Praktikum č. 19: Mikrobiologická diagnostika dermatomykóz, systémových mykóz a mykotoxikóz. Cíle: 1. Seznámit se s růstovými a mikroskopickými vlastnostmi původců mykotických infekcí zvířat. 2. Naučit se obecné postupy mykologického vyšetření klinických vzorků. Houby řadíme mezi eukaryotní organismy, které patří do samostatné říše Fungi. Dnes je známo více než 250 000 druhů hub z nichž méně než 150 může být patogenních pro člověka a zvířata. Patogenní houby se pro své mikroskopické rozměry často označují jako mikromycety. Rozdělují se do tří kmenů: Ascomycota (ascomycetes), Basidiomycota (basidiomycetes) a Zygomycota (zygomycetes), pro které je typické střídání sexuálních a asexuálních stádií. druhově charakteristické morfologie těchto stádií se využívá při identifikaci. Čtvrtou skupinou mikromycet tvoří fungi imperfecti (deuteromycetes), u nichž sexuální formy zatím nebyly zjištěny. Mikromycety tvoří dvě základní morfologické formy, plísně a kvasinky. Plísně rostou v podobě větvících se vláken neboli hyf, zatímco jednobuněčné kvasinky mají oválný nebo kulovitý vzhled. Zvláštní skupinou jsou dimorfické houby, které se mohou vyskytovat v obou těchto formách. O tom, která forma se bude tvořit rozhodují faktory prostředí. Mikromycety během pohlavního nebo nepohlavního množení tvoří spóry. U některých druhů k tomu dochází při obou typech množení. Morfologie reprodukčních struktur je důležitým diagnostickým znakem (obrázek č. 14). Mikromycety se daří kultivovat za aerobních podmínek na agarových médiích, kde vytvářejí kolonie. Pro plísně jsou charakteristické makrokolonie, které se skládají ze substrátového mycelia (zajišťuje výživu) a vzdušné mycelium (zajištění reprodukce - spóry). Vzhled makrokolonií plísní je závislý na výšce a barvě vzdušného mycélia. Dermatofyta (plísně působící kožní mykózy) vytvářejí při růstu na kultivačních médiích na vzdušném mycéliu druhově charakteristické vícebuněčné útvary makrokonídie. Kvasinky se nepohlavně dělí pučením a jejich kolonie připomínají kolonie bakterií. Průkaz sexuálních forem mikromycet se provádí ve specializovaných laboratořích a je základem jejich taxonomie. VETERINÁRNĚ VÝZNAMNÍ ZÁSTUPCI MIKROMYCET. 1. Dermatofyta Patří mezi fungi imperfecti. Mají afinitu ke keratinizovaným útvarům kůže a proto kolonizují a napadají kůži, srst a nehty. Pomalu rostou na speciálních médiích (Sabouraudův glukózový agar), některé druhy vyžadují růstové faktory. V získaných kulturách hledáme druhově charakteristická makrokonídia. Mikrokonidia (arthrospóry) se tvoří na infikovaném zvířeti, z něho se vylučují do prostředí, kde si po mnoho měsíců zachovávají schopnost infekce. Rodělují se na zoofilní a antropofilní druhy, které jsou obligátně patogenní, dále pak geofilní druhy jsou saprofyty půdy. Dermatofyta na postižené kůži vytvářejí charakteristické léze kruhového tvaru. 116
Tab. 28: Přehled druhů dermatofyt Druh Hostitel Microsporum canis (zoofilní) pes, kočka M. equinum (zoofilní) kůň M. gallinae (zoofilní) kur, krůta M. gypseum (geofilní) kůň, pes, hlodavci M. nanum (geofilní) prase M. persicolor (geofilní) hraboš polní Trychophyton equinum kůň T. mentagrophytes var. erinacei ježek, pes T. mentagrophytes var. mentagrophytes mnoho druhů, hlodavci, pes, kůň T. verrucosum (zoofilní) skot 2. Patogenní plísně (např. Aspergillus fumigatus) Klinické změny vyvolané plísněmi z rodu Aspergillus: Ptáci - pneumonie, aerosaculitídy, generalizovaná aspergilóza Koně - nosní granulomy, keratitídy, intestinální aspergilóza Skot - mykotické aborty, pneumonie, mastitídy, průjmy telat Psi - nosní aspergilóza, otitis externa Kočky - systémová aspergilóza 3. Patogenní kvasinky Candida albicans Komenzál sliznic a kůže, původce oportunních infekcí spojených s imunosupresí zvířat a člověka. Roste na základních médiích při teplotě 37 o C. Chlamydospóry tvoří na agaru s přídavkem kukuřičného škrobu. Kvasinkovité formy po přidání krevního séra do bujónu klíčí v hyfy a to asi po 2 hodinách při 37 o C. Je rezistentní k cyklohexamidu. Klinické změny vyvolané Candida albicans Štěňata, koťata, hříbata - mykotická stomatitis Prasata, hříbata, telata - gastro-esofageální vředy Telata - zánět předžaludků Psi - enteritis, kožní léze Kuřata - afty v jícnu Krávy - mastitis, aborty Klisny - pyometra Kočky - urocystitis, pyothorax Psi, kočky, prasata, telata - diseminované infekce 117
Cryptococcus neoformans Vyrůstá při 37 o C na různých médiích ve formě hlenovitých kolonií (buňky jsou obklopeny silným mukopolysacharidovým pouzdrem). Využívá kreatinin ve výkalech ptáků (často ve výkalech holubů). Vyvolává oportunní infekce získané z prostředí. Malassezia pachydermatis Vytváří buňky lahvicovitého tvaru. Je to komenzál kůže savců a ptáků. Může vyvolat nebo se podílet na zánětech mazových žlázek kůže a na otitis externa psů. 4. Dimorfické houby v prostředí se vyskytují ve formě plísní a v tkáních hostitele ve formě kvasinkovitých buněk. Jsou to saprofyté půdy, kde se podílí na rozkladu zbytků vegetace. U zvířat a člověka vyvolávají oportunní infekce. Blastomyces dermatitidis vyvolává blastomykózu psů (postiženy mohou být plíce, kůže, CNS) Coccidioides immitis vyvolává většinou infekce plic u psů, koní; případně aborty u klisen Histoplasma capsulatum původce histoplasmózy psů a koček (granulomatózní léze v plicích, ulcerativní léze ve střevě, periferní lymfadenitis. Sporothrix schenckii infekce koní, psů, koček, člověka a jiných druhů. U psů se infekce projevuje vředovitými a strupovitými změnami na kůži hlavy a trupu provázené alopécií. U koček vznikají uzlovité kůžní léze na končetinách, hlavě a krku. Změny mohou ulcerovat a šířit se do hlubších tkání. Účinným lékem je jodid sodný v krmivu. U koní se vyskytuje lymfokutánní sporotrichóza. OBECNÁ CHARAKTERISTIKA HOUBOVÝCH INFEKCÍ Několik druhů dermatofyt je považováno za obligátní patogeny, ale většina patogenních hub je rozšířena v prostředí jako saprofyté nebo se vyskytují jako komenzálové člověka a zvířat. Proto je většina druhů považována za oportunní patogeny a na vzniku a rozvoji houbových infekcí se často podílejí predispoziční faktory. Ty zahrnují narušení normální mikroflóry hostitele dlouhodobou aplikací antibiotik, imunosupresi, konkurenční infekce, poranění kůže nebo sliznic, trvale zvlhčené okrsky kůže nebo působení vysoké infekční dávky, jako jsou spóry Aspergillus fumigatus v případě pneuminií kuřat. Houbové infekce nemají obvykle epidemický charakter až na některé vyjimky, např. trychofytóza skotu. Samostatnou skupinou onemocnění jsou mykotoxikózy zvířat, které vznikají působením toxických metabolitů plísní, které se množily v krmivech. 118
Chronické houbové infekce vedou ke granulomatózní reakci tkání, která se podobá reakci organismu na cizí těleso nebo aktinomykotické infekci. Imunita k houbovým infekcím je více celulární než humorální povahy. U infikovaných zvířat se může vyvíjet hypersensitivita, která může vést k tvorbě kožní vyrážky. Toho lze využít v podobě různých kožních testů k diagnostice některých mykóz, např. histoplazmózy. Mykózy jsou někdy členěny na hluboké (systémové) a povrchové. Několik patogenních hub např. Candida albicans, je schopno vyvolávat obě formy povrchové i hluboké. Obecné metody diagnostiky mykóz Diagnostika mykóz se opírá o anamnézu, klinické příznaky, patoanatomické změny a v některých případech o výsledky intradermálních testů. Součástí diagnostiky je potvrzení suspektní diagnózy laboratorním vyšetřením klinického materiálu. Toto vyšetření zahrnuje přímou mikroskopii, izolaci a identifikaci původců. Identifikace je založena na posouzení morfologie kolonií (makrohabitus), mikroskopické struktury vzdušného mycélia (mikrohabitus) a biochemické aktivity (v případě kvasinek a některých dermatofyt). Přímé mikroskopické vyšetření klinického materiálu Tabulka č. 29 ukazuje metody užívané pro průkaz struktur plísní a kvasinek v klinických vzorcích a tabulka č. 30 shrnuje charakteristiky mikroskopických nálezů v klinickém materiálu u vybraných mykóz. Vzorky zahrnují chlupy, kožní seškraby, exudáty, bioptáty a vzorky jiných tkání. Protože mnoho potenciálně patogenních hub je ubikvitárních, je důležité prokázat tyto původce ve změněných tkáních hostitele. Jestliže se podaří prokázat korelaci mezi histopatologickými nálezy a izolovaným původcem je diagnóza s vysokou pravděpodobností potvrzena. Postup přípravy louhového preparátu 1. do 1-2 kapek 10-20% KOH na podložním sklíčku přidej malé množství vyšetřovaného vzorku a důkladně promíchej 2. opatrně sklíčko protáhni spodní částí plamene plynového kahanu, tak aby se urychlilo projasnění preparátu (nesmí se přehřát nebo vařit) 3. opatrně přilož a přitlač na vzorek krycí sklíčko 4. preparát nech ležet 1-2 hodiny, případně i přes nos ve vlhké komůrce. Doba preparace závisí na hustotě preparátu (louh částečně projasní proteinové složky vzorku). 5. prohlížej světelným mikroskopem ve fázovém kontrastu při zvětšení 200-400x Modifikace louhového preparátu 1. DMSO + KOH: prostupnost a projasnění preparátů může být vylepšena přidáním dimetyl sulfoxidu (DMSO) do KOH. Používá se 20 % KOH a 36% DMSO. 2. Barvení houbových elementů modrým nebo černým inkoustem: houby přijímají barvivo (inkoust) selektivně a vzorek je dostatečně projasněn 10% KOH. 3. Calcofluor (Rylux BSU) a KOH: 1 kapka 0.1% calcofluoru a 1 kapka 10% KOH se přenesou na podložní sklíčko. Přidéme malé množství vzorku a překryjeme krycím sklíčkem. Po projasnění se preparát prohlíží fluorescenčním mikroskopem (vlnová délka 500 nm). Barvivo se váže na chitin, který je součástí buněčné stěny plísní a kvasinek, proto jejich struktury v UV světle modrozeleně září. 119
Tabulka č. 29: Přehled barvicích metod užívaných k přímé mikroskopii původců mykotických infekcí TECHNIKA POUŽITÍ PŮVODCI 10-20% KOH projasnění vzorku, struktury hub jsou více viditelné, mikroskopujeme při zvětšení 200-400x Calcofluor (Rylux BSU) 0,1% Nigrosin fluorescence ve fluorescenčním mikroskopu preparáty z cerebrospinálního moku nebo exudátů plísně, kvasinky, dimorfické houby v tkáních, arthrospory na chlupech poškozených od dermatofyt průkaz chitinu ve strukturách hub (vlhké preparáty, histol. řezy) Cryptococcus neoformans ( průkaz velkých pouzder) Barvení podle Grama nebo fixované roztěry z tkání buňky kvasinek např. Candida metylenovou modří nebo exudátů albicans, bakterie Fluorescenční techniky (značené protilátky) mražené histol. řezy nebo fixované roztěry dostupné ve specializovaných laboratořích pro průkaz některých dimorfických hub - Blastomyces dermatitidis PAS + hematoxilin histologické řezy struktury hub se barví růžově Barvení dle Giemsy fixované roztěry kostní dřeně nebo bioptátů průkaz je omezen na Histoplasma capsulatum IZOLACE VLÁKNITÝCH HUB A KVASINEK Média používaná k izolaci patogenních hub z klinického materiálu musí být selektivní pro rychle rostoucí bakterie a často rychleji rostoucí kontaminující vláknité houby. Nejužívanější médiem je Sabouraudův glukózový agar. Ten má ph 5.6 a zatímco inhibuje bakterie umožňuje růst vláknitým hubám a kvasinkám, které snáší kyselé prostředí. Seletivita média se zvyšuje přídavkem chloramfenikolu (antibakteriální účinek), cykloheximidu (aktidionu), který brání růstu kontaminujících druhů plísní. Cykloheximid může inhibovat i některé patogenní druhy hub, např.: Zygomycetes, Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans a některé dimorfické houby (Blastomyces dermatitidis). Proto je vhodné používat média s přídavkem i bez přídavku této sloučeniny. Živné médium, jako např. agar z mozkosrdcové infuze s 5% krve, se užívají k izolaci dimorfických hub. Když pak naočkované vzorky inkubujeme při 37 o C, mění se myceliélní fáze v kvasinkovitou fázi růstu. Emmonsova modifikace Sabouraudova glukózového agaru s ph 6.9 byla navržena pro dermatofyta, která ačkoliv tolerují ph 5.6 rostou lépe v neutrálním prostředí. Kvasnicový extrakt (yeast extract) se přidává do médií za účelem poskytnout růstové faktory pro některé druhy z rodu Trychophyton. Inkubační teplota 37 o C je sama o sobě také selektivním prvkem. Řada potenciálně patogenních plísní, jako např. Aspergillus spp., vyrůstá při nižších teplotách, ale houby, které invadují tkáně zvířat, mohou teplotu 37 o C tolerovat. Tato teplota tak potlačí mnoho nepatogenních hub. 120
Dermatofyta rostou pomalu a vyžadují dlouhou inkubační dobu (2-6 týdnů), takže je zde reálné nebezpečí vysýchání médií. Tomu lze zabránit několika metodami: přelepení Petriho misky parafilmem použití většího objemu média do P. misky kultivace v širokoké zkumavce nebo nádobce se šroubovým uzávěrem Inokulace média Při izolaci kvasinek používáme kultivaci médií stejnými technikami jako u bakterií. Když se izolují plísně, povrch agaru by se měl lehce příčně vyšrafovat (nařezat) asi na pěti místech sterilním skalpelem. Vzorky v podobě kousků tkání, seškrabů nebo chlupů se mírně zatlačí do agaru v těchto vyšrafovaných místech (obr. č. 13). Jestliže se vzorek pouze přitlačí na neporušený agar je zde nebezpečí, že během inkubace se agar potrhá. Obrázek č. 13: Technika inokulace agarového média Subkultivace plísní a kvasinek Kvasinky mohou být subkultivovány stejnými postupy jako bakterie. Plísně vyžadují různé techniky: 1. Jestliže plísně sporulují - inokulační klička se zvlhčí přiložením na sterilní agar, pak se dotkneme středu kolonie a odebreme spóry (od středu kolonie začíná sporulace). U rychle rostoucích plísní inokulum přeneseme na povrch agaru do centra Pertiho misky, u pomale rostoucích plísní inokulum naneseme do čtyřech segmentů. 2. Jestliže plísně nesporulují - sterilním skalpelem vyřízneme bloček agaru (asi 5 mm 2 ) ve středu agaru, na který se má kultivovat, stejným skalpelem vyřízneme obdobný bloček agaru na okraji kolonie subkultivované plísně. Bloček s hyfami přeneseme do předem vyříznutého otvoru v agaru. Vyříznuté hyfy regenerují a rozrůstají se po povrchu nového agaru. Mikroskopické metody vyšetřování plísní a kvasinek Mikroskopický preparát. Preparačními jehlami odebereme malou část kolonie v místě ležícím mezi středem a okrajem kolonie. Kolonie kvasinek odebíráme bakteriologickou kličkou. Vzorek přeneseme do kapky barviva (laktofenol) na podložním sklíčku. Krycím sklíčkem vzorek překryjeme a přitlačíme, tak aby byly patrné všechny struktrury plísní a kvasinek. Mikroskopujeme nejdříve při malém zvětšení ( 200x) pak při větším zvětšení. Roztok laktofenolu: krystalický fenol... 20 g glycerin... 40 ml kyselina mléčná... 20 ml destilovaná voda... 20 ml 121
Poznámky: 122
Technika sklíčkových kultur. Ačkoliv není tato technika vhodná pro rychlou diagnostiku, je znamenitá pro průkaz a diferenciaci reprodukčních struktur plísní. Bez této techniky se neobejdeme při konečné identifikaci některých patogenních plísní. SKLÍČKOVÁ KULTURA 1. do Petriho misky vložíme okrouhlý filtrační papír, na který položíme skleněnou tyčinkou prohnutou do tvaru písmene V, dále jedno podložní a jedno krycí sklíčko. Misku uzavřeme, zabalíme do alobalu a sterilizujeme v autoklávu. 2. sterilním skalpelem vyřízneme bloček Sabouraudova agaru (4 x 4 mm) a asepticky ho přeneseme na podložní sklíčko v P. misce. 3. sterilní preparační jehlou inokulujeme spóry nebo část studované kolonie na okraj všech čtyřech stran agarového bločku, který pak zvrchu překryjeme krycím sklíčkem za pomoci sterilní pinzety. 4. filtrační papír na dně P. misky zvlhčíme sterilní destilovanou vodou a inkubujeme při optimální teplotě pro danou vláknitou houbu. Ta během inkubace roste mezi agarem a krycím sklíčkem z místa inokulace. 5. krycí sklíčko opatrně odstraníme z agarového bločku a stranou, která přiléhala k plísni, jej přiložíme na kapku laktofenolu na podložním sklíčku. Opatrně tlakem na sklíčko vytlačíme přebytek barviva. Pro krátkodobé uchování lze preparát upravit tak, že krycí sklíčko po obvodu přichytíme bezbarvým lakem na nehty. 6. pokud plíseň roste dolů po agarovém bločku na podložní sklíčko, může nám místo krycího sklíčka posloužit podložní sklíčko, na které po odstranění agarového bločku kápneme laktofenol a to do místa růstu plísně. Pak přiložíme krycí sklíčko a mikroskopujeme. Poznámky: 123
Tabulka č. 30: Přehled původců mykotických infekcí a jejich mikroskopické diagnostiky PŮVODCE TECHNIKA MIKROSKOPICKÝ NÁLEZ KOH, calcofluor, PAS, impregnace Ag Aspergillus fumigatus Zygomycetes: Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Absidia a Mortierella spp. Candida albicans Malassezia pachydermatis (Pityrosporum canis) Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatitidis Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Sporothrix schrenckii Dermatophytes: Microsporum spp. Trichophyton spp. Houby v mycetomech Houby při chromoblastomykózách Rhinosporidium seeberi Chrysosporidium (Emmonsia) parvum KOH, calcofluor, PAS, impregnace Ag Gramovo barvení, KOH, PAS, impregnace Ag Gramovo barvení, metylénová modř, KOH, calcofluor Nigrosin, KOH, PAS... KOH, calcofluor, fluorescenční technika,pas Giemsa, PAS, impregnace Ag PAS a impregnace Ag, KOH + calcofluor Gram nebo KOH - exudáty,pas nebo impregnace Ag - bioptáty KOH, KOH+calcofluor, dimethylsulfoxid+ KOH KOH, calcofluor, PAS, impregnace Ag KOH, calcofluor, PAS, impregnace Ag Septované hyfy, větvení v úhlu 45 o, hyfy o průměru 3-6µm, zřídka až 12µm. Granulomatózní nebo nekrotická reakce tkáně. Ve volných prostorech (plicní tkáň) se tvoří i charakteristické plodničky. Velké, vyduté a neseptované hyfy o průměru asi 10-20µm (rozpětí 3-25µm), s nepravidelným větvením. Invazivní hyfy Mortierella wolfii jsou mnohem kontrastnější a jemnější (2-12µm v průměru) Vyduté oválné nebo okrouhlé buňky průměru 3-4µm. V tkáních mohou být přítomny pseudohyfy, které je třeba odlišit od plísní se septovanými hyfy Kvasinka s buňkami lahvovitého tvaru (1-2 x 2-4µm), buňky unipolarně duří a množí se pučením, pupen je oddělen od mateřské buňky septem Sféricky vyduté kvasinkové buňky o průměru 2-15µm, obvykle obklopené velkým pouzdrem. Buňky mají v preparátu rozdílnou velikost. Pseudohyfy jsou vzácné. Velké vyduté kvasinkové buňky (8-15µm) s tenkou stěnou Malé vyduté kvasinkové buňky (2-5µm), sférického až oválného tvaru uvnitř monocytů. Je patrné jasné halo okolo tmavě se barvící buňky. Pupeny jsou jednotlivé s úzkou základnou. Velké sférycké útvary v tkáni, ve zralém stavu dosahují průměr až 200µm a obsahují velký počet endospor (2-5µm). V nezralém stavu mají různou velikost a neobsahují endospóry. Malé kvasinky doutníkovitého tvaru (2-6µm). Vyskytují se v exudátech jen v mlém počtu, proto se nesnadno v preparátech prokazují. Septované hyfy (2-3µm v průměru) obklopující poškozené chlupy, častější než hyfy jsou arthrospory, které v podobě pochvy obklopují poškozené chlupy. Nepravidelná granula, 0.5-3.0 mm a různé barvy - v bioptátech a seškrabech. V rozmačkaných granulech jsou stočeny hyfy. Sférické buňky jednotlivě nebo ve shlucích (4-12µm), tenkostěnná tělíska a tmavě- pigmentovaná tělíska. V kožních seškrabech mohou být prokázány hyfy ( průměr 2-6µm). KOH, calcofluor, PAS Velká sporangia (až 200-300µm v průměru) v nátěrech z nosních výtoků, polypů, v histologických řezech a bioptátech. Sporangia obsahují řadu endospór. Musí se odlišit od sférických útvarů Coccidioides immitis. Barvení PAS nebo hematoxilin - eozin (histologické řezy) Tenkostěnné, sférické adiaspory až 400µm v průměru v centru granulomatózní změny. Adiaspory obsahují obsahují mnoho drobných jader na periferii cytoplasmy, mají trojvrstev-nou stěnu s různou sílou vrstev. V hostiteli se nemnoží a musí se odlišit od útvarů Coccidioides immitis. 124
Obrázek č. 14 : Vybrané znaky ascomycet ( a vzdušné mycelium kolonie plísně, b kolonie kvasinek, c perithecium, d cleistothecium, e ascus, f jednoplášťová aska, g dvouplášťová aska, h až m anamorfní typy (anamorfóza postupná změna jednoho typu v druhý), n konidiofór, o konidiogenní buňky, p hyfy (vlákna), q septum s jedním pórem, r septum s více póry 125