5. Bioreaktory Bioreaktor (fermentor) je nejdůležitější částí výrobní linky biotechnologického procesu. Jde o nádobu různého objemu, ve které probíhá biologický proces. Dochází zde k růstu buněk a tvorbě produktů nebo přeměně substrátu na jeden či více produktů, přičemž proces je katalyzován buď volnými buňkami nebo buňkami vázanými na nosič (imobilizované buňky) nebo jedním nebo více enzymy vázanými na nosič (imobilizovanými enzymy). Obecně pro bioreaktory platí, že musí mít přívod a odvod média, přívod inokula, míchací zařízení, ventil na přívod vzduchu, ventil na odebírání vzorků, vyhřívání, teploměr, tlakoměr, případně i jiné měřící články. Bioreaktory lze klasifikovat podle různých kritérií, základní dělení je podle způsobu kultivace a podle tohoto kritéria dělíme bioreaktory na Míchací tanky (stirred-tank) Vířivé reaktory (airlift bioreactor) S pevnými nosiči (např. fixed-bed bioreactor) Membránové bioreaktory (např. hollow fiber perfusion bioreactor) Schematicky jsou jednotlivé typy bioreaktorů znázorněny na obr. 5.1. Nejpoužívanějšími bioreaktory jsou míchací tanky. Obr. 5.1: Schématická znázornění jednotlivých typů bioreaktorů (podle Crommelin et al., 2007) A) Míchací tank regulátor motor louh kyselina výstup vzduchu teplotní čidlo buňky nárazový kryt živiny chladící voda regulátor regulátor chladící voda rozprašovač odběr sterilní vzduch
B) Vířivý reaktor sací trubka vzduch C) Reaktor s pevnými nosiči vzduch výměník plynu nosiče pumpa
D) Membránový reaktor inokulační vstup vodní plášť produkt živiny produkt živiny Buňky ve vnitřním prostoru prstence Lumen Vnitřní membrána Vnější membrána Podle kinetiky buněčného růstu a způsobu tvorby produktů rozlišujeme tři typy bioreaktorů Vsádkový (batch) Dávkovací (fed-batch) Kontinuální bioreaktor Další kritéria dělení bioreaktorů mohou být následující bioreaktory pro kultivaci volných buněk nebo pro imobilizované buňky a enzymy podle objemu - laboratorní (do cca 30 l), čtvrtprovozní (30 až 100 l), poloprovozní (100 až 5 000 l) a provozní (nad 5 m 3 ) podle tvaru rozlišujeme bioreaktory válcové, s kulatým dnem, cirkulační, věžové s mechanickým, pneumatickým a hydrodynamickým mícháním (čerpadlo) nesterilní (př. pivovarnictví, zpracování odpadů, sterilní (farmacie), speciální (GMO, tkáňové
kultury) aerobní, anaerobní, aj. Ve všech typech bioreaktorů rostou buňky ve 4 fázích (obr. 5.2): fáze lagu, fáze exponenciálního růstu, fáze stacionární a fáze odumírání kultury. Někdy je ve fázi exponenciálního růstu ještě rozlišována fáze zrychleného a fáze zpomaleného růstu. Obr. 5.2: Růstové fáze buněk v bioreaktoru fáze zpomaleného růstu stacionární fáze fáze zrychleného růstu exponenciální fáze fáze odumírání lag fáze Lag-fáze: přípravná fáze, buňky se nerozmnožují, ale zvětšují svůj objem, dochází u nich k aktivaci enzymového systému; délka lag-fáze závisí na druhu daného mikroorganismu, fyziologickém stavu buněk, velikosti inokula a na složení nového růstového media Fáze zrychleného růstu: období, kdy všechny enzymové reakce dosahují mezních konstantních rychlostí a přecházejí do ustáleného stavu Exponenciální (logaritmická) fáze: začíná tehdy, kdy rychlost růstu dosahuje konstantní hodnotu, buňky mají nejkratší generační dobu, logaritmus počtu buněk je přímo úměrný času Fáze zpomaleného růstu: postupným vyčerpáním živin a hromaděním toxických metabolitů, mikroorganismy ztrácí schopnost rozmnožovat se stejnou rychlostí jako v exponenciální fázi Stacionární fáze růstu: zastavuje se přírůstek živých buněk, dochází k pomalému rozmnožování, které je kompenzováno odumíráním buněk Fáze odumírání: buňky se již nerozmnožují, pouze odumírají, dochází k postupnému snižování počtu buněk Fyziologické vlastnosti mikrobiálních buněk závisí na tom, ve které růstové fázi se nacházejí. Buňky, které jsou v pozdní lag-fázi nebo v exponenciální fázi, jsou mnohem citlivější vůči vlivům vnějšího prostředí než buňky ve fázi stacionární.
Exponenciální růst kultury, který je z technologického hlediska nejvýhodnější, je časově omezený. Při jednorázové kultivaci dochází k vyčerpání živin a tím i ke zpomalení růstu. Jednou z možností, jak prodloužit exponenciální fázi je kontinuální kultivace. Je to systém, do kterého se kontinuálně přivádějí živiny, a využité kultivační medium se kontinuálně odvádí z kultivační nádoby. Tím se dosáhne ustáleného stavu, při kterém se udržuje konstantní množství živých buněk. 5.1. Kultivační zařízení Výběr kultivačního zařízení musí odpovídat především biologickým vlastnostem kultivovaných mikroorganismů nebo buněk. Kromě toho je ale třeba respektovat i chemické, fyzikální ale i technologické parametry. Co se týče biologických vlastností, je rozhodující velikost mikroorganismů a jejich morfologické vlastnosti; mikroorganismy mohou růst jako jednotlivé buňky (bakterie, kvasinky), ve formě vláknité (aktinomycety) nebo jako vláknité mnohobuněčné organismy (vyšší houby). Buňky vyšších organismů pak mohou růst jednotlivě nebo jako přisedlé; mají větší nároky na složení kultivačního média a jsou citlivé na kontaminaci mikroorganismy. Např. mykoplasmata jsou vážným problémem, se kterým se potýká většina laboratoří pracující se živočišnými buňkami, plísně jsou pak trvalým problémem rostlinných buněčných a tkáňových kultur. Mechanické poškození provází kultivace prakticky všech typů buněk. Důležitým parametrem je charakter substrátu, který může být dodáván v pevném, polotekutém, kapalném nebo plynném stavu. Nejkomplikovanější je v tomto smyslu dodávání plynů vzduchu, kyslíku, CO 2 nebo metanu. Pevný substrát vyžadují především vyšší houby, jejichž plodnice nemohou růst submerzně v tekutém médiu. Většina organismů vyžaduje ke svému růstu kyslík, který je možno dodávat do kultivačního zařízení různými způsoby mícháním, profukováním apod. Provzdušňování je možné provádět povrchově nebo submerzně. Některé organismy naopak v přítomnosti kyslíku nerostou a neprodukují příslušný metabolit, rekombinantní protein. Proto je nutno z média kyslík odstranit, např. jeho probubláváním metanem nebo CO 2. Veškerý materiál v bioreaktoru musí být před započetím vlastního procesu kultivace zbaven všech mikroorganismů. O procesech sterilizace bude pojednáno v kapitole 6. Sterilizovat je nutné jak vlastní živné médium, tak všechny do bioreaktoru vstupující složky (včetně plynů) a taky samotné kultivační zařízení. Některé procesy ale nevyžadují striktně sterilní podmínky, z hlediska sterility odlišujeme výroby zcela aseptické, výrobně aseptické, částečně aseptické a zcela nesterilní. Velikost kultivačního zařízení je pro průmyslové procesy naprosto klíčová. Všechny biotechnologické výroby jsou nejprve prováděny v malých kultivačních zařízeních a jsou postupně převáděny z laboratorního do výrobního měřítka. Přechod z jednoho objemu do druhého by měl být prováděn zpravidla v rozsahu jednoho objemového řádu.
5.1.1. Typy kultivačních zařízení Nejjednodušším kultivačním zařízením je prostá skleněná kultivační baňka, např. Erlenmeyerova nebo varná baňka zpravidla o objemu do 500 ml. Kultivaci v baňkách výrazně ovlivňuje rychlost rozpuštění kyslíku. Ta je dána jednak mechanickými vlastnostmi třepacího zařízení, ale také poměrem objemu média k celkovému objemu a tvaru baňky. Proto se baňky konstruují s různými typy zarážek uvnitř. Objem média k celkovému objemu baňky by měl dosáhnout maximálně 30%. Uzávěr baňky musí být propustný pro proudění plynů v obou směrech a to tak, aby byla současně zajištěna sterilita. Standardní vatové zátky toto zajišťují spolehlivě. Baňky s naočkovanou kulturou organismu jsou umístěny v termostatech, které udržují vhodnou konstantní teplotu. Aerace je zajištěna třepáním baněk ve třepačce. Třepačky mohou být reciproké nebo rotační. Pro reciproké třepačky, které jsou levnější, jsou důležitými parametry frekvence třepání a amplituda kyvu. S rostoucí frekvencí a amplitudou roste množství rozpuštěného kyslíku v médiu, ale jen do určité meze. Rotační třepačky zajišťují lepší vzdušnění média, ale jsou dražší. Od objemů 500 ml média je vhodné převést kultivaci do sofistikovanějších zařízení, pravých bioreaktorů či fermentorů. Za bioreaktor můžeme obecně považovat jakékoli zařízení pro kultivaci jakéhokoli typu buněk. Jako fermentor budeme označovat bioreaktor, ve kterém se kultivují bakteriální buňky nebo kvasinky. V bioreaktorech probíhají složité biochemické a biofyzikální procesy, které ve svém důsledku vedou k nárůstu buněčné hmoty a k syntéze metabolických produktů. V závislosti na typu procesů se používají různé typy bioreaktorů. K základním částem každého bioreaktoru patří (obr 5.1 A): reaktorová nádoba přívod a odvod média přívod inokula míchací zařízení s motorem ventil na přívod vzduchu zařízení na odběr vzorků vyhřívání teploměr, tlakoměr, měřící a regulační články ph, koncentrace O 2, CO 2, atd. podle složitosti zařízení Laboratorní bioreaktory jsou mezistupněm převádění výsledků výzkumné činnosti do výrobního procesu. Jsou sice objemově na úrovni baněk, ale vzhledem ke konstrukčnímu uspořádání (tvar, větrací a míchací zařízení) se podobají výrobním bioreaktorům. Existují stacionární laboratorní bioreaktory, které jsou pevně uchyceny k podstavci nebo držáku. Mají pláště nebo spirální zařízení pro sterilizaci na místě (in situ), to slouží taky k vyhřívání bioreaktoru. Přenosné laboratorní bioreaktory se sterilizují buďto prázdné nebo už s médiem v autoklávech. Poté se umístí do vodní lázně, ve které je udržována konstantní kultivační teplota. Vedle samotného bioreaktoru je celý kultivační systém doplněn regulačním zařízením ovládaným procesorem. Toto regulační zařízení slouží k ovládání jednotlivých přídavných zařízení, kterými se nastavují parametry kultivačního procesu teploty, přívodu živin, úpravy ph a aerace a taky k řízení odběru vzorků při kontinuální kultivaci apod. Laboratorní bioreaktory se vyrábějí skleněné a jejich pracovní objem se pohybuje kolem 5 litrů
(maximálně až do 30 litrů), přičemž množství média dosahuje od 1 do 3 litrů. Čtvrtprovozní až poloprovozní bioreaktory navazují na bioreaktory laboratorní a slouží především k ověření technologických parametrů před převedením procesu do výrobní fáze. Zřejmě nejdůležitějším parametrem, který se v poloprovozních bioreaktorech sleduje, je proces aerace. S rostoucím objemem kultivačního média je stále těžší zajistit jednak rovnoměrné prohřátí celého objemu média a jednak homogenní okysličení. V poloprovozních bioreaktorech se proto testují parametry míchadel, velikost, typ a velikost zarážek a větracích systémů. Ověřuje se, jak zarážky a větrací systémy ovlivní aeraci v závislosti na jejich umístění uvnitř bioreaktoru. Poloprovozní bioreaktory jsou zhotoveny z nerezavějící oceli, mají tvar válce a objem nejčastěji do 400 (maximálně až do 5 000) litrů. Plní se zpravidla na 120 až 250 litrů. Výrobní bioreaktory se podle způsobu dodávání energie dělí na mechanické (míchací zařízení je napojeno na elektromotor), pneumatické (provzdušňování se děje stlačeným plynem) a hydrodynamické (promíchávání čerpadlem). Různé typy míchadel, které se používají ve výrobních bioreaktorech, jsou výsledkem dlouholetého testování v mnoha průmyslových provozech. Objemy výrobních bioreaktorů se řídí podle požadavků na výrobu a mohou dosahovat stovek hektolitrů. 5.2. Typy kultivací Při realizaci procesů v průmyslovém měřítku se nejčastěji používají submersní (ponořené) procesy kultivace. Rozlišujeme tři typy kultivací diskontinuální, kontinuální a semikontinuální. 5.2.1. Diskontinuální kultivace (jednorázová, vsádková, batch ) Je nejjednodušší typ kultivace, který je typický pro baňky. Při tomto způsobu je mikroorganismus inokulován do fixního objemu média. V průběhu kultivace v médiu ubývají živiny a akumulují se produkty. Nutriční prostředí se při diskontinuální kultivaci trvale mění. Pro tento typ kultivace je typická růstová křivka uvedená na obr. 5.2. 5.2.2. Kontinuální kultivace (průtočný systém) Při tomto typu kultivace se koncentrace nutrientů, biomasy i produktů (metabolitů) v systému téměř nemění. Živiny jsou kontinuálně dodávány, biomasa nebo produkty metabolismu a odpadní látky jsou pravidelně odebírány. Mikroorganismy zde rostou v podmínkách ustáleného stavu a proces fermentace je snadno ovladatelný. Obecně se tento typ kultivace vyznačuje vyššími náklady na experimenty. Při kontinuálních kultivaci je obtížné udržet aseptické podmínky, je při ní vyšší riziko kontaminace. Cílem kontinuální kultivace je udržet kulturu co nejdéle v exponenciální fázi růstu. Jako příklady použití tohoto typu kultivace je možno uvést produkci velkých objemů biomasy nebo čištění odpadních vod. Zařízení pro kontinuální kultivace se dělí principiálně na dva typy: chemostat, ve kterém je hustota populace udržována na konstantní úrovni díky nízké koncentraci jedné ze základních přitékajících živin, zatímco ostatní složky živné půdy jsou v nadbytku (konstantní je koncentrace jednoho substrátu) turbidostat, u kterého hustotu populace reguluje fotobuňka tak, že když dojde ke zvýšení hustoty nad určitou mez, tak se zvýší přítok živné půdy; když hustota klesá, tak se přítok živné půdy sníží (konstantní je v tomto případě koncentrace biomasy).
5.2.3. Semikontinuální kultivace ( fed batch ) I v tomto případě je, jako u diskontinuální kultivace, prováděna inokulace do fixního objemu média. V průběhu procesu se ale periodicky přidávají živiny, resp. další komponenty tak, aby nedocházelo k inhibici přebytkem substrátu i produktu a bylo dosaženo vysoké produktivity. Semikontinuální kultivace je častým typem fermentačních procesů. Jako příklad může sloužit výroba droždí. 5.2.4. Jiné typy kultivací Kromě výše uvedených submerzních způsobů kultivace v bioreaktorech se ve speciálních případech používají povrchová kultivace na tekutých živných půdách a kultivace na pevných živných půdách. Povrchová kultivace na tekutých živných půdách se provádí na mísách z pozinkovaného plechu. Jednotlivé mísy s živným médiem se sestavují nad sebou do pater. Sterilizace mís se provádí horkými parami nebo chemickými činidly. Živné médium se přivádí již sterilizované. Tento typ kultivace se uplatňuje zejména u vláknitých mikroorganismů např. Aspergilus niger, který produkuje kyselinu citronovou. Kultivace na pevných půdách se využívá především v diagnostice mikroorganismů nebo při výchozím namnožení zásobních kultur pro přípravu inokula (viz dále). Živné půdy mají stejné složení jako půdy tekuté, ale jsou ztuženy agarem, želatinou nebo silikagelem. Ojediněle lze metodu využít pro kultivaci patogenních mikroorganismů na produkci očkovacích látek. Jedlé houby se kultivují na sypkých materiálech, jako jsou otruby, pokrutiny, sláma apod. Stejné substráty se používají při produkci enzymů, zchutňování slámy a jiných celulózových odpadů ke krmným účelům. 5.3. Další otázky spojené s bioreaktory 5.3.1. Požadavky na materiály vhodné pro konstrukci bioreaktorů Na materiály používané ke konstrukci bioreaktorů jsou kladeny některé specifické požadavky materiály vstupující do kontaktu s mediem nebo buněčnou populací musí odolávat korozi a nesmí se z nich uvolňovat do media kovové ionty materiály nesmí působit na buněčnou populaci toxicky materiály musí snášet opakovanou sterilizaci parou o vysokém tlaku míchadla, vstupní porty, apod. musí být dostatečně odolné vůči deformaci při mechanickém namáhání z hlediska potřeby vizuální kontroly jsou preferovány transparentní materiály (sklo) 5.3.2. Měření a regulace průběhu fermentačního procesu Při biotechnologických výrobách jsou výtěžky produktů značně závislé na přesném dodržování a kontrole příslušných technologických předpisů. Proto je nutné, aby laboratorní, poloprovozní i provozní bioreaktory byly vybaveny spolehlivým měřícím a regulačním zařízením. Během procesu se měří následující fyzikální a fyzikálně-chemické parametry:
fyzikální parametry: teplota, tlak páry, vody a stlačeného vzduchu, příkon, tvorba a množství pěny, průtok plynů a kapalin. V případě tvorby pěny fungují čidla založená na vodivosti: jakmile dojde ke zvýšení tvorby pěny a pěna se dotkne elektrody v horní části bioreaktoru, uvede se do činnosti přítok odpěňovacího prostředku. fyzikálně-chemické parametry: ph, redoxní potenciál, množství rozpuštěného kyslíku (kyslíková elektroda), chemické činitele (měření koncentrace stimulátorů a inhibitorů růstu nebo tvorby produktů jako jsou C, N, P, S, Mg, K, Na, Fe, regulátory růstu, prekursory apod., měření koncentrace NH 4 +, Mg 2+, Na +, Ca 2+ PO 4 3- atd. specifickými elektrodami. V současné době se měření provádí průběžně pomocí automatických analyzátorů. 5.3.3. Příprava inokula Přípravou inokula se rozumí převedení zakonzervované buněčné kultury ve stavu klidu do živného média do produktivního stavu růstu a množení. V podstatě se během procesu musí z pár tisíc buněk ve zkumavce namnožit objem i několika set litrů. Tento proces zahrnuje několik dílčích kroků: přenos konzervovaných buněk do reaktivačního média zabránění možnostem kontaminace média sledování kvantity a fyziologického stavu buněk (zjištění růstové křivky) Uveďme si jednoduchý příklad přípravy inokula a dalšího nakládání s ním: Mycelium zamražené ve vegetativním stavu se rychle rozmrazí při 37 C. Celkem 1 ml vzorku se přenese do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se 40 ml média, které je předem vysterilizované. Baňka se inkubuje 24 h na třepačce při 28 C. Po 24 h se 10 ml získané suspenze přenese do 2 litrové baňky, která obsahuje 400 ml stejného sterilního média a inkubuje se opět 24 h. Získaná kultura se asepticky přenese do 380 l stejného média a po přibližně 40 h kultivace je kultura téměř na konci exponenciálního růstu a může se přenést do fermentoru o objemu 10 000 l. Nárůst buněk se monitoruje jednak sledováním změn ph, spotřebou kyslíku a hmotnosti buněk po centrifugaci. Transfer do produkční nádoby se provádí na konci exponenciální fáze růstu. Inokulum se do kultivační nádoby obvykle dodává v množství okolo 1-5 % objemu. 5.4. Shrnutí kapitoly Bioreaktor (fermentor) je nejdůležitější částí výrobní linky biotechnologického procesu. Jde o nádobu různého objemu, ve které probíhá biologický proces. Bioreaktory dělíme podle způsobu kultivace na míchací tanky, vířivé reaktory, bioreaktory s pevnými nosiči a membránové bioreaktory. Podle kinetiky buněčného růstu a způsobu tvorby produktů rozlišujeme vsádkový, dávkovací a kontinuální bioreaktor. Podle velikosti a účelu použití rozlišujeme bioreaktory laboratorní, čtvrtprovozní, poloprovozní a výrobní. Výběr kultivačního zařízení musí odpovídat především biologickým vlastnostem kultivovaných
mikroorganismů nebo buněk (velikost a morfologie). Kromě toho je ale třeba respektovat i chemické (charakter substrátu), fyzikální (způsob provzdušňování) ale i technologické parametry (sterilita prostředí). Ve všech typech bioreaktorů rostou buňky ve 4 fázích: fáze lagu, fáze exponenciálního růstu, fáze stacionární a fáze odumírání kultury. Rozlišujeme tři typy kultivací diskontinuální, kontinuální a semikontinuální. V případě kontinuální kultivace rozlišujeme chemostat a turbidostat. Při biotechnologických výrobách jsou výtěžky produktů závislé na přesném dodržování a kontrole příslušných technologických předpisů. Proto je nutné, aby laboratorní, poloprovozní i provozní bioreaktory byly vybaveny spolehlivým měřícím a regulačním zařízením, které v průběhu procesu udržuje konstantní fyzikální a chemické parametry. Základním krokem při práci s bioreaktory je příprava inokula, tedy převedení zakonzervované buněčné kultury ve stavu klidu do živného média do produktivního stavu růstu a množení. Velikost kultivačního zařízení je pro průmyslové procesy naprosto klíčová. Všechny biotechnologické výroby jsou nejprve prováděny v malých kultivačních zařízeních a jsou postupně převáděny z laboratorního do výrobního měřítka. Přechod z jednoho objemu do druhého by měl být prováděn zpravidla v rozsahu jednoho objemového řádu. 5.5. Příklady a úlohy k zamyšlení 1) Jaká je generační doba fermentované bakteriální kultury, jestliže v čase T1 bylo množství bakterií 5 x 10 6 /ml a po 2 hodinách (v čase T2) toto množství činilo 10 8 /ml. 2) Z výše uvedených parametrů určete rychlost dělení bakteriální kultury 3) Odvoďte dobu lagu z uvedeného grafu č. 1 Graf č. 1 5,00E+06 4,50E+06 počet bakterií 4,00E+06 3,50E+06 3,00E+06 2,50E+06 2,00E+06 1,50E+06 1,00E+06 5,00E+05 1,00E+00 čas 0 20 40 60 80 100 120 140 160
4) Podle růstové křivky znázorněné na grafu č. 2 určete, o jaký charakter růstu se jedná Graf č. 2 1,00E+07 9,00E+06 počet bakterií 8,00E+06 7,00E+06 6,00E+06 5,00E+06 4,00E+06 3,00E+06 2,00E+06 1,00E+06 1,00E+00 čas 0 100 200 300 400 500 5) Podle růstové křivky znázorněné na grafu č. 3 určete, o jaký charakter růstu se jedná Graf č. 3 10 9,5 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 log počtu bakterií čas 0 100 200 300 400 500