MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Diagnostický význam amplifikace genů hterc a MYCC při vzniku a vývoji cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla Diplomová práce Anna Laštůvková VEDOUCÍ PRÁCE: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. Brno 2013

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Bc. Anna Laštůvková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Diagnostický význam amplifikace genů hterc a MYCC při vzniku a vývoji cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla Experimentální biologie Molekulární biologie a genetika doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. Akademický rok: 2013 Počet stran: 84 Klíčová slova: Karcinom děložního hrdla; cervix uteri; cervikální intraepiteliální léze; amplifikace, hterc, MYCC, lidský papillomavirus, FISH

Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Bc. Anna Laštůvková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Diagnostic utility of hterc and MYCC genes amplifications in initiations and development of cervical intraepithelial dysplasia and cervical carcinoma Degree Programme: Experimental Biology Field of Study: Supervisor: Molecular Biology and Genetics doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. Academic Year: 2013 Number of Pages: 84 Keywords: cervix uteri, carcinoma, hterc, MYCC, cervical intraepithelial neoplasia, human papilloma virus, HPV, FISH

Abstrakt Karcinom děložního hrdla je v České republice druhým nejčastějším nádorovým onemocněním u žen. I když během posledního desetiletí byla u této malignity dobře popsána etiologická role infekce lidskými papilomaviry (HPV), přes vysokou četnost výskytu infekce HPV u vzorků s dysplázií se vyvinou "high grade léze" a karcinom děložního hrdla pouze u zlomku pacientek infikovaných HPV. Důležitou úlohu v etiologii nádorové transformace mají i genetické defekty. Stejně jako u většiny dalších solidních nádorů se i u karcinomu děložního hrdla setkáváme se specifickými chromozomovými abnormalitami, které mohou způsobovat deregulaci genové exprese a iniciovat tak vznik a vývoj nádorů. S progresí premaligních cervikálních lézí do dalších stádií a progresí karcinomu jsou asociovány zejména amplifikace protoonkogenu MYCC (8q24) a amplifikace genu pro lidskou telomerázu hterc (3q26). Práce shrnuje výsledky vyšetření 108 pacientek ze skupin bez onkologického nálezu, prekanceróz a s karcinomy. Abstract Cervical cancer remains the second most common malignancy among women in the Czech Republic. Although the etiological role of high-risk human papilloma virus (HPV) infection was well described in cervical tumorigenesis during last decades, the high grade lesions and cervical cancer are developed only in a part of infected patients despite the high incidence of HPV infection in dysplasia samples. Genetic defects also play an important role in tumor transformation etiology. In cervical carcinoma - as well as in many others solid tumors specific chromosomal aberrations are known. These aberrations can cause gene expression deregulation and so play a role in cancer formation and development. Some chromosomal aberrations have been associated with the progression of premalignant cervical dysplasia to the carcinoma, especially the amplification of the human telomerase gene hterc (3q26) and protooncogene MYCC (8q24). In this study we present results of detection of chromosomal abnormalities and HPV infection by FISH technique in group of 108 patients from groups with no oncological finding, precancerous lesions and with carcinomas.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli, panu docentu RNDr. Petru Kuglíkovi, CSc. za odborné vedení, cenné připomínky a za čas, který mi věnoval. Dále bych chtěla poděkovat RNDr. Vladimíře Vallové, Ph.D. a MUDr. Lucii Moukové, Ph.D. za poskytnuté rady a uvedení do problematiky karcinomu děložního hrdla. Na závěr bych ráda poděkovala všem kolegyním na Oddělení lékařské genetiky FN Brno za vytvoření příjemného prostředí a podporu při vypracování této diplomové práce. Práce byla podpořená z grantu IGA MZ NT11089-4.

Obsah 1 ÚVOD... 1 1.1 Děložní hrdlo... 2 1.2 Etiologie karcinomu děložního hrdla... 3 1.3 Incidence a prevalence karcinomu děložního hrdla... 5 1.4 Vznik cervikálních intraepiteliálních neoplázií a karcinomu děložního hrdla. 8 1.4.1 Klasifikace cervikálních intraepiteliálních neoplázií a karcinomu děložního hrdla... 9 1.5 Příznaky rakoviny děložního hrdla a jejich diagnostika... 11 1.5.1 Papanicolaoův test... 12 1.5.2 Metoda cytologie na tenké vrstvě... 12 1.5.3 Další metody vyšetření děložního hrdla... 12 1.6 Prevence karcinomu děložního hrdla... 13 1.7 Léčba karcinomu děložního hrdla a možné komplikace... 14 2 Lidské papilomaviry... 15 2.1 Onkogenní potenciál lidských papillomavirů... 15 2.2 Genom papilomavirů... 16 2.2.1 Virové proteiny E6 a E7... 18 2.3 Průběh infekce lidskými papilomaviry... 18 3 Chromozomové abnormality u cervikálních intraepiteliánílch neoplázií (CIN) a karcinomu děložního hrdla a jejich význam... 21 3.1 Amplifikace genu hterc... 21 3.2 Amplifikace genu MYCC... 23 3.3 Další časté chromozomové změny... 24 4 Cíle diplomové práce... 27 5 Materiál a metody... 28 5.1 Soubor vyšetřených pacientek... 28

5.2 Odběr a zpracování materiálu... 28 5.3 Metody detekce chromozomových abnormalit - Technika FISH... 28 5.3.1 Zpracování nativních preparátů... 28 5.3.2 Vysis Cervical FISH Probe Kit... 29 5.3.3 Protokol FISH... 30 5.3.4 Zpracování LBC preparátů... 31 5.3.5 Hodnocení preparátů... 32 6 Výsledky... 37 6.1 Klinická charakteristika souboru pacientek... 37 6.2 Identifikace buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků prekancerózních cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla... 40 6.2.1 Analýza buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků bez onkologického nálezu... 40 6.2.2 Analýza buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků vzorků prekancerózních cervikálních intraepiteliálních dysplázií... 41 6.2.3 Analýza buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků karcinomu děložního hrdla... 43 6.2.4 Analýza výskytu HPV infikovaných buněk, amplifikací genů hterc a MYCC ve vztahu ke stratifikaci pacientek do nízko, středně a vysoce rizikových skupin 45 6.3 Studium korelace mezi chromozomovými abnormalitami a lymfangioinvazí 46 6.3.1 Korelace mezi výskytem HPV infikovaných buněk, amplifikací genů hterc a MYCC a lymfangioinvazí... 46 7 Diskuze... 48 8 Souhrn... 59 9 Summary... 61 10 Literatura... 63 11 Přílohy... 68

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AGC-NEO = atypické žlaznaté buňky nevylučující neoplázii (atypical glandular cells favour neoplastic) AGC-NOS = atypické žlaznaté buňky, blíže nespecifikované (atypical glandular cells not otherwise specified) ASC-H = léze vysokého stádia atypických dlaždicových buněk (high-grade lesion of atypical squamous cells) ASCUS = atypické dlaždicové buňky nejasného významu (atypical squamous cells of undeterminded significance) CGH = komparativní genomová hybridizace (comparative genome hybridization) CIN = cervikální intraepiteliální neoplázie (cervical intraepithelial neoplasia) CIS = karcinom in situ (carcinoma in situ) DAPI = diaminofenylindol (diamidinophenylindole) DNA = deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid) ENDO = endocervix EXO = exocervix FIGO = Medzinárodní federace pro gynekologii a porodnictví (International Federation of Gynecology and Obstetrics) FISH = fluorescenční in situhybridizace (fluorescence in situhybridization) HLA= hlavní histokompatibilní koplex (human leukocyte antigen) HPV = lidský papilomavirus (human papillomavirus) HR-HPV = vysokorizikový typ lidského papilomaviru (high-risk papillomavirus) H-SIL = vysoké stádium dlaždicové intraepiteliální léze (high-grade intraepithelial lesion) CHA = chromozomová aberace IARC = Medzinárodní agentura pro výzkum rakoviny (International Agency for Research on Cancer) I-FISH = interfázní fluorescenční in situ hybridizce (interphase-fluorescence in situ hybridization) LBC = cytologie na tenké vrstvě (liquid-based cytology) LCR = long control region LR-HPV = nízkorizikový typ lidského papilomaviru (low-risk human papillomavirus) L-SIL = nízké stádium dlaždicové intraepiteliální léze (low-grade intraepithelial lesion) MHC = hlavní histokompatibilní komplex (major histocompatibility complex) MOÚ = Masarykův onkologický ústav v Brně ORF = otevřený čtecí rámec (open-reading frame) Pap-test = Papanicolaou test PBS = fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (phosphate-buffered saline) prb = retinoblastomový protein (retinoblastoma protein) RNA = ribonukleová kyselina (ribonucleic acid) RT-PCR = kvantitativní polymerázová řetězová reakce (real-time polymerase-chain reaction) SSC = citrát sodný (sodium saline citrate) SIL = dlaždicová intraepiteliální léze (squamous intraepithelial lesion) TNM = klasifikace zhoubných novotvarů (Classification of Malignant Tumors) WHO = Světová zdravotnická organizace (World Health Organization)

1 ÚVOD Karcinom děložního hrdla představuje druhé nejčastější maligní onemocnění u žen. Každoročně je v České republice nově diagnostikováno cca 1200 nových případů a asi 400 žen každoročně na toto onemocnění zemře. Karcinom děložního hrdla je nejčastěji diagnostikován u žen ve věku 35-39 let a 60-65 let. V posledních letech však lze pozorovat snižování věku u nově diagnostikovaných dívek a žen, kdy se v ordinacích lékařů stále častěji objevují ženy ve věku od 25 let. Tato skutečnost je zejména dána snižujícím se věkem zahájení pohlavního života a větší promiskuitou dnešní mladé generace. Ačkoli jsou preventivní programy dnes již poměrně rozšířené, incidence ani mortalita onemocnění se příliš nemění. Ke snížení incidence v současnoti přispívá plošně zaváděné očkování proti dvěma nejagresivnějším kmenům lidských papilomavirů HPV16 a 18, jež jsou prokazatelně popsanými původci kancerogeneze děložního hrdla. Nicméně je stále nutné analyzovat nové genetické markery časné progrese lehkých dysplazií děložního hrdla v invazivní karcinom. Vznik karcinomu děložního hrdla je dlouhodobý proces, který trvá několik let a kterému předchází prekancerózní stádia v podobě tzv. cervikálních intraepiteliálních lézí. Za příčinu vzniku těchto lézí byla již v minulosti identifikována infekce oblasti děložního hrdla vysoce rizikovými typy lidských papillomavirů. Ve většině případů je tato infekce organizmem eliminována. V malém procentu případů může v buňkách dojít k integraci virového genomu do genomu hostitelské buňky a v tomto případě ovlivňují produkty virových genů stabilitu genomu buněk. Samotná integrace virového genomu a produkty virových onkogenů E6 a E7 jsou zodpovědné za maligní transformaci epiteliálních buněk děložního hrdla v oblasti transformační zóny přechodné části exocervixu v endocervix. Cytogenetická analýza genomu nádorových buněk je v současné době důležitou součástí vyšetření nemocných s nádorovým onemocněním. Detailní analýzy chromozomových aberací slouží nejen ke stanovení nebo upřesnění diagnoźy, prognózy a monitorování úspěšnosti terapie, ale mají také nezastupitelnou roli při objasňování příčin maligní transformace buněk. Nejčastěji pozorovanou aberací u karcinomu děložního hrdla byla identikována amplifikace genu pro RNA podjednotku lidské telomerázy (hterc) a amplifikace protoonkogenu MYCC. V nádorových buňkách děložního hrdla je s progresí 1

dysplázií v závažnější stádia a v karcinom detekována rostoucí míra počtu kopií těchto dvou genů. Předložená práce se zabývá studiem jednotlivých markerů amplifikace genu hterc a genu MYCC, přítomnost HPV infikovaných buněk u 108 pacientek ve vztahu k jednotlivým stádiím prekanceróz a karcinomu děložního hrdla. Cílem diplomové práce bylo identifikovat HPV infikované buňky ve vzorcích exocervixu, endocervixu a LBC preparátech, analyzovat a vyšetřit v těchto buňkách vybrané cytogenetické markery (amplifikace genu hterc, amplifikace genu MYCC). Dále vyhodnotit souvislosti mezi infekcí HPV, studovanými chromozomovými abnormalitami a klinickým stádiem onemocnění s cílem stratifikovat pacientky do jednotlivých rizikových poskupin. 1.1 Děložní hrdlo Děložní hrdlo (synonymum děložní krček) představuje nejspodnější třetinu dělohy, která tvoří bariéru mezi pochvou a dutinou dělohy. Hrdlo je tvořeno silnou stěnou z hladké svaloviny a hustého kolagenního vaziva. Děložní hrdlo ční do dělohy jako děložní čípek a představuje důležitou fyzickou bariéru proti pronikajícím virovým, bakteriálním, kvasinkovým a jiným infekcím. Velikost a tvar děložního hrdla se může lišit v závislosti na věku ženy, hormonálním stavu a na tom, zda žena již rodila. Děložní hrdlo (lat. cervix uteri) je tvořeno odlišnými typy epitelií a můžeme ho rozdělit na oblast tzv. exocervixu, čili oblast asi 3 cm dlouhou a 2,5 cm širokou v průměru, která ční do pochvy, a na oblast endocervixu, která tvoří přechod mezi pochvou a dutinou dělohy. Exocervix je tvořen vrstevnatým dlaždicovým epitelem, zatímco endocervix je tvořen jednovrstevným cylindrickým epitelem. Oblast, kde dochází k přechodu epitelu exocervixu v epitel endocervixu, je nazývána jako tzv. transformační (T-zóna) zóna. V této tranformační zóně dochází během života ženy k mnohokrát se opakujícím metaplaziím změnám jednoho typu tkáně, popř. epitelu v typ jiný. Epitel endocervixu a exocervixu se mění i v závislosti na prostředí, které na něj působí. Např. pokud je endocervix vystaven silně kyselému prostředí pochvy, dochází k metaplázii na vrstevnatý epitel, který je k tomuto prostředí odolnější. Podobně, pokud se exocervix nachází v méně krutém prostředí oblasti dělohy, dochází ke změně epitelu v dlaždicový epitel. Období, kdy k těmto změnám epitelů dochází, jsou 2

především období puberty, kdy dochází k ústupu části endocervixu z dělohy; dále při změnách hrdla během menstruačního cyklu a také po menopauze, kdy se děloha začíná zmenšovat a dochází k posunu transformační zóny směrem do dělohy. Všechny tyto změny jsou běžné a považují se za fyziologicky normální. Přesto ale tyto metaplazmické změny zvyšují riziko vzniku karcinomu v oblasti transformační zóny. Nejčastěji, až v 80 %, vznikají karcinomy z dlaždicobuněčných epiteliálních buněk, které lemují oblast hrdla hovoříme o tzv. dlaždicobuněčných (spinocelulárních) karcinomech (SCC - squamous cervical carcinoma ). Druhým nejčastějším typem jsou adenokarcinomy, které mají původ v žláznatých epiteliálních buňkách a postihují častěji mladší ženy a mají horší prognózu. 1.2 Etiologie karcinomu děložního hrdla Infekce epitelu děložního hrdla v oblasti tzv. transformační zóny lidskými papilomaviry je dnes považována za hlavní, ale nepostačující příčinu vzniku prekancerózních stádií tzv. cervikálních intraepiteliálních neoplázií (tzv. CIN) (Walboomers et al., 1999). V roce 2005 bylo hlavním etiologickým agens karcinomu děložního hrdla uznáno 13 genotypů papilomavirů s vysokým onkogenním potenciálem a to typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 66 (Cogliano et al., 2005; WHO IARC, 2005). Předpokládá se, že infekce papilomaviry se podílí na vzniku až 99,7 % karcinomů děložního hrdla. Ze současně asi 200 popsaných genotypů HPV virů může téměr 40 infikovat oblast děložního hrdla, přičemž alespoň 15 tzv. high-risk HPV má onkogenní charakter a je spojeno s vývojem karcinomu. Typy 26, 53 a 66 jsou pravděpodobně také hrhpv, zatím ale neexistuje dostatečné množství dat, které by to průkazně popsaly (Munoz et al., 2003). Infekce virem HPV patří mezi nejčastější sexuálně přenosnou chorobu. V průběhu života se alespoň jedním typem HPV nakazí až 75 % sexuálně aktivních žen (Cates, 1999; Baseman a Koutsky, 2005). Ačkoli je až u 95 % pacientek s prekancerózními stádii detekována infekce některým z high-risk HPV, vyvine se invazivní karcinom pouze u zlomku z nich. Samotná infekce však k vzniku karcinomu nestačí. K maligní transformaci neoplastických buněk jsou nutné některé další faktory. K rizikovým faktorům patří nízký věk dívek při zahájení pohlavního života, časté střídání partnerů či styk s promiskuitním partnerem. Podrobněji o HPV pojednává kapitola č. 2. 3

Důležitou úlohu v etiologii nádorové transformace mají i genetické defekty. Charakteristickým znakem maligních tumorů je chromozomová nestabilita, ať početní či strukturní, jejíž prognostický i prediktivní význam je doložen u mnoha nádorových onemocnění. U premaligních lézí a buněčných linií karcinomu děložního hrdla byly opakovaně zjištěny specifické chromozomové změny, a to zejména v chromozomových oblastech 3q26 (gen hterc) a 8q24 (gen MYCC). Podle literárních údajů je 80-95 % případů karcinomu děložního hrdla často charakterizováno zmnožením genu pro lidskou telomerázu (hterc) (Heselmeyer-Haddad et al., 2003). Tato specifická genetická abnormalita byla prokázána i u premaligních cervikálních intraepiteliální neopláziií CIN2/CIN3 a v současné době je proto považována za genetickou změnu, která vzniká v raných stádiích tumorigeneze a může predikovat maligní transformaci a progresi tohoto onemocnění (Golijow et al., 2001). Mezi další faktory, které přispívají k progresi v závažnější stádia karcinomu děložního hrdla, patří zejména kouření, infekce virem HIV a některé druhy hormonální substituční léčby (Gadducci et al., 2011). S rostoucím věkem se riziko vzniku onemocnění zvyšuje až dvojnásobně, stejně tak 2-3 násobně zvýšené riziko je pro ženy z hispánského etnika a původní Američanky. Asi trojnásobně zvýšené riziko převládá u žen s nižším socioekonomickým statusem. Je to zejména proto, že tyto ženy podceňují význam preventivních gynekologických vyšetření, při kterých může být provedením Pap testu za včasu odhalena dysplázie buněk děložního hrdla či časná stádia CIN, která by dále vedla ke vzniku karcinomu. Ženy, které již v minulosti byly léčeny s některými sexuálně přenosnými nemocemi, především herpes viry (HHV-6, HHV-7), cytomegaloviry (CMV) a chlamydiemi či genitálními bradavicemi, mají riziko vývoje karcinomu děložního hrdla 2 až 10-ti násobně vyšší oproti běžné zdravé populaci žen. Vyšší riziko platí také pro ženy, které podstupují imunosupresivní léčbu. Bylo také zjištěno, že nedostatek vitamínu C a karotenu zvyšuje vznik neoplázií oblasti děložního hrdla, ačkoli jsou tato data mnohem méně zdokumentována než jiné rizikové faktory. (http://www.health.am/cr/cervical-cancer/). Dále se na vzniku karcinomu mohou podílet některé alely a haplotypy HLA (human leukocyto antigen) systému. Např. ve studii vědeckého týmu Krul et al. (1999) byly identifikovány alely HLA II třídy - DRB1*1501 a DQB1*0602 zvyšující riziko vzniku karcinomu děložního hrdla. Zejména pak byly tyto alely detekovány u HPV-16 pozitivních karcinomů. Bylo zjištěno, že nositelé těchto alel mají v infikovaných buňkách vyšší dávku viru ve srovnání s jedinci nenesoucími tyto alely a jsou také více náchylní k trvalým infekcím 4

virem HPV. Zároveň však také mohou jisté alely poskytovat ochranu před progresí v karcinom, a to alely DRB1*1301 a DQB1*0603, jak bylo prokázáno v 18 z 19 studií meta analýzy provedené v r. 2002 (Hildesheim et al., 2002) a jak bylo také potvrzeno týmem Beskow et al. (2005). Tyto alely jsou protektivní vůči HPV 18/45 asociovaným karcinomům. 1.3 Incidence karcinomu děložního hrdla Karcinom děložního hrdla je po rakovině prsu druhým nejčastějším život ohrožujícím rakovinným onemocněním a v pořadí pátým s nejvyšší mortalitou u žen. Každoročně je v ČR nově diagnostikováno cca 1200 (19/100000 dle ÚZIS ČR 2007) nových případů tohoto onemocnění a zemře cca 400 (7/100000 dle ÚZIS ČR 2007) žen za rok na rakovinu děložního hrdla (Obrázek č. 1). Incidence karcinomu děložního hrdla v České republice dle jednotlivých regionů je na obrázku č. 2. Z obrázků je patrné, že nejvyšší incidence je v Karlovarském a Ústeckém kraji. Nejvyšší incidence - přibližně 80 % všech případů celosvětově připadá na rozvojové země (východní a jižní Afrika, Melanézie a střední Amerika). Srovnání incidence karcinomu děložního hrdla ve světě je zobrazena na obrázku č. 3. Počet úmrtí se za posledních 50 let snížil o cca 74 %, zejména díky rozšíření využívání Pap testu. V rámci Evropy se průměrná incidence pohybuje kolem 9,6/100 000 žen (zdroj SVOD). Ačkoli je karcinom děložního hrdla díky moderním vyšetřovacím metodám velice dobře preventabilní, stále je jeho mortalita velmi vysoká. Je to dáno zejména tím, že největší část nově diagnostikovaných případů karcinomu děložního hrdla připadá na rozvojové krajiny, kde za prvé nejsou všude dostupné a zavedené skríningové metody a za druhé zde hraje velkou roli nedisciplinovanost žen, které podceňují význam preventivních prohlídek a mnohdy přicházejí až ve chvíli, kdy už je u nich karcinom plně vyvinutý. Průměrný věk rozvoje karcinomu děložního hrdla je 52 let. Dle křivky věkové distribuce se karcinom děložního hrdla nejčastěji vyskytuje u žen mezi 35 až 39 lety a 60 až 65 lety, jak je patrno z obrázku č. 4. 5

Obrázek č. 1. Incidence a mortalita karcinomu děložního hrdla v České republice (Zdroj SVOD v přepočtu na světový standard ASR (W). Obrázek č. 2. Incidence karcinomu děložního hrdla v České republice dle jednotlivých regionů (zdroj SVOD). 6

Obrázek č. 3. Srovnání incidence karcinomu děložního hrdla ve světě (přepočteno na světový standard ASR(W), zdroj SVOD). Obrázek č. 4. Incidence karcinomu děložního hrdla podle věkového rozložení v České republice (zdroj SVOD). 7

1.4 Vznik cervikálních intraepiteliálních neoplázií a karcinomu děložního hrdla Nádory děložního hrdla můžeme v prvé řadě rozdělit na zhoubné (maligní) a nezhoubné (benigní). V případě nezhoubných nádorů děložního hrdla se jedná o tzv. endocervikální polypy, nejčastějším maligním nádorem je karcinom. Z karcinomů tvoří až 85-90 % dlaždicobuněčný (též spinocelulární) karcinom a ve 20 % se jedná o adenokarcinomy nádory, které mají původ v buňkách žláznatého epitelu. Vznik karcinomu je dlouhodobý proces, při kterém dochází k postupné akumulaci genetických změn. Jeho vzniku tudíž předchází různě dlouhé období, uvádí se rozmezí zhruba 10 20 let (Snijders et al., 2006). Vztah mezi incidencí infekce HPV, prekancerózními stádii a karcinomem je znázorněn na obrázku č. 5. Vzniku karcinomu děložního hrdla předcházejí premaligní stádia - prekancerózní léze, označované jako tzv. cervikální intraepiteliální neoplázie (CIN). CIN vznikají proliferací nezralých buněk dlaždicového epitelu. Pro neoplastické buňky jsou charakteristické některé specifické rysy, jako jsou abnormality buněčného jádra, abnormální distribuce chromatinu, pleomorfizmus (mnohotvárnost) a hyperchromicita (zvyšování hustoty) jaderné DNA. U neoplastických buněk je také často pozorováno zvyšování poměru mezi jadernou a cytoplazmatickou hmotou (tzv. nukleo-cytoplazmatický index). Proces maligní transformace je nejčastěji spouštěn akumulací genetických změn. Mezi nejčastější patří mutace a vyřazení funkce tumor supresorových genů, mutace v genech řídících buněčný cyklus a buněčnou proliferaci. Významným faktorem je také nově nabytá nesmrtelnost buněk, která je dána aktivací enzymu telomerázy. To má za následek imortalizaci buněk a jejich nekontrolovatelné množení a vytvoření masy maligních buněk necitlivých k obranným mechanizmům organismu. Také v případě karcinomu děložního hrdla lze pozorovat zvýšenou aktivitu telomerázy, která je dána amplifikací genu hterc genu, který kóduje RNA podjednotku (RNA templát) enzymu telomerázy. 8

Obrázek č. 5. Vztah mezi incidencí infekce HPV, prekancerózními stádii a karcinomem. Křivka HPV (modrá) zobrazuje incidenci infekce, která je nejvyšší po zahájení sexuálního života a dále pak klesá. To je dáno zejména přechodností infekce, kdy je pouze zlomek infekcí HPV perzistentní. Křivka incidence prekanceróz (zelená) začíná růst pár let po křivce infekce HPV a následně klesá, což je dáno dlouhotrvajícím vývojem prekancerózních lézí. Karcinom se vyvine jen u zlomku žen. Křivka incidence karcinomu (růžová) začíná stoupat pár let po křivce incidence prekanceróz, což je dáno poměrně dlouhou dobou potřebnou k progresi v invazivní karcinom. Se 40. rokem se křivka incidence karcinomu přibližuje křivce incidence prekanceróz (Kiššová, 2011). 1.4.1 Klasifikace cervikálních intraepiteliálních neoplázií a karcinomu děložního hrdla Podle závažnosti jsme schopni rozlišit různé stupně CIN, které jsou určovány na základě rozsahu nediferencovaných neoplastických buněk v celé hloubce epitelu. Rozlišujeme CIN1, kdy se jedná o dobře diferencované léze či lehké dysplázie a buňky se nacházejí ve spodní první třetině epitelu. CIN1 přechází přes méně diferencované stádium CIN2 (střední dysplázie) s buňkami vyskytujícími se v hloubce do dvou třetin epitelu. Další změny vedou ke vzniku nediferencovaných intraepiteliálních lézí (klasická těžká dysplázie/karcinom in situ), kdy buňky přesahují téměř až na povrch epitelu. Pokud se pozměněné buňky nacházejí v celé hloubce epitelu, jedná se o diagnózu CIS (carcinoma in situ) nebo CIN3/CIS (Obrázek č. 7). Histologické kategorie jsou označovány jako cervikální intraepiteliální neoplázie CIN (CIN1-CIN3) (tabulka č. 1). Cytologickému nálezu pak odpovídá dlaždicová intraepiteliální léze (SIL, z angl. Squamuous intraepitelial lesion), která se dělí na lehkou 9

(L-SIL) a těžkou (H-SIL) formu. Cytologicky může být nález normální, atypický v dlaždicových buňkách (ASCUS nebo ASC-H), atypický nález v žlaznatých bunkách (AGC- NOS anebo AGC-NEO), léze nižšího (L-SIL) nebo vyššího stupně (H-SIL) nebo suspektní karcinom. histologie CIN1, Condyloma accuminata CIN2, CIN3, CIS cytologie L-SIL H-SIL Tabulka č. 1. Histologické a cytologické kategorie prekancerózních lézí děložního hrdla (CIN1, CIN2, CIN3) a karcinomu in situ (CIS). Genitální bradavice patří do kategorie L-SIL. Obrázek č. 7. Progrese nezhoubné léze v invazivní karcinom děložního hrdla. Infekce onkogenními typy HPV může vyvolat nezhoubnou kondylomovou lézi, low-grade dysplázii nebo někdy až high-grade lézi. Karcinom in situ vzniká zřídka v důsledku působení dvou virových onkogenů E6 a E7, integrací HPV do genomu hostitele a celou řadou genetických a epigenetických změn v genech buňky (Kiššová, 2011). V současné době se k popisu a klasifikaci lézí a karcinomů děložního hrdla, podle velikosti a rozsahu poškození okolních tkání, využívají TNM a FIGO (Federation of 10

gynecology and obstetrics) klasifikace (tabulka č. 2). T značí rozsah primárního nádoru, N označuje přítomnost či nepřítomnost a rozsah metastáz v regionálních uzlinách a M charakterizuje přítomnost/nepřítomnost vzdálených metastáz. Tabulka č. 2. Klasifikace TNM a FIGO zhoubných nádorů děložního hrdla (zdroj Mouková, 2013). 1.5 Příznaky rakoviny děložního hrdla a jejich diagnostika Přednádorové změny, které vedou ke vzniku karcinomu děložního hrdla, se neprojevují žádnými příznaky, proto je důležité, aby ženy pravidelně docházely na gynekologická vyšetření, kde je provedena cytologická analýza buněk děložního hrdla. V pozdějších stádiích, pokud je již nádor rozvinut, se může projevit bolestmi v podbřišku, bolestmi při pohlavním styku, krvácením po pohlavním styku, změněným či zapáchajícím výtokem z pochvy, krvácením mimo menstruační cyklus či obtížemi při močení. Karcinom děložního hrdla je jedním z nejsnadněji preventabilních nádorových onemocnění. Metody, kterými lékaři vyšetřují oblast děložního hrdla, prošly od doby zavedení Pap testu v roce 1941 zásadními změnami. V období mezi roky 1955 a 80. lety 20. století poklesla incidence karcinomu děložního hrdla zhruba o 74 % a to zejména díky postupnému zavedení Pap testu v běžné praxi. Další pozorovatelný pokles nově diagnostikovaných případů je připisován zavedení tzv. cytologie na tenké vrstvě (LBC) 11

(Randall K. Gibb; 2011). V následujících odstavcích jsou popsány metody vyšetření děložního hrdla. 1.5.1 Papanicolaoův test Papanicolaoův test patří mezi standardní metody vyšetření děložního hrdla. Jedná se o setření povrchu děložního hrdla speciálním štětečkem a následné rozetření stěru na podložní sklo (Papanicolaou a Traut, 1941). Pap stěry by se měly provádět alespoň jednou ročně u dívek od 18 let nebo od započetí pohlavního života dívek. S ohledem na cytologické výsledky testu pak může lékař upravit frekvenci, se kterou se bude test u pacientek provádět. Při abnormálním nálezu Pap stěrů se doporučuje sledovat pacientky alespoň jednou za 6 měsíců, zda nedošlo k progresi onemocnění. 1.5.2 Metoda cytologie na tenké vrstvě Další metodou, která je v dnešní době dostupná k cytologickému vyšetření, je tzv. cytologie na tenké vrstvě (LBC - liquid based cytology). Tato metoda je založena na odebrání stěrů z oblasti děložního hrdla kartáčkem, stejně jako u Pap testu. Kartáček je následně vložen do lahvičky se speciálním médiem Turbitec kit. Tato směs buněk a média je v centrifuze nastřelena na podložní sklo ve velmi tenké vrstvě. Nastřelení buněk v médiu na podložní skla zajistí rovnoměrné rozprostření buněk na skle. V případě hustého či málo hustého nástřelu jsme schopni při dalším nastřelování buněk hustotu optimalizovat na požadovanou hustotu buněk na skle. Možnost optimalizace přináší velkou výhodu pro hodnocení preparátů metodou FISH oproti hodnocení klasických stěrů z oblasti endocervixu a exocervixu, které jsou ve většině případů příliš husté a obsahují velké množství hlenu a zbytkové tkáně. Právě tyto artefakty značně znesnadňují mikroskopické hodnocení preparátů. Jednou z nevýhod této metody je neschopnost analyzovat zvlášť buňky pocházející z endocervixu a exocervixu. Smícháním stěrů s médiem vzniká heterogenní směs obsahující jak buňky endocervixu, tak buňky exocervixu. 1.5.3 Další metody vyšetření děložního hrdla Mezi další metody patří testovaní přítomnosti HPV a určení druhu infekce v buňkách děložního hrdla. U žen infikovaných HPV může být nález Pap stěrů abnormální, což může 12

značit některé ze stádií prekancerózních lézí. Pro potvrzení, zda jsou změny děložního hrdla asociované s infekcí HPV, může být proveden DNA test k detekci virové DNA u žen s abnormálním nálezem. HPV DNA test zjišťuje přítomnost nejčastějších vysoce rizikových HPV druhů, jeho nevýhodou je, že při analýze není určován přesný typ HPV. Jako další z doplňkových vyšetření se používá kolposkopie. Jedná se o jednoduchou metodu, kdy se oblast děložního hrdla potře roztokem kyseliny octové a pomocí zvětšovacího nástroje se provede důkladná kontrola atypických změn (Nelson et al., 1984). Někdy může být provedena tzv. Schillerova zkouška, kdy se děložní hrdlo potře roztokem jódu. Normální buňky se v důsledku působení jódu zbarví hnědě, zatímco abnormální buňky zůstanou v důsledku nízkého obsahu glykogenu bílé nebo žluté. V závažnějších případech, zejména u stádií CIN2 a CIN3 je třeba odstranit maligní tkáň. K tomu je potřeba využít invazivních metod. Zde přichází na řadu kolposkopicky řízená biopsie, tzv. konizace děložního hrdla, kdy je ostrým nožem odebrán abnormální kousek tkáně z oblasti děložního hrdla. Tato metoda umožňuje spolehlivě určit, zda jsou abnormální buňky rakovinné, prekancerózní či změněné z jiného důvodu. 1.6 Prevence karcinomu děložního hrdla Nejúčinnější prevencí je snaha vyvarovat se všech rizikových faktorů a pravidelná gynekologická vyšetření. Vhodné je provádět vyšetření každého půl roku, nejpozději v intervalu jednoho roku. Gynekolog provádí standardně stěr buněk z děložního hrdla Pap stěr, který se posílá na cytologické vyšetření. Mezi způsoby, jak se vyhnout přenosu viru HPV, patří sexuální abstinence, ačkoli ani ta nezajistí 100% ochranu proti přenosu viru, který se přenáší nejen pohlavním stykem, ale také z rukou či úst na pohlavní orgány. Ani používání kondomu nelze označit jako dostatečně efektivní a 100% účinnou metodu, protože i při pohlavním styku s kondomem dochází ke kontaktu nezakrytých částí a genitálních oblastí. Jednou z metod, která je v současnosti hlavním pilířem primární prevence proti infekci viry HPV, je očkování. V České republice jsou v současné době dostupné dvě komerčně vyráběné vakcíny, a to vakcíny značky Cervarix a Silgard. Tyto vakcíny se liší pouze typy HPV, proti kterým bude očkovaná žena chráněna. V případě vakcíny Cervarix se jedná o HPV typy 16 a 18 a některé další vysoce rizikové typy, které nejsou firmou blíže specifikovány. U vakcíny Silgard jde o 4 typy HPV 6, 11, 16 a 18 a je určena dívkám 13

a ženám od 9 do 45 let. Obě z vakcín jsou podávány ve 3 dávkách a nejúčinnější jsou u žen, které ještě nejsou sexuálně aktivní nebo které ještě nepřišly do kontaktu s typy HPV, proti kterým je vakcína cílena. 1.7 Léčba karcinomu děložního hrdla a možné komplikace Pomocí pap screeningu jsou lékaři schopni odhalit většinu prekancerózních změn včas, již ve stádiu prvotních lézí, kdy jsou v epitelu děložního hrdla přítomné abnormální buňky. Pokud lékař při Pap stěru zachytí již pokročilá stádia CIN, přichází na řadu terapie, která je v první řadě chirurgická, následovaná radiologickou léčbou. S pokročilými stádii prekanceróz přicházejí většinou ženy, které nikdy nebyly na gynekologické prohlídce, nechodí na pravidelné gynekologické vyšetření či vyšetření z nějakého důvodu odkládají. Konizace děložního hrdla s následnou plastikou hrdla se volí u méně invazivních karcinomů a prekancerózních lézí a patří mezi nejefektivnější způsob léčby, který navíc nemá vliv na plodnost ženy. Při konizaci dochází k odstranění abnormální tkáně a časti okolní zdravé tkáně, aby se předešlo případnému dalšímu šíření abnormálních buněk. V případě, že se již nádor nachází v pokročilém, ale stále operabilním stádiu, tj. do stádia IIA, je většinou nutno přistoupit k úplnému odstranění dělohy a části pochvy (hysterektomie), které se provádí laparoskopicky, se současným zachováním nebo odnětím vaječníků. Obvykle jsou při tomto zákroku odebírány také pánevní mízní uzliny. Podle histologického nálezu mízních uzlin může být dále nutné ozařování pánve nebo chemoterapie, které slouží jako tzv. záchytná léčba. U stádií, která již není možno chirurgicky odstranit a která již metastazovala a často jsou prorostlá do okolních tkání, tj. stádium IIB a vyšší, je pacietka léčena pomocí radiologické léčby a chemoterapie. Zatímco pokročilá stádia, již vyoperovat nelze a v tomto případě se volí léčba ozařováním. U neléčených karcinomů dochází velmi často k metastazování, zejména pak cestou lymfatických uzlin. Pokud není karcinom léčen, případně je-li objeven velmi pozdě, ve stádiu vyšší diferenciace ( vyzrálosti ) jsou komplikacemi záněty malé pánve, pyelonefritida (zánět ledvinné pánvičky) či uzávěr močových cest (zdroj http://www.cdc.gov/hpv/). 14

2 Lidské papilomaviry Z anglického Human papillomavirus (HPV) lidský papilomavirus. HPV patří do samostatné čeledi Papilomaviridae. Dříve byly papilomaviry řazeny spolu s polyomaviry do čeledi Papovaviridae. Dnes jsou již na základě zásadních odlišností genomů obou rodů papilomaviry podle ICTV (International Committee on the Taxonomy of Viruses mezinárodní komise pro taxonomii virů) uznány jako samostatná čeleď Papilomaviridae, nepříbuzné polyomavirům a SV40. HPV jsou malé neobalené dsdna viry o velikosti asi 52-55 nm. Ikosahedrální kapsid je tvořen 72 (12 pentamerickými a 60 hexamerickými) kapsomerami. Při vizualizaci elektronovým mikroskopem virus připomíná golfový míček (Obrázek č. 8). Papilomaviry obecně jsou druhově i tkáňově specifické. Infikují širokou skupinu organizmů od ptáků po savce včetně člověka. Vykazují se afinitou ke kůži, sliznici či oběma zmíněným. Obrázek č. 8. Lidský papilomavirus (zdroj www.gynae-screen.com, www.womenshealthency.com). 2.1 Onkogenní potenciál lidských papilomavirů Lidské papilomaviry napadají především kůži a epitely sliznic. Podle onkogenního potenciálu, kterým jednotlivé typy HPV disponují, je dělíme na tzv. high-risk HPV (typ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) a low-risk HPV (typ 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 70, 72, 74, 81). Typy 26, 53 a 66 jsou pravděpodobně také hrhpv, ale zatím nebylo získáno dostatečné množství dat, která by to průkazně popsala (Muñoz et al., 2003). Na vzniku 15

karcinomu se v cca 70 % podílejí typy HPV 16 a HPV 18 (Khan et al., 2005). V průběhu života se alespoň jedním typem HPV nakazí až 75 % sexuálně aktivních žen (Cates, 1999). High-risk HPV vyvolávají nejen přednádorové a nádorové změny v oblasti děložního hrdla, ale je také prokázán podíl v 50 % na vzniku karcinomu vulvy, pochvy a penisu, v 85-90 % karcinomu konečníku a ve 20 % na vzniku karcinomu orofaryngeální oblasti. Některé low-risk HPV (typ 6 a 11) pak vedou ke vzniku bradavic (condylomata accuminata) v oblasti genitálií a análního otvoru a v orofaryngeální oblasti s incidencí 200-400 postižených na 100 000 obyvatel. Bylo prokázáno, že všechny typy HPV jsou schopny vyvolat v buňkách maligní transformaci již při nízkých dávkách viru (zur Hausen, 1996). 2.2 Genom papilomavirů Všechny papilomaviry obsahují ve svém jádře cirkulární dvouvláknovou DNA, která je o velikosti asi 7,9 kilobazí a je asociovaná s histony. Genom může být rozdělen do 3 hlavních oblastí: časné, pozdní a nekódující oblasti. Oblasti jsou od sebe odděleny dvěmi polyadenylačními sekvencemi. Časná oblast genomu papilomavirů zaujímá asi 50 % celkového genomu a kóduje 6 otevřených čtecích rámců (proteiny E1,E2 a E4-E7). Nové studie prokázaly, že genom HPV virů je uspořádán ve formě velice podobné strukturám s chromatinovým uspořádáním, které jsou tvořeny nukleoproteinovými komplexy (nukleozomy) propojenými s DNA filamenty. (Del Mar Pena et al., 2001). Virový gen E1 kóduje DNA-dependentní ATPázu a funguje také jako ATPdependentní helikáza - enzym, který zajišťuje rozvolnění virové DNA a působí jako elongační faktor při replikaci DNA. Gen E2 kóduje protein, který je zodpovědný za rozpoznání počátku replikace, na který se váže. Protein existuje ve dvou formách protein o plné délce funguje jako transkripční transaktivátor a jeho zkrácená forma jako transkripční represor. Gen E4 kóduje protein, který se svým C-terminálním koncem váže na intermediární filamenta a umožňuje uvolnění virus-like partikulí. Protein kódovaný genem E5 se účastní narušení růst suprimujících mechanismů buňky např. aktivací mitogenních signálních drah transkripčními faktory (c-jun a c-fos) (Chen et al., 1996). Protein E5 také inaktivuje protein p21. Proteiny E6 a E7 jsou transformující virové proteiny, o kterých je blíže pojednáno v další subkapitole. 16

Gen L1 kóduje hlavní majoritní kapsidový protein a gen L2 kóduje minoritní kapsidový protein, který pravděpodobně funguje jako DNA sbalovací protein (Obrázek č. 9). Obrázek č. 9. Genom lidského papillomaviru (zdroj www.microbiologybytes.com). Papilomaviry se replikují a sestavují výhradně v jádře. Viry infikují keratinocyty v bazálních vrstvách dlaždicového epitelu. Exprese virových genů a replikace postupují způsobem, který je těsně vázán a regulován diferenciací samotných keratinocytů (Bedell et al., 1991). Mechanismus, jakým diferenciace reguluje expresi virových genů, není zatím zcela přesně znám, ale je obecně uznávaným faktem, že exprese genů viru vede k produkci 6 nestrukturních virových regulačních proteinů E1, E2, E4, E5, E6 a E7) v nediferencovaných nebo středně diferencovaných keratinocytech. Proteiny E1, E2 a E4-E7 se nacházejí v úseku tzv. časných genů virového genomu. Dva strukturní kapsidové proteiny L1 a L2 kódované v oblasti pozdních genů genomu podstupují v keratinocytech terminální diferenciaci. Kromě těchto genů obsahuje genom viru nekódující oblast (synonymně upstream regulatory region - URR), ve které se nacházejí regulační sekvence. Exprese proteinu E4 přetrvává v terminálně diferencovaných buňkách. Proteiny E1 a E2 se podílejí na replikaci DNA a regulují časnou fázi transkripce. Protein E4, který je exprimován při produktivní 17

infekci buněk je asociován s rozpadem cytokeratinových filament. Proteiny E5, E6 a E7 jsou virové onkogeny a jejich exprese indukuje transformaci buňky a její nesmrtelnost. 2.2.1 Virové proteiny E6 a E7 Protein E6 interaguje s proteinem p53, který reguluje buněčný cyklus v kontrolních bodech G1 a G2 a kontroluje přechod buňky do apoptické dráhy jako reakci na signály různého druhu stresu (Werness et al., 1990). Vazba proteinu E6 na p53 označí tento protein pro degradaci ubikvitin-dependentní proteolýzou, a tím způsobí ztrátu kontroly buněčné proliferace a destabilizaci genomu (Scheffner et al., 1990). V souvislosti s proteinem E6 bylo popsáno nejen potlačení apoptózy, ale také vazba a deaktivace proapoptických proteinů Bax (Li a Dou, 2000) a Bak (Thomas a Banks, 1998). Gen E7 kóduje druhý onkoprotein, který je schopen vázat se na další důležitý buněčný regulátor - protein prb. Protein prb působí jako negativní regulátor buněčného cyklu a vazbou na transkripční faktory E2F rodiny zabraňuje buňce vstoupit do S-fáze, a reguluje tak buněčnou proliferaci. Virový onkoprotein E7 se váže na prb namísto E2F, a pokud je prb inhibován vazbou s E7 proteinem, není schopen v defosforylovaném stavu vázat, a tím inaktivovat buněčný transkripční faktor E2F, což má za následek opět ztrátu kontroly buněčné proliferace. Nezávisle na přítomnosti růstových faktorů tato vazba E7 na prb vede k expresi proteinů nezbytných k replikaci DNA. Protein prb je aktivní v hypofosforylovaném stavu a funguje jako tumor supresorový protein inhibicí postupu buněčného cyklu. Protein prb je inaktivován fosforylací. Při vstupu do S-fáze je prb fosforylován komplexy cyklinů/cyklin dependentních kináz a tím inaktivován. Počáteční fosforylace je provedena komplexem Cyklin D/CDK4/CDK6 a je následovaná fosforylací CyklinE/CDK2 komplexem. prb zůstává fosforylován v průběhu S, G2 a M-fáze. Protein E7 je schopný vázat se také na některé histonové deacetylázy a inhibitory cyklin-dependentních kináz p21 a p27 (Funk et al., 1997). 2.3 Průběh infekce lidskými papilomaviry Lidské papilomaviry (HPV) napadají bazální vrstvy epitelů sliznic a pokožky, nejčastěji v oblasti, kde přechází sliznice v kůži nebo v oblasti styku různých typů sliznic. Nejvnímavější k infekci je oblast přechodu dlaždicového a cylindrického epitelu (hrdlo děložní, řiť, hrtan). Virus infikuje nezralé buňky těchto epitelů, do kterých proniká přes 18

miniaturní poranění či přímým kontaktem v oblasti transformační zóny děložního hrdla. K přenosu HPV dochází zejména při pohlavním styku, dále pak přenosem z rukou a úst na pohlavní orgány a také při porodu z matky na dítě, kdy velmi zřídka, s incidencí 2 : 100 000 narozených dětí, mohou zejména typy HPV 6 a 11 způsobovat u novorozenců respirační papilomatózu s brzkým nástupem (Sinal et al., 2005). Infekce většiny dosud známých typů HPV je nejčastěji asymptomatická (až u 90 % infikovaných žen) a velmi rychle se v organismu šíří. Virus tak přetrvává v organismu, aniž by způsoboval patologické změny. Právě v těchto případech hrozí zvýšené riziko vzniku CIN a další progrese v maligní stádia. Při dobrém stavu imunitního systému napadeného jedince je virus z organismu zcela eliminován, zpravidla během několika měsíců, nejpozději však do dvou let od vzniku infekce (Trimble et al., 2005). Při oslabení imunitního systému hostitele se HPV integruje do jeho genomu, což je klíčový krok, při kterém se spustí řada reakcí vedoucích u 10 % žen k dysplázii buněk a přednádorovým a nádorovým změnám keratinocytů. U méně než 1 % postižených žen se vyvine karcinom in situ (CIS) a u méně než 0,2 % se vyvine invazivní cervikální karcinom (Doorbar, J., 2004). Během počátečních fází infekce se virová DNA nachází v bazální vrstvě vrstevnatého epitelu v podobě epizomů v počtu 50 až 100 kopií na buňku a replikuje se synchronně spolu s replikací hostitelské buňky. Spolu s diferenciací buňek se genom viru amplifikuje až do tisícovek kopií na buňku. Časné transkripty jsou exprimovány z promotoru, který leží upstream od E6, jsou polycistronní a kódují množství virových proteinů, včetně E1, E2, E6 a E7. Časný promotor je regulován sekvencemi ležícími v nekódující upstream regulační oblasti (URR upstream regulatory region), která nese počátek replikace viru, ale také vazebná místa pro virové i buněčné proteiny. Amplifikace virové DNA, exprese pozdních genů a produkce virionů jsou indukovány v suprabazálních buňkách, které znovu vstoupily do S - fáze. Normální buňky procházejí buněčným cyklem spolu s diferenciací, kterou je jejich buněčný cyklus v terminálním stádiu ukončen, zatímco buňky infikované HPV jsou schopné překonávat kontrolní body buněčného cyklu a znovu vstupovat do S-fáze a tím si zachovávat aktivitu po celou dobu buněčného cyklu, což jim umožňuje syntetizovat buněčné proteiny nezbytné k replikaci své DNA. Banerjee et al. (2011) při studiu viru HPV v lidských diferencovaných keratinocytech popsali, že virový protein E7 indukuju prodlouženou G2 fázi, následovanou znovu vstoupením do S- fáze (Banerjee et al., 2011). 19

Infekce děložního hrdla virem HPV se může klinicky manifestovat třemi způsoby. Prvním z nich je produktivní infekce, která vede k produkci virionů. Exprese virových genů je striktně spojená s diferenciací buněk hostitele. Druhou možností je latentní (asymptomatická) infekce, která je charakteristická přítomností virového genomu pouze v bazální vrstvě buněk a která se rozvine během prvních 3 měsíců nebo zůstane neodhalena po dobu několika let (Muñoz et al., 2003). Třetím typem je infekce abortivní. Ta je spojena s konkrétními hrhpv genotypy a rozvíjí se hlavně v místech, která nejsou vhodná pro produktivní infekci. Přechod mezi produktivní a abortivní infekcí je podmíněn deregulací exprese genů E6 a E7 v proliferujících buňkách. Proteiny E6 a E7 jsou virové onkogeny, které inaktivují proteiny p53 a prb tumor supresorové proteiny. Deregulace exprese těchto dvou onkogenů se projevuje chromozomovou nestabilitou a akumulací mutací. Proteiny E6 a E7 jsou exprimovány způsobem děravého skenování z bicistronní mrna a jsou pod regulací časného promotoru p97 (Stacey et al., 2000). Moody et al. se ve své práci zaměřili na keratinocyty, které obsahují chemické inhibitory a HPV-31 v epizomálním stavu. Studiem těchto nediferencovaných keratinocytů prokázal, že virové proteiny aktivují tzv. ATM (ataxia-telangiectasia mutated) odpověď na poškození (ATM damage pathway) v diferencujících se buňkách. Prokázal to díky fosforylaci některých genů CHK2, BRCA1, NBS1. Aktivace právě těchto genů je potřebná k amplifikaci genomové DNA viru a také k formaci ložiska pro replikaci viru. 20

3 Chromozomové abnormality u cervikálních intraepiteliánílch neoplázií a karcinomu děložního hrdla a jejich význam Kancerogeneze je vícestupňový proces spojený s akumulací genetických mutací a epigenetických změn v buňkách, které se stávají při každém dalším dělení stále odolnější vůči obranným mechanizmům organismu. Aby takovéto změny mohly v buňkách vznikat a stabilně se udržet, je nutnou podmínkou velká genomová nestabilita. Mezi šest základních vlastností, které platí obecně pro vznik všech typů nádorů, patří: soběstačnost nádorových buněk v produkci růstových signálů (např. aktivace K-ras) necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus (ztráta prb, p53) poškození apoptózy (produkce IGF) neomezený replikační potenciál buňky (aktivace telomerázy) posílení angiogeneze (produkce VEGF) tvorba metastáz (inaktivace E-kadherinu) (Hanahan a Weinberg, 2000). Podobně jako u většiny solidních nádorů se i u karcinomu děložního hrdla setkáváme se specifickými chromozomovými abnormalitami, které mohou způsobovat deregulaci genové exprese a iniciovat tak vznik a vývoj nádorů. S progresí lehčích dysplázií do dalších stádií a karcinomu jsou asociovány zejména amplifikace protoonkogenu MYCC (8q24) a genu pro lidskou telomerázu hterc (3q26). 3.1 Amplifikace genu hterc Gen hterc kóduje RNA podjednotku lidské telomerázy a nachází se na 3. chromozomu v oblasti 3q26. Telomeráza je ribonukleoproteinový komplex, který syntetizuje a zachovává telomerickou DNA přidáváním jednotlivých repetic k 3 konci existující jednořetězcové telomerické DNA. Telomerázová aktivita byla detekována ve více než 85 % lidských tumorů, zatímco ve zdravých lidských buňkách je její aktivita téměř nedetekovatelná či je přítomna pouze v nízké hladině (Kim et al., 1994). Proteinové složení lidské telomerázy bylo objeveno v roce 2007 Scottem Cohenem a jeho týmem v Children s Medical Institute v Austrálii. (Cohen et al., 2007). Amplifikace genu hterc je dnes již dobře popsaným markerem, který může předurčovat stádium prekanceróz a možné riziko jejich progrese. 21

V průběhu uplynulých let bylo opakovaně prokázáno, že amplifikace genu hterc je klíčovým faktorem vedoucím k progresi z nižších stádií prekanceróz (CIN1/CIN2) do vyšších (CIN3) a dále v invazivní karcinom. V roce 1996 bylo skupinou Heselmeyer et al. prokázáno, že zvyšování počtu kopií, zejména pak genu hterc na 3. chromozomu, vede postupně k přechodu normálního epitelu děložního hrdla v karcinom děložního hrdla. V roce 1997 Heselmeyer et al. prokázali specifické rekurentní chromozomové aberace u pokročilých stádií karcinomu, zejména pak zisky dlouhého raménka chromozomu 3 (3q), které byly detekovány u asi 77 % všech případů karcinomu děložního hrdla (Heselmeyer et al., 1997). Heselmeyer-Haddad et al. v roce 2005 detekovali buňky pozitivní na amplifikaci oblasti 3q, které se nacházely blízko sebe. Tento fakt poukazuje na zásah během vzniku karcinomu, který buňkám propůjčil růstovou výhodu. Extra kopie oblasti 3q pak propůjčuje buňkám možnost velké klonální expanze, což následně vyústí v populaci buněk karcinomu, kdy je většina buněk pozitivní na amplifikaci 3q. Na vznik karcinomu klonální expanzí buněk s extra kopiemi oblasti 3q rovněž poukazují výsledky hybridizace in situ pozorované u stádií CIN3 a jejich CIN1/2 prekurzorů. Některé získané chromozomové aberace, které jsou v průběhu buněčných dělení v buňkách stabilně udržovány v průběhu tumorigeneze, mohou být nalezeny jak v prekurzorových buňkách stádia CIN1/CIN2, tak i ve stádiu CIN3 a karcinomu. Tento fakt nasvědčuje tomu, že se buňky ve stádiích CIN1/CIN2 nekontrolovaně klonálně množí a dávají vznik větším útvarům, ze kterých v konečném důsledku může vzniknout karcinom. V této studii také zjistili, že existuje silná korelace mezi přítomností extra kopií oblasti 3q a cytologickou progresí CIN v karcinom a mezi absencí zisků kopií oblasti 3q a regresí stádií CIN (Heselmeyer-Haddad et al., 2005). V mnoha dalších studiích pak bylo potvrzeno, že míra amplifikace genu hterc vykazuje rostoucí trend s progresí lehčích dysplázií v karcinom (Kirchhoff et al., 1999; Allen et al., 2000; Yang et al., 2001). V současných studích například Jin et al. (2011) prokázali amplifikaci genu hterc u 18,2 % vzorků ve stádiu CIN1, u 66,7 % vzorků ve stádiu CIN2, u 84,6 % vzorků ve stádiu CIN3 a ve 100 % vzorků dlaždicobuněčného karcinomu (SCC) (Jin et al., 2011). Podobně Chen et al. v roce 2012 detekovali pomocí metody FISH amplifikaci genu hterc u 9,2 % vzorků ve stádiu CIN 1, u 17,2 % vzorků ve stadiu CIN2, u 76,2 % vzorků ve stádiu CIN3 a ve 100 % případů u SCC (Chen et al., 2012). Nejen z výše uvedených studií, ale i mnoha dalších prací, je zřejmé, že míra amplifikace genu hterc úzce koreluje se stádii 22

prekancerozních lézí, a proto by se stanovení amplifikace tohoto genu mohlo stát užitečným markerem k predikci progrese cervikálních lézí v invazivní karcinom. 3.2 Amplifikace genu MYCC Gen MYCC patří do rodiny myc onkogenů. Amplifikace a zvýšená exprese buněčných protoonkogenů ze skupiny myc genů je jednou z nejčastěji pozorovaných genetických změn u většiny solidních nádorů (Adhikari a Eilers, 2005). Amplifikace genu MYCC byla detekována také u preinvazivních cervikálních intraepiteliálních lézí (Golijow et al., 2001). Zvýšená exprese těchto genů vede k neregulované buněčné proliferaci. Například amplifikace genu MYCN (2p24.3) je často pozorovaným jevem u dětského nádoru neuroblastomu (Schwab et al., 1983). Protoonkogen MYCC, který leží v oblasti 8q24, kóduje transkripční faktor, který spolu s dalšími buněčnými proteiny reguluje buněčnou proliferaci a diferenciaci. Jako transkripční faktor se MYC váže mimo jiné na promotor genu htert, který nese vícero vazebných míst pro MYC. Amplifikace MYCC je s velkou pravděpodobností zodpovědná za přeměnu buněk v buňky neomezeně se dělící. Dochází k tomu přímou aktivací transkripce genu TERT transkripčním faktorem c-myc (Wu et al., 1999). Peter et al. (2006) prokázali, že aktivace MYCC je spojena s integrací virového genomu do lokusu MYC. Couturier et al. (1991) ve své studii identifikovali, že ve vzorcích tumorů byl ve 3 ze 4 případů protoonkogen (MYCC) lokalizovaný poblíž místa začlenění virového genomu strukturně pozměněný nebo over exprimovaný. U jednoho tumoru detekovali místo integrace viru v oblasti 2p24, kde se nachází gen MYCN. Integrace virového genomu do genomu epiteliálních buněk představuje jeden z klíčových kroků v kancerogenezi karcinomu děložního hrdla. Proto bylo provedeno cytogenetické mapování míst, ve kterých dochází k integraci HPV do genomu hostitelské buňky. Předpokládalo se, že k integraci HPV dochází přednostně v oblastech spojených s velkou genomovou nestabilitou, tzv. častých fragilních místech na chromozomech - CFS (common fragile sites). CSF jsou oblasti o velikosti několika stovek kilobází až po cca 9 Mbp (Richards, R. I., 2001). Tým Yu et al. analyzovali v roce 2005 místa integrace genomů HPV-16 a HPV-18, při kterém popsali, že k integraci dochází ve 48 % (HPV16) a v 63 % (HPV18) ve známých fragilních místech na chromozomech. Odhalili také, že v těchto fragilních místech je integrace 23

virového genomu velmi často spojena s velkými chromozomovými změnami, a to především s delecemi až několika stovek kilobazí. Dále bylo popsáno skupinou Ferber et al., že až k 30 % integrací HPV18 docházelo v oblasti 8q24.2, kde leží MYCC onkogen. Tato oblast je lemována dvěma fragilními místy, a to FRA8C (8q24.1) a FRA8D (8q24.3) (Ferber et al., 2003a). Autoři také identifikovali dvě místa integrace HPV18 a jednu oblast integrace HPV16 v oblasti promotoru genu TERT, které neleží v žádné z fragilních oblastí (Ferber et al., 2003b). Z těchto výsledků lze usoudit, že musí existovat nějaký důvod, proč k integraci virových genomů dochází právě v místech, jako jsou oblasti onkogenů či promotorů některých genů. Tyto geny se pravděpodobně nějakým způsobem podílejí na vzniku karcinomu děložního hrdla. U invazivního karcinomu děložního hrdla byla pozorována integrace HPV do chromozomových oblastí nesoucích myc geny. Gen MYCC je exprimován jak u prekancerózních stádií, tak v buňkách invazivního karcinomu, liší se pouze míra exprese v závislosti na stádiu karcinomu (Busmanis, 1998). Ve studii Golijow et al. (2001) bylo prokázáno, že existuje rozdíl v počtu kopií genu MYCC mezi stádii CIN 1, CIN2/CIN3/ CIS a tedy, že amplifikace genu MYCC není významná jen v procesu progrese samotného tumoru, ale už v buněčné transformaci u prekanceróz. Podobně Chen et al. zaznamenali amplifikaci genu MYCC ve 20,7 % u normálních buněk, v 31 % vzorků u CIN1, v 71,4 % vzorků u CIN2, 81,8 % vzorků u CIN3 a ve 100 % vzorků u SCC (Chen et al., 2011). Prognostický význam genu MYCC byl ověřován např. i u karcinomu prsu a plic, kde byla nalezena amplifikace MYCC asi u 20 % případů, která je spojena se špatnou prognózou (zdroj http://lem.ocol.cz/cs/info/gen-c-myc). Z uvedených studií lze vyvodit, že míra amplifikace genu MYCC se s progresí CIN v karcinom značně zvyšuje. U spinocelulárních karcinomů pak amplifikace genu MYCC byla detekována ve 100 % případů (Jin et al., 2011; Chen et al., 2012). 3.3 Další časté chromozomové změny Velká genetická nestabilita je charakteristickým znakem nádorových buněk. Chromozomová nestabilita může být jak na úrovni počtu chromozomů, tak na úrovni struktury chromozomů. Ačkoli je za hlavní příčinu vzniku karcinomu děložního hrdla považována infekce vysoce rizkovými typy HPV, není tato infekce sama o sobě postačujícím faktorem, který by vedl k maligní transformaci buněk a vzniku nádoru. Je obecně známým 24

faktem, že u rakovinných buněk může být detekováno velké množství aberací. V případě karcinomu děložního hrdla je jednoznačně nejčastější změnou amplifikace dlouhého raménka 3. chromozomu, která byla detekována s přechodem premaligních stádií cervikálních intraepiteliálních neoplázií v invazivní karcinom u 77 % aneuploidních tumorů děložního hrdla (Heselmeyer et al., 1997). Změny na úrovni genomu byly v minulosti analyzovány kromě metody interfázní FISH také metodou komparativní genomové hybridizace (CGH). Již v roce 1997 Heselmeyer et al. touto metodou detekovali zisky genetického materiálu u pokročilých stádií karcinomů ve vzorcích 30 pacientek. Nejčastěji byly zisky genetického materiálu detekovány na chromozomu 8, na chromozomových raménkách 3q, 5p, 8q, 12p, 14q, 17q, 19q, 20p a 20q, a v pruzích na chromozomech 3q26-27, 9p23-24, 11q22-23, a 12p13. Dále například Kirchhoff et al. detekovali pomocí této metody zisky 3q ve 35 % neinvazivních stádií oproti 72 % detekovaným u invazivního karcinomu. Nejčastější zisky genetického materiálu u invazivních karcinomů, které detekovali, byly v oblastech 1q (45%), 8q (41%), 15q (41%), 5p (34%) a Xq (34%) (Kirchhoff et al., 1999). Zdokonalením metody CGH zavedením metody komparativní genomové hybridizace na čipech (array-cgh) bylo dosaženo mnohem vyššího rozlišení, a je tak možné detekovat i změny o velikosti kilobazí na úrovni celého genomu. Rané studie také odhalily aneuploidní nebo polyploidní buňky v 50 % vzorků ve stádiu L-SIL a ve více než 90 % vzorků ve stádiu HSIL. Dále byly v těchto studiích implikovány abnormality na chromozomech 1, 3, 6, 7, 8, 11, 17, 20, X vyskytující se při vývoji H-SIL v invazivní karcinom (Heselmeyer et al., 1997). Vedle amplifikace genu hterc, která je tedy nejčastější změnou u tohoto typu nádoru, byly při studiích chromozomových aberací nalezeny ztráty genetického materiálu (delece) u stádia Ib SCC na chromozomech 3p, 11q, 6q a 10q (Allen et al., 2000). Další změny pozorované v pozdějších fázích spinocelulárního karcinomu jsou zisky kopií DNA sekvencí na chromozomech 1q, 5p, 6p a 20 (Heselmeyer et al., 1997). Ke ztrátám genetického materiálu dochází v pokročilých stádiích SCC nejčastěji v 2q, 3p, 4, 8p a 13q (Allen et al., 2000), přičemž adenokarcinomy vykazují v průměru nižší počet aberací než SCC (Wilting et al., 2006). Nejčastější změny u adenokarcinomů jsou zisky v oblastech 3q, 17q, 1 a 11q a delece oblastí 4q, 13q a 18q (Yang et al., 2001). 25

Změny, které jsou často detekovány s progresí CIN v karcinom, mohou být způsobeny pozitivní klonální selekcí maligních aberantních buněk. Například ve studii Oh et al. (2012) byly popsány změny v počtu kopií DNA sekvencí v oblastech 5q35.3 a 2q14.3 mezi stádii CIN1 a CIN2 a mezi stádii CIN2 a CIN3. Značné změny v počtu kopií DNA sekvencí mezi stádii CIN3 a SCC byly pozorovány též v oblastech 1q24.3, 3p14.2, 5q13.2, 7p15.3, 7q22.1 a 13q23.3 (Oh et al., 2012). Lee et al. (2012) porovnávali array-cgh profily mezi vzorky ve stádiích HSIL a vzorky ve stádiích SCC a identifikovali opakované zisky genetického materiálu v oblastech 11q12.3 a 2q24.1 u obou stádií. Zvýšené množství počtu kopií v oblastech 16p, 12p, 13 a 20q, 11q, 13 bylo detekováno pouze u vzorků ve stádiích HSIL. Bylo zjištěno, že geny pozměněné u vzorků ve stádiích SCC jsou spojeny s dráhami mitogen-aktivovaných protein kináz a RNA transportem. Geny vykazující zisky kopií DNA sekvencí ve vzorcích ve stádiu HSIL jsou spojené s ubikvitinem zprostředkovanou proteolýzou a adhezivními buněčnými molekulami (Lee et al., 2012). Analýza zaměřená na identifikaci kandidátních lokusů tumor supresorových genů na 4. chromozomu byla provedena týmem Singh et al. v roce 2007. Deleční mapování pomocí mikrosatelitních markerů odhalilo 6 oblastí vykazujících vysokou frekvenci delecí. Identifikované byly oblasti 4p16.2 (D1: 40 %), 4p15.31 (D2: 35-38 %), 4p15.2 (D3: 37-40 %), 4q22.2 (D4: 34 %), 4q34.2-34.3 (D5: 37-59 %), 4q35.1 (D6: 40-50 %). Byla sledována značná korelace mezi delecí v oblastech D1, D3, D5 a D6 s progresí karcinomu. Exprese kandidátního tumor supresorového genu SLIT2 lokalizovaného v oblasti D2 se postupně snižovala od vzorků s normálním epitelem až po vzorky s CIN a vzorky karcinomu. Hypermetylace promotoru genu SLIT2 byla sledována v 28 % CIN vzorků a její výskyt se zvyšoval s progresí tumoru. Současně byla zjištěna značná korelace mezi delecí genu SLIT2 a hypermetylací protoru tohoto genu, což pravděpodobně znamená, že každá z těchto událostí může přispívat a vést k inaktivaci SLIT2 genu. 26

4 Cíle diplomové práce Hlavním cílem předložené diplomové bylo přispět k objasnění úlohy amplifikace genů hterc (3q26) a MYCC (8q24) jako specifických cytogenetických markerů, které se podílejí se na vzniku a vývoji prekancerózních cervikálních intraepiteliálních dysplázií v invazivní karcinom děložního hrdla a analyzovat další chromozomové změny specifické pro tento karcinom. Dílčími cíli diplomové práce pak bylo: 1. Identifikovat buňky infikované HPV, analyzovat a vyšetřit v těchto buňkách vybrané cytogenetické markery (amplifikace genu hterc, amplifikace genu MYCC) u vzorků prekancerózních cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla, které byly získány od souboru pacientek MOÚ v Brně pomocí techniky FISH s využitím nově vyvinuté sondy Vysis Cervical FISH Probe. 2. Zhodnotit souvislosti mezi infekcí HPV, studovanými chromozomovými abnormalitami a lymfangioinvazí s cílem stratifikovat pacientky do jednotlivých rizikových poskupin. 27

5 Materiál a metody 5.1 Soubor vyšetřených pacientek Celkem bylo k 1.4.2013 přijato k vyšetření 123 pacientek z Masarykova onkologického ústavu v Brně. Z tohoto souboru bylo k výše uvedenému datu vyšetřeno molekulárně cytogenetickými metodami 108 pacientek. 5.2 Odběr a zpracování materiálu Materiál pro vyšetření metodou FISH a array-cgh byl odebírán na MOÚ oddělení gynekologické onkologie v letech 2011-2013. Jednotlivé vzorky byly získávány při gynekologických vyšetřeních či při radikálních gynekologických operacích vždy s podepsáním informovaného souhlasu pacientek. Metoda FISH byla prováděna na dvou typech odebíraného materiálu - nativních nátěrech a LBC (cytologie na tenké vrstvě) preparátech. 5.3 Metody detekce chromozomových abnormalit - Technika FISH Technika FISH je založena na hybridizaci fluorescenčně značené DNA sondy s cílovými místy na chromozomech na základě jejich komplementarity. Pomocí vhodných centromerických a genově specifických DNA sond lze s použitím fluorescenčního mikroskopu vyšetřovat specifické početní i strukturní chromozomové aberace v jednotlivých buňkách či v klonech nádorových buněk a to dokonce v úzké korelaci s morfologickou či imunologickou charakteristikou nádoru nebo zpětně z archivovaného patologického materiálu. 5.3.1 Zpracování nativních preparátů Po převzetí vzorků byla skla s nátěry endocervixu a exocervixu fixována po dobu 20 minut v ledovém metanolu při 4ºC a poté 20 minut v roztoku metanolu a kyseliny octové, připraveném v poměru 3:1, také o teplotě 4ºC. Fixované preparáty se nechaly na vzduchu uschnout a poté byly uloženy do mrazicího boxu, kde byly před finálním zpracováním uchovávány při teplotě -20 ºC. 28

5.3.2 Vysis Cervical FISH Probe Kit Pro vyšetření metodou FISH byla použita speciální sada od firmy Abbott/Vysis Vysis Cervical FISH Probe Kit. Tento kit umožňuje simultánní detekci změn počtu kopií genů MYCC a hterc a také současnou identifikaci buněk infikovaných virem HPV u cytologických vzorků děložního hrdla. Sondy pro detekci HPV jsou značeny biotinem a při jejich použití při in situ hybridizaci reagují s buňkami, které jsou infikovány vysoce rizikovými typy HPV. Sondy s úspěšností detekují následující typy HPV HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 66, HPV 68. Lokusově specifická sonda TERC (3q26) je značena fluorochromem SpectrumGold a pokrývá přibližně oblast o velikosti 495 kb, která obsahuje celý gen TERC. Lokusově specifická sonda MYC (8q24) je značena fluorochromem SpectrumRed a pokrývá přibližně oblast o velikosti 821 kb, která obsahuje celou sekvenci tohoto genu. Konstrukce sond pro detekci genu hterc a MYCC je zobrazena na obrázku č. 10. Obrázek č. 10. Konstrukce sondy Abbott/Vysis pro gen MYCC a hterc (zdroj www.abbottmolecular.com; http://www.abbottmolecular.com/static/cms_workspace/img/support/download_catalog/pdfs/emeai FISHcat alog2011b.pdf) 29

5.3.3 Protokol FISH 1) Dehydratace skel a) Po vyjmutí preparátů z mrazicího boxu dehydratovat skla alkoholovou řadou v kyvetách s etanolem o rostoucí koncentraci - 70 %, 80 % a 96 % při laboratorní teplotě po dvou minutách v každé kyvetě. b) Skla usušit pod větrákem. 2) Příprava vzorků a) Ponořit preparáty na 2 minuty do 2x SSC, ph 7 při 73 C. b) 10 minut inkubovat preparáty v roztoku pepsinu (0,5 mg/ml v 10 mm HCl) při 37 C pod parafilmem. c) Ponořit preparáty na 5 minut do 1x PBS při pokojové teplotě. d) V připraveném roztoku formaldehydu (12,5 ml 10% formalínu pufrovaného na neutrální ph, 37 ml 1x PBS a 0,5 ml 2M MgCl2) inkubovat preparáty 5 minut při pokojové teplotě. e) Ponořit preparáty na 5 minut do 1x PBS při pokojové teplotě. f) Dehydratovat preparáty v ethanolové řadě 70 %, 80 % a 96 % vždy po dobu 1 minuty a poté nechat oschnout pod větrákem. 3) Příprava sondy sondy, hybridizace a mytí a) Sondu promíchat na vortexu a centrifugovat. Nanést 10 µl sondy na krycí sklo 22x22 mm a přitisknout krycí sklo na cílovou oblast na podložním skle. Krycí sklo utěsnit pomocí rámovacího lepidla (Fixo gum). b) Kodenaturovat při 72 C po dobu 2 minut. c) Hybridizovat ve vlhké komůrce v termostatu při 37 C po dobu 16-24 hodin. d) Po hybridizaci ponořit preparáty na 2 minuty do 2x SSC při teplotě 48 C. e) Inkubovat preparáty v kyvetě typu Coplin s připraveným roztokem 3% peroxidu vodíku (zředit 30% peroxid vodíku pomocí 1x PBS v poměru 1:10) po dobu 25 minut při pokojové teplotě. f) Na 5 minut ponořit preparáty do 1x PBS při pokojové teplotě a ihned pokračovat ke kroku tyramidové amplifikace signálu pro vizualizaci HPV. 30

4) Tyramidová amplifikace signálu pro vizuailzaci sondy HPV a) Nanést 100 µl 1% blokovacího roztoku na každý preparát a přikrýt parafilmem o velikosti asi 24x30 mm. Inkubovat ve vlhké komůrce v termostatu při 37 C po dobu 25 minut. b) Odstranit parafilm, odstranit zbytek blokovacího roztoku osušením hran skla o ubrousek a ihned nanést 100 µl pracovního roztoku Streptavidin-HRP na každý preparát. Přikrýt kouskem parafilmu a inkubovat ve vlhké komůrce v termostatu při 37 C po dobu 25 minut. c) Po dokončení inkubace s roztokem Streptavidin-HRP odstranit parafilm a promýt preparáty 3x v 1x PBS po dobu 5 minut při 37 C. Osušit hrany preparátu poklepáním na papírový ubrousek tak, aby se odstranil zbytek PBS. d) Nanést 100 µl pracovního roztoku Alexa 488 Tyramide na každý preparát a přikrýt parafilmem. Inkubovat po dobu 10 minut ve vlhké komůrce při pokojové teplotě v temnu (např. v zásuvce). e) Odstranit parafilm a 3x promýt v 1x PBS po dobu 5 minut při 37 C. Osušit hrany preparátu poklepáním na papírový ubrousek tak, aby se odstranil zbytek PBS. 5) Barvení pozadí a) Na krycí sklo velikosti 24x24 mm nanést asi 10µl DAPI/Antifade a přitisknout na podložní sklo do místa nátěru. 6) Vizualizace fluorescence a) Preparáty hodnotit na fluorescenčním mikroskopu Olympus BX-61 při 100 - násobném zvětšení za použití imerzního oleje. 5.3.4 Zpracování LBC preparátů Do podstavce je umístěno podložní sklo a na něj nasazena ampulka, která je pomocí uzamykatelných svorek připevněna k podstavci. Do ampulky je napipetováno 1,5 ml fixativu a 500 µl směsi odebraného vzorku v roztoku Turbitec kit. Ampulky se vzorky jsou po čtyřech umístěny do centrifugy na 10 minut při 2000 otáčkách. Po dokončení centrifugace je zbylá tekutina odstraněna a podložní sklo se nechá na vzduchu oschnout. Buňky jsou na podložním skle nastřeleny v kruhu podle tvaru nasazené ampulky. Po oschnutí se preparáty fixují 20 minut v metanolu a 20 minut v roztoku metanolu a kyseliny octové, připraveném v poměru 31

3:1. Takto zfixované preparáty mohou být uschovány v mrazicím boxu před dalším zpracováním metodou FISH. Postup je zobrazen na obrázku č. 11 a č. 12. Obrázek č. 11. Postup při přípravě vzorků metodou LBC (převzato Kiššová, 2011). Obrázek č. 12. Centrifuga na 4 preparáty LBC, vpravo štěteček na odebírání vzorků z hrdla, fixační roztok Turbitec kit, do kterého je materiál umístěný, a nastřelené vzorky na podložním sklíčku (převzato Kiššová, 2011). 5.3.5 Hodnocení preparátů Amplifikace genu hterc a MYCC a HPV pozitivní buňky byly hodnoceny ve vzorcích exocervixu, endocervixu a vzorcích připravených metodou LBC. Všechny preparáty byly hodnoceny za použití fluorescenčního mikroskopu Olympus BX-61 spojeného s citlivou CCD kamerou Vosskuhler 1300D a jednotlivé preparáty byly snímány v programu Lucia Cytogenetics/FISH (Laboratory Imaging s.r.o., Praha, Česká republika). Fluorescence DNA sond byla detekována pomocí fluorescenčních filtrů SpectrumGreen (detekce HPV), SpectrumRed (MYCC) a spectrumgold (hterc). 32

Každý preparát byl hodnocem dvěmi pracovníky laboratoře a hodnoceno bylo vždy 100 HPV negativních buněk a všechny buňky HPV pozitivní. V těchto buňkách se hodnotila současně přítomnost a počty kopií signálů pro geny hterc a MYCC a pozitivita či negativita buněk k infekci virem HPV. Hodnoceny byly jak vzorky pacientek bez onkologického nálezu tak pacientky s prekancerózními stádii cervikálních intraepiteliálních neoplázií a pacientky s karcinomem. Výsledky těchto tří souborů jsou přehledně popsány v následující kapitole. Stanovení infekce buněk virem HPV bylo provedeno pomocí specifické sondy z výše zmíněného kitu, která hybridizovala k 15 typům nejrizikovějších HPV. Detekce sond HPV vyžaduje použití Tyramide Signal Amplification Kitu #22 s HRP-Streptavidinem a Fluor 488 tyramidem. Podle charakteru výsledného signálu je možné hodnotit stav DNA viru v buňce. Difúzní signál, kdy lze pozorovat celé zeleně zbarvené buňky, značí, že je virus v buňce přítomen v epizomálním stavu. Skvrnitý signál značí integrovaný charakter HPV (Obrázek č. 13). Skvrny v buňkách mohou být různě velké a vyskytují se v oblasti jádra. Abychom mohli s jistotou určit, že signál, který v buňkách můžeme pozorovat hybridizoval k DNA viru, je třeba ověřit, že se nachází v oblasti buněčného jádra. Tuto kontrolu provedeme obarvením buněk kontrastním barvivem DAPI a porovnáním lokalizace lokusově specifických signálů pro geny hterc a MYCC. Obrázek č. 13. Vlevo příklad buňky infikované virem HPV v epizomálním stavu. Vpravo buňka infikovaná HPV s virem integrovaným v genomu buňky (skvrnitý charakter). Pro stanovení počtu kopií genů hterc a MYCC byly použity sondy z komerčně dodávaného kitu firmy Abbott/Vysis - Vysis Cervical FISH Probe Kit. Hodnocena byla amplifikace genů hterc a MYCC ve vzorcích exocervixu, endocervixu a LBC vzorky. 33

Za negativní nález, tedy normální buňky bez amplifikací jednoho či druhého genu, byly považovány takové buňky, které měly v jádře dva červené (MYCC) a dva žluté (hterc) signály. Příklad negativní buňky bez chromozomových abnormalit je na obrázku č. 14. Obrázek č. 14. HPV negativní buňka, negativní na amplifikace genů - dva červené (MYCC) a dva žluté (hterc) fluorescenční signály. Za vzorek pozitivní na amplifikaci genu hterc nebo MYCC byl považován takový, ve kterém jsme detekovali počet buněk s amplifikací genu, který v poměru k celkovému počtu buněk přesahoval hodnotu cut-off (5,87 %). Hodnota cut-off pro stanovení pozitivity na danou amplifikaci byla experimentálně stanovena jako jeden z dílčích bodů diplomové práce Kiššové (Kiššová, 2011). Příklad pozitivní buňky k amplifikaci je na obrázku č. 15. Obrázek č. 15. HPV negativní buňka, pozitivní na amplifikaci MYCC (4 červené fluorescenční signály) a hterc (4 žluté fluorescenční signály). Za HPV pozitivní preparáty byly považovány takové, kde jsme detekovali alespoň dvě HPV pozitivní buňky na sklíčku. HPV negativní preparáty pak byly ty, kde jsme nalezli méně než 2 buňky na skle. Stejně jako u celkového hodnocení amplifikací, také při celkovém stanovení HPV pozitivity vzorků pacientek byly za HPV pozitivní považovány ty pacientky, 34

u kterých jsme detekovali HPV infikované buňky alespoň v jednom ze 3 preparátů. Ve vzorcích exocervixu a endocervixu byly vždy zkoumány všechny HPV pozitivní buňky přítomné na sklíčku. V případě LBC preparátu byla vždy mikroskopována jen poměrná část sklíčka, která byla vynásobena na celkový počet buněk na sklíčku. Toto je možné díky homogenitě vzorku, který byl připraven nastřelením na podložní sklíčko a který obsahuje buňky exocervixu a endocervixu. Na základě infekce buněk HPV viry a současné přítomnosti studovaných chromozomových aberací v analyzovaných vzorcích byly pacientky rozděleny do jednotlivých rizikových skupin. Přehledně je tato stratifikace popsána v tabulce č. 3. HPV-CHA- HPV+CHA- HPV-CHA+ HPV+CHA+ Low risk Medium risk High risk High risk Tabulka č. 3. Charakteristika rizikových skupin dle přítomnosti infekce HPV a chromozomových abnormalit. Nízké riziko lze předpokládat u buněk, u kterých nebyly nalezeny HPV infikované buňky a byly také negativní na amplifikaci obou genů (buňky HPV-CHA-). Následně byly ve vzorcích identifikovány tzv. single-pozitivní buňky. Ty je možno rozdělit na dva typy. U prvního typu se jedná o buňky, které jsou pozitivní na studované chromozomové aberace tj. pozitivní na amplifikaci alespoň jednoho genu hterc, MYCC nebo obou (HPV-CHA+). Pro tyto buňky existuje vysoké riziko progrese v karcinom. Pokud jsou nalezeny takovéto buňky, lze předpokládat, že se jedná o buňky již změněné maligní transformací v nádorové buňky, které dají následnou klonální expanzí vzniku karcinomu. V případě druhého typu se jedná o takové buňky, které jsou pozitivní na infekci HPV, ale nebyly u nich detekovány chromozomové aberace (HPV+ CHA-) (Obrázek č. 16). Pro tyto buňky existuje střední riziko progrese v karcinom. Může se jednat o buňky, které byly infikovány virem HPV a dojde u nich v budoucnu ke spontánní regresi infekce a virus z organizmu vymizí. Na druhou stranu se může jednat také o buňky, které jsou infikovány některým z vysoce rizikových typů HPV, u kterých hrozí riziko maligního zvratu. Proto by měly být pacientky s tímto nálezem ve vzorcích dále sledovány. 35

Obrázek č. 16. Příklad single-pozitivní buňky. HPV pozitivní buňka, negativní na amplifikace genů v jádře přítomny dva červené (MYCC) a dva žluté (hterc) fluorescenční signály. Dále byly ve vzorcích identifikovány tzv. double-pozititivní buňky (HPV+CHA+), tedy buňky infikované HPV a zároveň pozitivní na amplifikaci alespoň jednoho z genů (Obrázek č. 17). Pro tento typ buňěk existuje vysoké riziko progrese v karcinom a velice často se tyto buňky vyskytují již ve vyšších stádiích CIN a ve vzorcích karcinomu. Obrázek č. 17. Příklad double-pozitivní buňky. HPV pozitivní buňka (zelené fluorescenční signály) současně pozitivní na amplifikaci MYCC (5 červených signálů) a hterc (5 žlutých signálů). Za celkově pozitivní preparát na přítomnost HPV infekce a amplifikaci jednoho či druhého genu byly považovány vzorky pacientek, u kterých jsme detekovali amplifikaci genů hterc či MYCC a HPV pozitivní buňky alespoň v jednom ze 3 vyšetřených vzorků. 36

6 Výsledky 6.1 Klinická charakteristika souboru pacientek Celkem bylo k 1.4.2013 přijato k vyšetření 123 pacientek z Masarykova onkologického ústavu v Brně. Z tohoto souboru bylo k výše uvedenému datu vyšetřeno molekulárně cytogenetickými metodami 108 pacientek. Soubor 108 pacientek byl tvořen pacientkami se vzorky různých histologických stádií, na základě kterých byl soubor také rozdělen do podskupin. Do skupiny pacientek bez onkologického nálezu bylo zařazeno 23 pacientek. Celkem 15 (13 %) pacientek bylo v době diagnózy bez onkologického nálezu, u 2 pacientek byly nalezeny reparativní změny v oblasti děložního hrdla avšak bez patologického nálezu. 4 pacientky s chronickým zánětem, z nichž jedna pacientka byla diagnostikována s chronickým zánětem a endometriózou a adenokarcinomem těla děložního v hrdle, 1 s atrofií v oblasti děložního hrdla bez patologického nálezu a 1 s hyperplazií bez atypie. Prekancerózy, tj. stádium CIN1 bylo identifikováno u 9 (9 %) pacientek, stádium CIN2 pak u 6 pacientek (6 %). U 12 (11 %) pacientek bylo popsáno ve vzorcích stádium CIN3, z čehož jedna pacientka se vyskytovala ve stádiu CIN3 s reziduem CIN2. Celkem 4 pacientky (4 %) byly identifikovány ve stádiu přechodu CIN3 v karcinom in situ. Celkem 4 pacientky (4 %) pak byly diagnostikovány s karcinomem in situ. U 38 pacientek (35 %) byl popsán spinocelulární karcinom, přičemž 6 pacientek mělo karcinom dle histologického gradingu ve stádiu G1, 14 pacientek ve stádiu G2, 1 pacientka se spinocelulárním karcinomem ve stádiu G2 + CIN3, 1 pacientka se spinocelulárním karcinomem ve stádiu G2-G3 a 14 pacientek se spinocelulárním karcinomem ve stádiu G3. U 1 pacientky byl popsán velkobuněčný spinocelulární karcinom. Dále byl u 12 (10 %) pacientek diagnostikován adenokarcinom. Z těchto 11, se u 2 pacientek nacházel adenokarcinom ve stádiu G1 u jedné z nich byl karcinom bez recidivy nad pahýlem. Celkově 4 pacientky byly přijaty s adenokarcinomem ve stádiu G2 a 6 pacientek s adenokarcinomem ve stádiu G3 viz obrázek č. 18. 37

Obrázek č. 18. Rozdělení pacientek do skupin dle histologických stádií. Soubor 38 pacientek se spinocelulárním karcinom byl také rozdělen podle jednotlivých stádií dle TNM klasifikace, jak je zobrazeno na obrázku č. 19. U 2/38 (5,3 %) pacientek byl popsán karcinom ve stádiu IAI, u 3/38 (7,9 %) pacientek karcinom ve stádiu IA2, u 17/38 (44,7 %) pacientek karcinom ve stádiu IB1, u 4/38 (10,5 %) pacientek karcinom ve stádiu IB2, u 2/38 (5,3 %) pacientek karcinom ve stádiu IIB, u 9/38 (23,7 %) pacientek karcinom ve stádium IIIB a u 1/38 (2,6 %) pacientky karcinom ve stádiu IVA. Obrázek č. 19. Rozdělení pacientek se spinocelulárním karcinomem do kategorií dle TNM klasifikace. 38

Shodně bylo dle TNM klasifikace rozděleno 12 pacientek s adenokarcinomem, kdy bylo stádium karcinomu určeno pouze u 10 z nich. U 7/10 (70 %) pacientek byl nalezen karcinom ve stádiu IB1, u 2/10 (20 %) pacientek karcinom ve stádiu IIIB a u 1/10 (10 %) pacientky karcinom ve stádiu IVA. Výsledky jsou prezentovány na obrázku č. 20. Obrázek č. 20. Rozdělení 10 pacientek s adenokarcinomem do kategorií dle TNM klasifikace. Věkové rozložení souboru pacientek se pohybovalo v rozmezí 22-86 let s průměrným věkem 44,5 roku. Rozdělení souboru vyšetřených pacientek dle věku je znázorněno na obrázku č. 21. Obrázek č. 21. Věkové kategorie 108 vyšetřených pacientek. 39

6.2 Identifikace buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků prekancerózních cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla Metodou FISH bylo vyšetřeno celkově 108 pacientek. Vyšetřovány byly stěry získané z exocervixu, endocervixu a vzorky připravené metodou LBC. Soubor pacientek byl rozdělen do tří skupin v závislosti na celkové diagnóze, a to na pacientky s negativním onkologickým nálezem, pacientky s prekancerózami a pacientky s karcinomy spinocelulárními a adenokarcinomy. 6.2.1 Analýza buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků bez onkologického nálezu Ze souboru 108 pacientek byl vyšetřen odebraný materiál od 23 pacientek bez onkologického nálezu. Za vzorky s onkologicky negativním nález byly považovány vzorky u pacientek, u kterých byl např. detekován chronický zánět (4/23), reparativní změny (1/23), atrofie (1/23), hyperplazie (1/23) či byly zcela bez patologického nálezu (16/23). Celkem u 9/23 (39,1 %) pacientek z tohoto souboru byl odebrán a vyšetřen materiál ze stěrů z exocervixu, u 8/23 (34,8 %) stěry z endocervixu a u 11/23 (47,8 %) pacientek byly odebrané vzorky zpracované metodou LBC (Obrázek č. 22). Obrázek č. 22. Počet vyšetřených vzorků exocervixu (1), endocervixu (2) a LBC preparátů (3) u 23 pacientek bez onkologického nálezu. Modře je znázorněn počet jednotlivých preparátů, vůči celkovému počtu pacientek (červená). 40

Celkově z 23 pacientek bez onkologického nálezu se podařilo provést analýzu na přítomnost HPV infikovaných buňěk u 13/23 (56,5 %) z nich. U 9/13 (69,2 %) pacientek byly nalezeny HPV infikované buňky. Detekce amplifikace genu hterc byla úspěšně provedena u 20/23 (87 %) pacientek a nalezena u 3/20 (15 %) z nich. Vyšetřit amplifikaci genu MYCC se podařilo u 13/23 (56,5 %) pacientek a u 3/13 (23,1 %) pacientek jsme amplifikaci nalezli. Single-pozitivní buňky, tedy takové, u kterých byly nalezeny buď HPV infikované buňky, nebo amplifikace alespoň jednoho genu, byly detekovány u 6/13 (46,2 %) pacientek a double-pozitivní buňky, tzn. ty, u kterých byla detekována jak přítomnost HPV infikovaných buněk a zároveň amplifikace alespoň jednoho genu, byly nalezeny u 3/13 (23,1%) pacientek. Souhrnné výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 4 a v příloze č. 1. Celkem 3/13 (23,1 %) pacientky z této skupiny byly pozitivní na současnou amplifikaci genu hterc i MYCC. Vzorky bez onkologického nálezu Amplifikace genu MYCC Amplifikace genu hterc single pozitivní buňky double pozitivní buňky Infekce HPV (n=23) 3/13 (23,1 %) 3/20 (15 %) 6/13 (46,2 %) 3/20 (15 %) 9/13 (69,2 %) Tabulka č. 4. Výsledky vyšetření u infekce HPV a amplifikace genů MYCC a hterc u skupiny 23 pacientek bez onkologického nálezu. 6.2.2 Analýza buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků prekancerózních cervikálních intraepiteliálních dysplázií Ze 108 pacientek bylo 35 pacientek zařazeno dle diagnózy do skupiny prekanceróz (CIN1-CIN3-karcinom in situ). U 22/35 (62,9 %) pacientek byly odebrány a vyšetřeny stěry z exocervixu, u 22/35 (62,9 %) pacientek stěry z endocervixu a u 18 (78,3 %) pacientek byly odebrané vzorky zpracované metodou LBC. Počet jednotlivých vyšetření je zobrazen na obrázku č. 23. V této skupině 35 pacientek bylo vyšetřeno 9 pacientek se stádiem CIN1, 6 pacientek se stádiem CIN2, 12 pacientek se stádiem CIN3, 4 pacientky s přechodným stádiem CIN3- karcinom in situ a 4 pacientky s karcinomem in situ. 41

Obrázek č. 23. Počet vyšetřených vzorků exocervixu (1), endocervixu (2) a LBC preparátů (3) u 35acientek s prekancerózami. Tmavě je znázorněn počet jednotlivých preparátů, vůči celkovému počtu pacientek (světlá). Celkově se podařilo vyšetřit HPV infekci buněk u vzorků 31 pacientek. Pozitivní na HPV infekci bylo 21/31 (67,7 %) pacientek. HPV infikované buňky byly nalezeny u 3/7 (42,9 %) pacientek s diagnózou CIN1, u 3/6 (50 %) pacientek s diagnózou CIN2, u 10/12 (83,3 %) pacientek s diagnózou CIN3, u 3/3 (100 %) pacientek s diagnózou CIN3 karcinom in situ a 2/3 (66,7 %) pacientek s karcinomem in situ. Amplifikaci genu hterc se úspěšně podařilo vyšetřit u 14/35 (40 %) pacientek. Pozitivní na amplifikaci genu hterc byla 1/9 (11,1 %) pacientka s diagnózou CIN1, 2/6 (33,3 %) pacientky s diagnózou CIN2, 7/12 (58,3 %) pacientek s diagnózou CIN3, 2/4 (50 %) pacientky s diagnózou CIN3 karcinom in situ a u 2/4 (50 %) pacientky s karcinomem in situ. Amplifikaci genu MYCC se podařilo stanovit u 11/31 (35,5 %) pacientek. Amplifikace byla detekována u 2/7 (28,6 %) pacientek s diagnózou CIN1, u 1/6 (16,7 %) pacientek s diagnózou CIN2, u 4/12 (33,3 %) pacientek s diagnózou CIN3, u 2/3 (66,7 %) pacientek s diagnózou CIN3 karcinom in situ a u 1/3 (33,3 %) pacientky s karcinomem in situ. Single-pozitivní buňky byly detekovány u 3/7 (42,9 %) pacientek s diagnózou CIN1, u 1/6 (16,7 %) pacientky s diagnózou CIN2, u 5/12 (41,7 %) pacientek s diagnózou CIN3, u 1/3 (33,3 %) pacientky s diagnózou CIN3 karcinom in situ a u žádné pacientky s karcinomem in situ (0 %). Double-pozitivní buňky byly nalezeny u 1/7 (14,3 %) pacientky s diagnózou CIN1, u 2/6 (33,3 %) pacientek s diagnózou CIN2, u 6/12 (50 %) 42

pacientek s diagnózou CIN3, u 2/3 (66,7 %) pacientek s diagnózou CIN3 karcinom in situ a u 2/3 (66,7%) pacientek s karcinomem in situ. Výsledky jsou shrnuty v tab. 5 a v příloze č.2. single pozitivní buňky double pozitivní buňky Vzorky Amplifikace Amplifikace Infekce HPV prekanceróz genu MYCC genu hterc CIN1 (n=9) 3/7 (42,9 %) 1/9 (11,1 %) 3/7 (42,9 %) 1/7 (14,3 %) 3/7 (42,9 %) CIN2 (n=6) 1/6 (16,7 %) 2/6 (33,3 %) 1/6 (16,7 %) 2/6 (33,3 %) 3/6 (50 %) CIN3 (n=12) 4/12 (33,3 %) 7/12 (58,3 %) 5/12 (41,7 %) 6/12 (50 %) 10/12 (83,3%) CIN III - karcinom in situ (n=4) 2/3 (66,7 %) 2/4 (50 %) 1/3 (33,3 %) 2/3 (66,7 %) 3/3 (100 %) karcinom in situ (n=4) 1/3 (33,3 %) 2/4 (50 %) 0/4 (0 %) 2/3 (66,7 %) 2/3 (66,7 %) Tabulka č. 5. Výsledky vyšetření u infekce HPV a amplifikace genů MYCC a hterc u skupiny 35 pacientek s prekancerózami. 6.2.3 Analýza buněk infikovaných HPV a stanovení amplifikace genů hterc a MYCC u vzorků karcinomu děložního hrdla Ze souboru 108 vyšetřených pacientek bylo 50 pacientek diagnostikováno s karcinomem děložního hrdla. Se spinocelulárním karcinomem bylo vyšetřeno celkem 38/50 (76 %) pacientek a 12/50 (24 %) pacientek s adenokarcinomem. U 22/38 (57,9 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a 5/12 (41,7 %) pacientek s adenokarcinomem, byly odebrány a vyšetřeny stěry z exocervixu. Dále byly u 21/38 (55,3 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a 5/12 (41,7 %) pacientek s adenokarcinomem vyšetřeny stěry z endocervixu a u 10/38 (26,3 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a 6/12 (50 %) pacientek s adenokarcinomem pacientek byly odebrané vzorky zpracované metodou LBC. Poměr jednotlivých metod vyšetření u pacientek se spinocelulárním karcinomem je znázorněn na obrázku č. 24, a u pacientek s adenokarcinomem na obrázku č. 25. Celkově bylo 24/38 (63,2 %) vzorků spinocelulárního karcinomu a 6/12 (50 %) vzorků adenokarcinomu vyšetřeno na přítomnost HPV infikovaných buněk. Tyto buňky bylo možno detekovat u 23/24 (95,8 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 5/6 (83,3 %) pacientek s adenokarcinomem. Vyšetřit vzorky na amplifikaci genu hterc se podařilo u 37/38 (97,4 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 10/12 (83,3 %) pacientek s adenokarcinomem. Amplifikace byla nalezena u 26/37 (70,3 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 7/10 (70 %) pacientek s adenokarcinomem. Amplifikace genu MYCC byla úspěšně vyšetřena u 24/38 43

(63,2 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 6/12 (50 %) pacientek s adenokarcinomem. Amplifikace byla nalezena u 13/24 (28,9 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 6/6 (100 %) pacientek s adenokarcinomem. Single-pozitivní buňky byly přítomny u 9/37 (24,3 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 2/10 (20 %) pacientek s adenokarcinomem. Double-pozitivní buňky byly nalezeny u 20/24 (83,3 %) pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 5/6 (83,3 %) pacientek s adenokarcinomem. Výsledky jsou v tab. č.6 a v příloze č.3 a č.4. Obrázek č. 24. Počet vyšetřených vzorků exocervixu (1), endocervixu (2) a LBC preparátů (3) u 38 pacientek se spinocelulárním karcinomem. Tmavě je znázorněn počet jednotlivých preparátů, vůči celkovému počtu pacientek (světlá). Obrázek č. 25. Počet vyšetřených vzorků exocervixu (1), endocervixu (2) a LBC preparátů (3) u 12 pacientek s adenokarcinomem. Tmavě je znázorněn počet jednotlivých preparátů, vůči celkovému počtu pacientek (světlá). 44