly provedeny v akreditované laboratoři Státního veterinárního ústavu v Praze a v této zprávě jsou uvedeny pro poskytnutí uceleného obrazu o popisované technologii. Vstupní kaly byly rovněž zhodnoceny s ohledem na jejich velikostní strukturu částic. Ta byla stanovena po promytí na sítech Retsch o velikosti pod 25, 25 53, 53 106, 106 250, 250 500, 500 710 a nad 710 µm. Hodnocený vzorek o objemu 500 ml byl rozmíchán v 5 litrech vody a propláchnut na soupravě výše uvedených sít. Proplachování na jemnějších sítech (pod 500 µm) bylo spojeno s mícháním pro lepší separaci částic. Zachycený podíl jednotlivých velikostních frakcí byl sedimentován po dobu 1 hodiny a stanoven volumetricky jako průměr ze tří měření. Výsledky těchto analýz jsou sumarizované v tabulce 1. Po ukončení experimentu (133. den) byly ze získaných vermikompostů vytříděny všechny žížaly. Finální vermikomposty byly podrobeny identickým, výše specifikovaným, fyzikálně-chemickým rozborům. Získané žížaly byly ponechány po dobu 24 hodin v boxech o velikosti 16 x 11,5 x 6 cm s vloženým filtračním papírem navlhčeným destilovanou vodou při teplotě 21,6±0,5 ºC. Zde došlo k vyloučení zkonzumovaných substrátů a čistá biomasa žížal byla rovněž podrobena analýzám na obsah těžkých kovů. 13

Tab. 1. Fyzikálně-chemická charakteristika použitých kalů a drcené pšeničné slámy v experimentu 1. Obsahy živin jsou uváděné v sušině. Parametr/typ kalu (sláma) Odchov Biofiltr Rybník Sláma Sušina (%) ph (H2O) ph (CaCl2) Organické látky (g.kg-1) 9,87 5,24 5,41 547,0 15,20 5,46 5,70 358,0 30,90 6,09 6,31 179,0 86,60 6,10 6,35 932,0 Organický uhlík (g.kg-1) 482,8 314,1 160,0 719,9 Použitá metoda/ místo rozboru SOP 39-2/A SOP 44/A SOP 44/A SOP 50/A Zbíral a kol. (1997)/B SOP 55/A 28,6 22,5 11,7 9,9 Celkový dusík (g.kg-1) 16,9 14,0 13,7 72,7 C/N poměr 9,6 10,1 12,9 0,97 SOP 41/A Hořčík (g.kg-1) -1 14,1 11,2 11,1 1,4 SOP 43/A Fosfor (g.kg ) -1 31,4 4,2 4,9 12,3 SOP 41/A Draslík (g.kg ) -1 1,4 0,1 0,9 0,07 SOP 41/A Sodík (g.kg ) -1 82,0 103,0 114,0 3,8 SOP 41/A Vápník (g.kg ) -1 0,049 0,044 0,041 0,009 SOP 4/C Rtuť (mg.kg ) 13,25 47,85 48,17 0,64 SOP 75/C Nikl (mg.kg-1) 5,95 6,66 8,82 0,24 SOP 75/C Olovo (mg.kg-1) -1 0,626 0,460 0,417 0,082 SOP 75/C Kadmium (mg.kg ) -1 14,29 22,32 12,80 3,27 SOP 75/C Měď (mg.kg ) -1 16,98 99,52 98,67 0,82 SOP 72/C Chrom (mg.kg ) -1 1386,6 974,6 647,3 15,9 SOP 75/C Zinek (mg.kg ) Velikostní struktura částic (%) 51,5 18,6 nad 710 µm 64,3 14,3 11,5 500-710 µm 16,0 15,9 42,4 250-500 µm 13,0 12,5 19,5 106-250 µm 3,2 4,1 5,9 53-106 µm 2,4 1,1 1,3 25-53 µm 0,5 0,6 0,8 pod 25 µm 0,6 SOP - standardní operační postup, A AGRO-LA, spol. s r.o., Jindřichův Hradec, B Biologickém centrum AV ČR, v. v. i., Ústav půdní biologie v Českých Budějovicích, C Státní veterinární ústavu v Praze. Experiment 2 Druhý experiment byl zaměřený na nalezení úrovně přídavku čerstvých kalů z RAS ve vermikompostovaných substrátech, které jsou žížaly při nasazení schopné tolerovat. Principiálně se jednalo o provedení toxikologických testů, které byly svými podmínkami modifikovány pro potřeby studia této problematiky. 14

Pro tento pokus byly dne 3. 9. 2012 připraveny substráty tvořené smícháním čerstvých RAS kalů z odchovu, biofiltru a sedimentačního rybníka charakterizovaných v tab. 2 s drcenou pšeničnou slámou identickou s experimentem 1 (charakterizovaná v tab. 1). Zastoupení jednotlivých kalů bylo 20, 30, 40, 50, 60 a 70 % sušiny v případě kalu z odchovu, 10, 20, 30, 45 sušiny u kalu z biofiltru a 20, 30, 40, 50, 60 a 70 % sušiny v případě kalu ze sedimentačního rybníka. U kalu z biofiltru nebylo možné kvůli nízkému obsahu sušiny vytvořit variantu na kal bohatší. Čistě slámová varianta byla považována za kontrolní skupinu. Každá varianta byla smíchána tak, aby bylo finálně dosaženo množství 60 g sušiny. Při iniciální vlhkosti 75 % se jednalo o 240 g čerstvého substrátu. Požadovaná vlhkost byla dosažena přídavkem destilované vody. Každá připravená varianta substrátu byla rovnoměrně rozdělena do tří potravinářských PP vaniček o objemu 250 ml (obr. 4) a přisazeno bylo po deseti dospělcích E. andrei o průměrné kusové hmotnosti 379,3±60,0 mg (zástupný vzorek n = 30). Vaničky byly uzavřeny víčky, která byla pro zajištění alespoň částečné výměny vzduchu opatřena rovnoměrně rozloženými 22 otvory vytvořenými ocelovým hrotem o průměru 1,1 mm a umístěny do místnosti s teplotou vzduchu 23,4±0,3 ºC, přičemž teplota samotných substrátů byla 23,2±0,4 ºC. Přežití nasazených dospělých žížal bylo vyhodnoceno po 48, 96 a 168 hodinách, tj. 2., 4. a 7. den. Tab. 2. Fyzikálně-chemická charakteristika RAS kalů použitých v experimentech 2 a 3. Obsahy živin jsou uváděné v sušině. Použitá metoda/ Parametr/typ kalu (sláma) Odchov Biofiltr Rybník místo rozboru 31,9 14,0 31,5 SOP 39-2/A Sušina (%) ph (H2O) 6,30 5,90 6,94 SOP 44/A ph (CaCl2) 6,12 5,62 6,57 SOP 44/A 134,0 259,0 102,0 SOP 50/A Organické látky (g.kg-1) -1 162,0 242,2 92,9 Zbíral a kol. (1997)/B Organický uhlík (g.kg ) 7,0 21,6 7,4 SOP 55/A Celkový dusík (g.kg-1) 23,1 11,2 12,5 C/N poměr -1 8,9 11,1 6,4 SOP 41/A Hořčík (g.kg ) 8,8 12,4 7,0 SOP 43/A Fosfor (g.kg-1) -1 5,5 5,4 8,9 SOP 41/A Draslík (g.kg ) 0,85 1,3 1,0 SOP 41/A Sodík (g.kg-1) -1 35,9 58,4 21,5 SOP 41/A Vápník (g.kg ) 0,07 0,19 0,14 SOP 4/C Rtuť (mg.kg-1) -1 16,37 38,05 42,65 SOP 75/C Olovo (mg.kg ) -1 1,09 2,50 1,33 SOP 75/C Kadmium (mg.kg ) 61,80 142,58 135,90 SOP 72/C Chrom (mg.kg-1) SOP - standardní operační postup, A AGRO-LA, spol. s r.o., Jindřichův Hradec, B Biologickém centrum AV ČR, v. v. i., Ústav půdní biologie v Českých Budějovicích, C Státní veterinární ústavu v Praze. 15

Obr. 4. Nahoře 250ml PP potravinářské krabičky použité v experimentu 2, zde konkrétně tři opakování varianty s 50 % sušiny kalu z biofiltru. Dole série substrátů na počátku pokusu. Experiment 3 V rámci třetího experimentu jsme chtěli otestovat, zda jsou substráty s kaly žížalami preferovány v porovnání s čistě slámovou variantou, resp. zda je některý z kalů při jejich identickém zastoupení žížalami více osidlován. Paralelně s druhým experimentem byl nasazen i třetí pokus, který můžeme krátce nazvat jako preferenční krmný test. Pro tento účel bylo potřeba nejprve sestavit tři složené inkubátory (= 3 opakování). Každý takový složený inkubátor byl tvořený třemi menšími inkubátory totožnými s experimentem 1, které byly zasazeny do dvojité odbočky příslušného průměru (obr. 5). Jednotlivé inkubátory byly ve své spodní částí odděleny od prostoru centrálního dílu pro žížaly velikostně prostupnou síťovinou (velikost strany čtvercového oka 5 16

mm). Samotný centrální díl byl ve spodní části překryt uhelonem s velikostí ok 109 µm, který byl fixován rozpůlenou přesuvkou. Každý jednotlivý inkubátor byl naplněn 360 g sušiny substrátů s 20% zastoupením kalů z odchovu, biofiltru a sedimentačního rybníka (charakterizovány v tab. 2). Centrální část byla naplněna z důvodu většího objemu 800 g sušiny kontrolního substrátu z drcené pšeničné slámy. Iniciální vlhkost všech substrátů byla 75 %. Vzájemná pozice kalových variant se mezi opakováními vždy lišila. Do kontrolních slámových substrátů bylo přidáno po 50 ks dospělců E. andrei o iniciální hmotnosti totožné s experimentem 2. Zátky inkubátorů byly při této příležitosti rovněž zalepeny izolepou s cílem zamezit nechtěnému úniku žížal (viz experiment 1). Inkubátory byly následně umístěny v horizontální poloze do místnosti s teplotou vzduchu 17,7±1,8 ºC, přičemž teplota samotných substrátů byla mírně vyšší (22,2 ºC). Po 1, 2 a 3 týdnech byly substráty prohledány, přičemž byla zaznamenána přítomnost žížal v jednotlivých substrátech, a tudíž bylo zjištěno i celkové přežití. Žížaly byly následně zpět vysazeny do příslušné varianty substrátu. Pro možnost přímého porovnání byly pozorované počty žížal v jednotlivých kalech vynásobeny koeficientem 2,22 (= 800/360), čímž byla zohledněna skutečnost lišícího se objemu mezi kontrolou a variantami s kalem. Následné hodnoty byly převedeny na procenta vyjadřující zastoupení žížal v jednotlivých substrátech při aktuálním přežití. 17

Obr. 5. Složený inkubátor (opakování C) využitý při experimentu 3. Dílčí inkubátory naplněny příslušnými substráty s kaly z odchovu (O), biofiltru (B) a rybníka (R). Vlastní tělo dvojité odbočky naplněno kontrolním substrátem z drcené pšeničné slámy. Patrná je pro žížaly prostupná síťovina mezi sekcemi. Experiment 4 Čtvrtý experiment byl svým pojetím již poloprovozní test realizovaný v provozních podmínkách příjemce dotace. Jeho hlavním cílem bylo ověření procesu vermikompostování RAS kalů při využití dvou základních technologických postupů, kdy jsou 1) žížalám předkládány nové, již namíchané vrstvy krmného substrátu, nebo 2) kdy jsou žížaly nasazeny do slámového lože, na jehož povrch jsou do značné míry vodnaté RAS kaly aplikovány. Pro tento experiment bylo využito šesti kruhových nádrží o průměru 74 a výšce 55 cm (obr. 6). Tyto měly ve svém středu vystavenou trubku v dolní části opatřenou nerezovým sítem s velikostí ok 150 µm pro zajištění odtoku (odkapu) přebytečné vody a zároveň zabránění úniku nasazených žížal (dospělců). Užitná plocha po odečtení středové trubky a mezikruží šesti vzorkovacích trubek (viz níže) byla ca 4186 cm2. Dne 16. 5. 2012 byly tyto kruhové nádrže naplněny buďto namíchanými krmnými vrstvami (KV) z nadrcené pšeničné slámy (totožné s experimenty 1, 2 a 3) o iniciálním zastoupením 20 % směsných kalů z RAS 18

v sušině (kalkulovaná iniciální vlhkosti vytvořených substrátů 75 %), nebo v nich bylo vytvořeno slámové lože (SL) z celé slámy (pro tento účel byla zvolena v provozních podmínkách příjemce dotace nejsnáze dostupná ovesná sláma). Kaly pak byly v pravidelných intervalech aplikovány na povrch tohoto lože. Při prvním naplnění substrátů bylo v případě varianty KV aplikováno 6 kg sušiny, u varianty SL bylo do kruhových nádrží umístěno po 7,5 kg sušiny slámy. Po čtrnáctidenním předkompostování došlo k nasazení dospělců žížal E. andrei v množství 200 ks na nádrž (iniciální hmotnost zástupného vzorku 386,1±61,6 mg, n = 37). Ve variantě KV docházelo k pravidelnému přidávání nových substrátů (2 kg sušiny) o identické kompozici v době 4, 8 a 12 týdnů po nasazení, u varianty SL bylo přidáváno týdně 200 g sušiny směsných kalů z RAS na povrch slámového lože. I v tomto případě bylo přidávání nové hmoty ukončeno 12. týden, přičemž celý experiment byl ukončen po 16 týdnech. V případě prosychání substrátů byla pro vlhčení využívaná do věder odkapaná přebytečná voda z vermikompostu, v případě jejího nedostatku byla využita voda z RAS. Všechny substráty byly zakryty černou netkanou textilií (pro zamezení nadměrného pronikání světla a tím i zatraktivnění nejvýše položených vrstev substrátu) a celé nádrže pak plexisklem (obr. 6). Dvě opakování obou varianty substrátů byla osazena registračními teploměry, pro účely zpracování dat byly z těchto záznamů vytvořeny průměrné hodnoty za každou variantu. Zároveň byla sledována i teplota okolního vzduchu. Žížalí populace byly kontrolované každé dva týdny od nasazení. Pro tento účel byly všechny kruhové nádrže osazeny šesti svislými PP trubkami systému KG (obr. 6) o vnitřním průměru 12,5 cm (plocha každé trubky tak byla ca 122,8 cm2, což představuje přibližně 2,93 % celkové užitné plochy kruhové nádrže). V plášti těchto trubek bylo vytvořeno 6 podélných otvorů, aby byl zajištěn přímý kontakt s okolním substrátem (obr. 6). Řada těchto vzorkovacích trubek byla označena písmeny A až F, přičemž pro účely kontroly v daném termínu byly využity pouze tři z nich (např. A, C, E). Následující kontrola pak byla založena na kontrole trubek B, D, F. V jednotlivých termínech tak byly kontrolovány substráty v trubkách, ve který nebyly žížaly po dobu 28 dnů rušeny. Při každé kontrole byl v přebraných trubkách zjištěn počet dospělců. Ti byli po odstranění nečistot z jejich povrchu individuálně zváženi na kapesních vahách Kern CM 60-2N (Kern&Sohn GmbH, Balingen, Německo). Zaznamenán byl rovněž počet kokonů a juvenilů. Na konci experimentu byly přebrány substráty ze všech trubek a v případě jednoho opakování obou variant (KV i SL) také ½ zbylého substrátu (po vyjmutí vzorkovacích trubek). Jednalo se o polovinu kruhové nádrže 19

s umístěním trubek D až F a pozorované počty byly porovnány s predikcí získanou z průměru všech vzorkovacích trubek. Obr. 6. Nahoře série kruhových nádrží použitá při experimentu 4. Uprostřed vlevo var. substrátu s krmnými vrstvami (KV) z drcené pšeničné slámy a RAS kalů. Uprostřed vpravo 20

var. využívající slámové lože (SL) před aplikací kalů. Dole vlevo nasazování žížal do var. KV. Dole vpravo zakrytí substrátů černou netkanou textilií a plexisklem (varianta SL). Experiment 5 Poslední experiment je svým designem nejblíže situaci, kdy bude probíhat vermikompostování kalů v reálném provozu a svou realizací přesahuje časový rámec tohoto projektu. Hlavními cíli jsou management vermikultury v níže uvedeném rozsahu, získání prvních poznatků o jejím přezimování v daných klimatických podmínkách a doufejme, že i první zkušenosti se separací uzrálého vermikompostu a vykultivovaných žížal ve větším měřítku. Byla vytvořena rámová konstrukce, která byla vyložena silnostěnnou netkanou textilií (obvykle využívanou jako podklad pod zahradní bazény, v tomto případě zamezuje přímému kontaktu vermikultury s okolním prostředím vniku predátorů žížal, jiných druhů žížal, potažmo úniku chovaných žížal), čímž vznikl prostor o rozměrech 191 x 205,5 cm (plocha 3,925 m2). Tento byl dne 19. 8. 2012 naplněn 120 kg celé ovesné slámy a 120 kg čerstvého směsného kalu z RAS (obr. 7). Při této příležitosti byly diagonálně do dvou protilehlých rohů a středu umístěny 3 svislé trubky z odpadního systému KG s podélnými otvory po svém obvodu tak, aby byl zajištěn přímý kontakt s okolním substrátem. Jejich vnitřní průměr byl 19 cm (plocha každé trubky je tak 0,0284 m2, což představuje 0,72 % plochy celého vermikompostu). Od tohoto dne začala být měřena mocnost vytvořeného substrátu (jeho postupné sléhání) a v hloubce ca 25 cm také jeho teplota (v 8:00 ráno). Po překonání termální fáze rozkladu (31. 8. 2012, 13. den) bylo přistoupeno k plošnému vysazení 2000 dospělců žížal E. andrei. 52. den experimentu (9. 10. 2012) bylo přidáno opět 120 kg celé ovesné slámy a 120 kg čerstvého směsného kalu z RAS a 23. 10. 2012 (66. den) byl zkontrolován stav žížalí násady pomocí přebrání substrátů ze vzorkovacích trubek. 98. den (24. 11. 2012) bylo přidáno dalších 80 kg celé ovesné slámy a 60 kg čerstvého směsného kalu z RAS (jeho obsah sušiny byl totiž vyšší). Poté byl vermikompost zazimován. Další kontroly jsou plánovány na jaře 2013 za účelem kontroly žížalí populace a na konci léta téhož roku, kdy by již měl být tento vermikompost vyzrálý. Tyto aktivity jsou ale již nad časový rámec tohoto projektu. 21

Obr. 7. Vermikompost založený za účelem realizace experimentu V. Diagonálně vzorkovací trubky pro průběžné vyhodnocování rozvoje žížalí populace. 4. Výsledky EXPERIMENT 1 Přežití a růst dospělců První velmi pozitivní a pro následný proces vermikompostování velmi zásadní skutečností byl fakt, že násada žížal se ve všech substrátech novým podmínkám navzdory značným teplotním změnám (násada pocházela ze zazimovaného vermikompostu) úspěšně přizpůsobila a až do 49 dne experimentu, tj. 6 týdnů od nasazení žížal setrvávala nad úrovní 90% přežití, a to i ve variantách s 30% zastoupením kalů. Následovalo období postupného úhynu nasazených dospělců (viz obr. 8). Statisticky výrazné rozdíly v přežití dospělců byly zaznamenány pouze 98. den experimentu (F12,26 = 3,050, p = 0,008), kdy v substrátu O30 přežívalo více dospělých žížal, než tomu bylo v případě skupin B30 a R5 až R30. V následujícím období však již nebyl tento rozdíl detekován a přežití ve skupině O30 rovněž kleslo. Finální průměrné přežití napříč skupinami dosahovalo mezi 40 až 70 % s jedinou 22

výjimkou, kterou byl substrát B30 s přežitím 23,3 %. Plná číselná informace o procentním přežití napříč testovanými substráty včetně statistického vyhodnocení je shrnuta v přílohové části této zprávy tab. P1. Přežití, potažmo hmotnost nasazených dospělců nebyla při ukončení experimentu (den 133) vyhodnocena, neboť nebylo možné jednoznačně velikostně odlišit původní násadu od vlastního potomstva. Průměrná individuální hmotnost žížal v kontrolní skupině po nasazení klesala (obr. 9), což není při bližším pohledu příliš překvapivé. Žížaly totiž pocházely z živinově a potravně velmi bohatého prostředí a v experimentu byly nasazeny do relativně chudého substrátu. Totéž lze v podstatě říci i o skupinách s obsahem 5 a 10 % kalů, kde hmotnost zůstala přinejmenším do následujícího přepočítání (den 21) konstantní a pouze v některých případech mírně vzrostla. V bohatších substrátech (20 a 30% zastoupení kalů) však byl pozorován nárůst průměrné individuální hmotnosti. Po 35. dni však došlo k poklesu hmotnosti dospělců napříč skupinami (obr. 9), což lze přisuzovat nástupu reprodukce a související energeticky náročné produkci kokonů (viz níže). Postupem času (ca od 77. dne) se začala na hmotnosti dospělců více odrážet také skutečnost kumulace žížalích metabolitů v substrátech v důsledku namnožení žížalích populací i vyčerpání pro žížaly vhodné potravní nabídky (viz např. studie Kaplan a kol., 1980; Hartenstein a Amico, 1983; Elvira a kol., 1997, Koubová a kol., 2012). Přímé porovnání, které je shrnuto v navazujícím odstavci, je však pro toto období více komplikované, neboť kumulace metabolitů a vyčerpání potravní základny by markantnější u substrátů s početnějšími populacemi. Za běžných chovatelských podmínek by žížaly již zvermikompostované substráty opustily, resp. by jim byly nabídnuty nové, a to obvykle přidáním nové vrstvy krmného substrátu, do kterého by se přemístily. V rámci pokusu však toto nebylo žížalám umožněno. K popisu již zmíněné růstové dynamiky je nutné dodat ještě několik skutečností, které mají zásadní vliv na růst nasazených dospělců a s tím související reprodukci při hodnocení volby kalu a jeho zastoupení v substrátech. Plná číselná informace o vývoji individuální hmotnosti nasazených dospělců napříč testovanými substráty je uvedena v přílohové části této zprávy obr. P2. Na základě těchto dat můžeme potvrdit, že v porovnání s kontrolou ovlivnil přídavek kalů pozitivně velikost nasazených žížal, a to především v substrátech s jejich 20 a 30% zastoupením (poslední sloupec zmíněné tabulky). Hmotnost žížal vzrůstala s úrovní přídavku jednotlivých kalů, přičemž kromě patrného trendu byly pozorovány i statisticky významné rozdíly (viz dny 21-77 v případě všech použitých kalů; tab. P2). Rozdíly mezi substráty s identickým zastoupením jednotlivých kalů již nebyly tak markantní, přesto však 23

byly pozorovány (viz např. substráty s 5 % kalů ve dni 49, 10 % kalů ve dni 35, 20 % kalů ve dni 63 a 30 % kalů ve dnech 49-77; tab. P2). V tomto ohledu lze konstatovat, že substráty s kaly ze sedimentačního rybníka byly pro růst žížal (nemluvě o jejich reprodukci viz níže) méně vhodné. To patrně souvisí s jejich již částečně proběhlou mineralizací, kterou lze nejsnáze pozorovat na sníženém obsahu organických látek, popř. organického uhlíku v kombinaci s nižšími koncentracemi důležitých prvků, především dusíku (celkový dusík, viz tab. 1). V těchto kalech je pro žížaly vhodná potravní nabídka přirozeně více omezená. Produkce kokonů a juvenilů Z pohledu vermikompostování je zásadní skutečností reprodukce nasazených žížal, které především díky svému potomstvu celý proces podstatným způsobem akcelerují. Po 7 dnech od nasazení nebyly při kontrole přežití žížalí násady pozorovány žádné kokony. Po 14 (21. den experimentu) však již začala být reprodukce patrná a vrcholila mezi 35. a 49. dnem. Poté začala klesat a ca od 91. dne byla velmi nízká (v průměru pod hranicí 10 kokonů na inkubátor). Plná číselná informace o produkci kokonů napříč testovanými substráty včetně statistického vyhodnocení je shrnuta v přílohové části této zprávy tab. P3. Vzhledem k malému počtu opakování, relativně úzkému rozmezí pozorovaných hodnot a jejich variabilitě však byl pozorován statisticky průkazný rozdíl pouze jednou, a to 49. den, kdy v substrátu O30 bylo průkazně více kokonů než v případě varianty R10. Na vině je tak do určité míry malá síla metodologicky správně použitých neparametrických testů. Pro zhodnocení základních trendů produkce kokonů však v našem případě postačí pohled na obr. 10., kde krom již zmíněných početních dynamik lze dobře vidět, že na kaly bohatší substráty zajištovaly lepší podmínky, přičemž u variant O20 a O30 bylo v maximu pozorováno přes 40, resp. 50 nakladených kokonů (den 49). Varianty O5 a O10 byly kontrolní skupině podstatně blíže. V případě substrátů s kaly z biofiltru byly pozorovány identické tendence, substráty B20 a B30 však nepřekročily hranici 30, resp. 40 kokonů. Obdobné trendy byly pozorovány u kalů ze sedimentačního rybníka, kdy pozorovaná maxima nepřesáhla hodnotu 30 ani v nejbohatších variantách. Poměrně překvapivý byl také značný nárůst produkce kokonů ve variantě R5, která se víceméně překrývala se substráty R20 a R30. Nakonec je nutné podotknout dvě skutečnosti. 1) za rozhodující lze vzhledem k ustanovení žížalí populace v substrátech považovat kokony nakladené do 63. dne (alespoň v tomto případě), po němž následoval značný pokles jejich produkce a 2) přímé porovnávání počtu 24

nakladených kokonů po uvedeném termínu je komplikováno zvětšujícími se rozdíly v úrovni přežití dospělců v substrátech (obr. 8, tab. P1). Jestliže kokony byly poprvé pozorovány 14 dní po nasazení (21. den experimentu), tak první juvenilové byli pozorováni hned při následujícím přepočítání (35. den experimentu). Tato skutečnost nám potvrzuje velice krátkou dobu inkubace u E. andrei a je tak jedním ze zásadních faktorů jejich vysokého reprodukčního potenciálu. Zde je nutné rovněž podotknout, že kokony tohoto druhu obsahují hned několik juvenilů. Po objevení se prvních juvenilů začal jejich počet prudce stoupat a napříč substráty dosáhl svého vrcholu ca 91. den (obr. 11). Poté jejich počet osciloval na poměrně úzkém rozmezí mezi 250 a 300 kusy, což vede k úvaze, že zde byla dosažena nosná kapacita prostředí (jen pro připomínku tento počet juvenilů byl společně s dospělci a kokony v pouhých 200 g iniciální sušiny!). Živinově nejchudší kontrolní substrát početně zaostával, přičemž v případě kalů z odchovu a biofiltru byl následován variantami O5, resp. B5. Tento trend nebyl v případě substrátů s rybničním kalem patrný, přičemž varianty všech kalů s více než 10 % nevykazovali podstatné rozdíly oproti bohatším variantám příslušných kalů (obr. 11). Mírné navýšení počtu juvenilů napříč substráty při ukončení experimentu lze spíše přičíst na vrub zvýšenému úsilí, které bylo vyvinuto pro nejlépe úplnou separaci žížal a vermikompostů. Plná číselná informace o produkci juvenilů napříč testovanými substráty včetně statistického vyhodnocení je shrnuta v přílohové části této zprávy tab. P4. 49. a 63. den byl pozorován jednak trend sníženého počtu juvenilů v kontrole oproti variantám R20 a R30 a nižší hodnoty byly patrné také v substrátech O20 a O30. Zde se však nejednalo o dlouhodobou záležitost a na vině bylo spíše pozdější líhnutí juvenilů (viz počty kokonů mezi těmito skupinami, tab. P3). 105. den byl počet juvenilů v kontrole nižší v porovnání se skupinami O30, B20, R5, R20 a R30. Trend k méně profitující žížalí populaci v kontrolní skupině, potažmo méně bohatých substrátech tak byl pozorován i v případě počtu juvenilů. 25

Obr. 8. Experiment 1 přežití násadového materiálu žížal (dospělců Eisenia andrei) v kontrolním substrátu z drcené pšeničné slámy (K) a ve variantách s RAS kaly z odchovu (O), biofiltru (B) a rybníka (R) s iniciálním zastoupením 5, 10, 20 a 30 % v sušině. 26

Obr. 9. Experiment 1 individuální hmotnost násadového materiálu žížal (dospělců Eisenia andrei) v kontrolním substrátu z drcené pšeničné slámy (K) a ve variantách s RAS kaly z odchovu (O), biofiltru (B) a rybníka (R) s iniciálním zastoupením 5, 10, 20 a 30 % v sušině. 27

Obr. 10. Experiment 1 počty kokonů v kontrolním substrátu z drcené pšeničné slámy (K) a ve variantách s RAS kaly z odchovu (O), biofiltru (B) a rybníka (R) s iniciálním zastoupením 5, 10, 20 a 30 % v sušině. 28

Obr. 11. Experiment 1 počty juvenilů v kontrolním substrátu z drcené pšeničné slámy (K) a ve variantách s RAS kaly z odchovu (O), biofiltru (B) a rybníka (R) s iniciálním zastoupením 5, 10, 20 a 30 % v sušině. 29

Rozbory získaných vermikompostů Ačkoliv bylo se všemi substráty nakládáno obdobným způsobem, bylo při analýzách finálních vermikompostů několik zajímavých zjištění. Vlhkost substrátů byla poměrně vysoká a to navzdory skutečnosti, že v průběhu více než čtyřměsíčního experimentu byly pouze výjimečně dovlhčovány další vodou. Většina vypařené vody totiž v inkubátorech zpětně kondenzovala a jistý vliv lze připsat na vrub i metabolické vodě, která vznikala při rozkladu substrátů mikroorganismy. Především substráty s vyšším zastoupením kalů dosahovaly vyšších hodnot sušiny v porovnání s kontrolou a týž trend byl pozorován v závislosti na velikosti zastoupení jednotlivých kalů v příslušných experimentálních variantách (tab. P5). Nejvyšších hodnot bylo dosahováno ve variantách s rybničními kaly, což však lze spíše okomentovat přítomností písčité, již mineralizované frakce s vysokou sušinou, která vlhkost hůře aktivně váže. Subjektivním ohodnocením nepůsobily tyto kaly jako sušší. Aktivní i výměnné ph finálních vermikompostů bylo nejvyšší v kontrolní skupině. Ve variantách s RAS kaly ph klesalo až na výjimky v závislosti na velikosti přídavku kalu. Nejnižších hodnot ph bylo dosahováno ve variantách s kalem z odchovu, jehož iniciální ph bylo nejnižší (viz tab. 1). Při pohledu na ph vstupních materiálů však lze konstatovat, že při procesu vermikompostování došlo k jeho žádané stabilizaci ve smyslu posunu k neutrální oblasti. Obsah organických látek a potažmo i organického uhlíku odrážel iniciální kompozici substrátů danou především zastoupením na uhlík bohaté slámy. Finální vermikomposty se tak vyznačovaly užším C/N poměrem v závislosti na rostoucím zastoupení použitých kalů (tab. P5). Nejhorších parametrů s ohledem na obsah uhlíku a především dusíku dosahovaly varianty s rybničním kalem, neboť tento byl na zmíněné živiny nejchudší (tab. 1). Tato skutečnost rovněž naznačuje, že z pohledu následného využití vermikompostů jakožto hnojiva s vysokým obsahem těchto živin jsou rybniční kaly nejméně vhodné. Výše uvedené charakteristiky finálních substrátů můžeme také zhodnotit s ohledem na jejich další využití jakožto kompostu (hnojiva). Pro tyto účely vycházíme z příslušné normy, kterou je ČSN 46 5735, Průmyslové komposty. Ta specifikuje určité znaky, které musejí průmyslové komposty a potažmo tedy i vermikomposty splňovat. Z námi sledovaných parametrů se jedná o sušinu, která by měla být v rozmezí 35 až 60 %, celkový dusík min 0,60 %, C/N poměr max. 30 a aktivní ph od 6,0 do 8,5. Námi získané zastoupení sušiny je spíše dáno designem experimentu v uzavřených inkubátorech a vcelku není pochyb o tom, že realizace v konvenčních podmínkách bude dosahovat požadovaných limitů. Obsah celkového 30

dusíku byl minimálně dvakrát vyšší (tab. P5) a C/N poměrem vyhovovala i kontrolní skupina. Varianty s příslušnými kaly pak mohou být v tomto ohledu hodnoceny lépe v závislosti na jejich zastoupení. Aktivní ph bylo rovněž vyhovující ve všech variantách, byť v substrátech s nejkyselejším kalem (z odchovu) se nalézalo na spodní hranici požadovaného rozmezí (tab. P5). Zastoupení hořčíku, vápníku a fosforu bylo ve variantách s kaly průkazně bohatší. Napříč kaly však nebyly pozorovány výrazné rozdíly (obr. P5), což dobře reflektuje jejich velmi podobné iniciální složení (obr. 1). Opakem však byl draslík, jehož nejvyšší koncentrace byly pozorovány v kontrolní skupině a nejnižších hodnot bylo dosahováno v nejbohatších variantách napříč všemi použitými kaly (obr. P5). Tato skutečnost je dána vysokým obsahem draslíku v pšeničné slámě (obr. 1). Výsledky ohledně dynamiky reprodukce žížal, fyzikálně-chemických vlastností finálních vermikompostů a obsahů živin jsou nakloněny spíše k využívání variant s vyšším zastoupením kalů (především v případě využívání kalů z odchovu a biofiltru). Tyto však musejí být hodnoceny i z hlediska možné kontaminace, kdy nejsledovanějšími parametry jsou obsahy těžkých kovů. Již zmíněná norma ČSN 46 5735 také určuje nejvyšší přípustné množství sledovaných látek ve vstupních surovinách, které mohou být pro kompostování (a tedy i vermikompostování) použity. Tyto hodnoty jsou sumarizovány v tab. 3, přičemž z porovnání s tab. 1 je patrné, že drcená pšeničná sláma i všechny typy použitých RAS kalů jsou pro tento účel vhodné. Tab. 3. Nejvyšší přípustné množství sledovaných látek v sušině u surovin využívaných pro kompostování dle ČSN 46 5735. Sledovaná látka Nejvyšší přípustné množství v sušině -1 Rtuť (mg.kg ) 10-1 Nikl (mg.kg ) 200 Olovo (mg.kg-1) 500-1 Kadmium (mg.kg ) 13 Měď (mg.kg-1) 1200 Chrom (mg.kg-1) 1000 Zinek (mg.kg-1) 3000 Obsah těžkých kovů ve finálních vermikompostech sledoval obecně platný trend vzrůstu s velikostí přídavků jednotlivých kalů. Kontrolní skupina tak byla obvykle nejméně zatížená. Jediné výjimky snad tvořila pouze rtuť a měď, jejichž obsahy byly napříč textovanými úrovněmi velmi podobné (tab. P6). Obsahy niklu a olova byly mezi jednotlivými 31

kaly na daných úrovních vyrovnané. V případě kadmia a zinku však byl průkazně nejzatíženější kal z odchovu (tab. P6), což odpovídá vstupním analýzám (tab. 1). Norma ČSN 46 5735 zároveň definuje nejvyšší přípustné množství sledovaných látek ve finálních kompostech, které pak dělí do dvou kvalitativních tříd. Z celkového pohledu lze ohodnotit získané vermikomposty velmi dobře. Pokud porovnáme nejvyšší pozorované hodnoty s limity pro vyšší (I.) třídu, pak rtuti bylo více než 24krát méně, než daná norma připouští (tab. 4). Niklu bylo více než 5krát, olova více než 16krát a kadmia více než 2krát méně. V případě mědi a chromu to pak bylo více než 5krát, resp. 7krát méně (tab. 4). Jediným problematickým prvkem pak byl zinek. Ten převyšoval limit více než 3,5krát, resp. 1,8krát při porovnání s hodnotami danými pro první, potažmo druhou třídu. Zde je však nutné podotknout několik skutečností. Vůči daným limitům jsou zde tímto způsobem porovnány pouze nejvyšší sledované hodnoty, tzn., že ve všech ostatních variantách vermikompostů byly pozorovány obsahy nižší. Jelikož je zinek esenciální prvek, mají živé organismy poměrně dobře vyvinuté mechanismy umožňující regulaci jeho obsahu v těle (Kouba a kol., 2010), což se mimochodem prokázalo i v tomto experimentu (viz vzrůst obsahů zinku ve vermikompostech tab. P6 s jeho prakticky totožnými koncentracemi v biomase žížal tab. P7). Jeho přítomnost pak pravděpodobně také zamezila akumulaci kadmia v žížalách (viz níže). Vysoký obsah zinku v RAS kalech je navíc známý (viz např. Marsh a kol., 2005), přičemž za hlavní zdroj lze dozajista označit použité krmivo (pozinkovaných částí je v této technologii totiž minimum). Na daném RAS jsou nejčastěji využívanými krmivy Efico Enviro 920 a Orbit 929 (o velikosti pelet 3 a 4,5 mm) od firmy BioMar A/S, Dánsko. Sám výrobce deklaruje přídavek monohydrátu síranu zinečnatého v množství 137, resp. 135 mg.kg-1 krmiva. Deklarované množství samotného zinku v krmivu je pak v obou případech 100 mg.kg-1, nicméně naše analýzy prokázaly koncentrace vyšší (tab. 5). Jelikož je obsah zinku ve svalovině odchovávaných ryb pouze 13,00±1,13 mg.kg-1 (analyzovány byly tři směsné vzorky z filetů deseti kusů ryb o živé hmotnosti více než 500 g, jednalo se o 5 a 5 ks pstruha duhového Oncorhynchus mykiss a sivena amerického Salvelinus fontinalis jenž celý svůj odchov podstoupily na daném RAS), je nasnadě, že značná část zinku z krmiva se uvolňuje do RAS kalů, resp. po vyluhování i do vody, kde se do určité míry koncentruje. Toto lze dle našeho přesvědčení prokázat i za předpokladu, že budou provedeny analýzy celých rybích těl, tj. včetně kosterní soustavy a na zinek bohatého hepatopankreatu atd., které prokáží obsahy tohoto kovu vyšší. 32