Identifikace silic u vybraných druhů léčivých, aromatických a kořeninových rostlin Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Identifikace silic u vybraných druhů léčivých, aromatických a kořeninových rostlin Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Blanka Kocourková, CSc. Vypracoval: Pavel Vrtílek, DiS. Brno 2011

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Identifikace silic u vybraných druhů léčivých, aromatických a kořeninových rostlin vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne.... podpis zpracovatele.....

PODĚKOVÁNÍ Paní Ing. Blance Kocourkové, CSc. a Ing. Jitce Fojtkové, Ph.D. za cenné rady, odborné materiály, za spolupráci při samotném měření a pomoci při zpracování této bakalářské práce. Dále bych chtěl poděkovat své rodině za psychickou podporu při psaní.

ANOTACE Silice jsou produkty sekundárního metabolismu rostlin, různého chemického složení. Uplatňují se, jak v potravinářství, tak ve farmacii. Obsah silice v droze představuje kvalitativní jakostní požadavek pro jejich další užití. V práci jsou popsány techniky izolace (extrakce v Soxhletově extraktoru, organickými rozpouštědly, SFE, ASE, MAE, SPME, SDME, LPME, enfleuráž, destilace s vodní parou, lisování) a stanovení složení obsahu silic ze siličných rostlin (GC, HPLC, TLC). Z nichž jedinou oficiálně uznávanou v ISO normě a v Českém lékopisu je destilace s vodní parou. Experimentálně byl sledován obsah karvonu a limonenu v kmínové silici na odrůdách kmínu kořenného REKORD, PROCHAN, KEPRON. Vzorky kmínu se separovaly pomocí destilace s vodní parou a superkritické fluidní extrakce s následnou identifikací plynovou chromatografií s plamenově ionizačním detektorem. Obě metody vykazovaly srovnatelné výsledky. Klíčová slova: extrakce, destilace s vodní parou, plynová chromatografie, kmín ANNOTATION Essential oils are products of secondary metabolism of plants, products of different chemical composition. They are used both in food and in pharmaceutical industry. The essential oil content in the drug represents a qualitative requirement for further use. The paper describes the techniques of isolation (extraction in Soxhlet extractor, organic solvents, SFE, ASE, MAE, SPME, SDME, LPME, enfleurage, steam distillation, pressing) and determination of the composition of essential oil content of proper plants (GC, HPLC, TLC), of which only steam distillation is officially recognized in the ISO standard and the Czech Pharmacopoeia. Practically, the content of the carvone and limonene in caraway essential oil in caraway varieties RECORD, PROCHAN, KEPRON was monitored. Samples with caraway were subjected to separation by the steam distillation and supercritical fluid extraction and subsequent identification by gas chromatography with flame ionization detector. Both methods showed comparable results. Key words: extraction, steam distillation, gas chromatography, caraway

OBSAH 1 ÚVOD... 9 2 CÍL PRÁCE... 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 11 3.1 VLASTNOSTI SILIC... 11 3.2 CHEMICKÉ SLOŽENÍ SILIC... 12 3.3 VÝSKYT SILIC... 12 3.4 POUŽITÍ SILIČNÝCH DROG A SILIC... 13 3.5 ROZDĚLENÍ SILIC... 14 3.5.1 Silice tvořené převážně deriváty fenylpropanu... 14 3.5.2 Silice tvořené převážně acyklickými monoterpeny... 15 3.5.3 Silice tvořené převážně monocyklickými monoterpeny... 16 3.5.4 Silice tvořené převážně bicyklickými monoterpeny... 17 3.5.5 Silice tvořené převážně seskviterpeny... 17 3.5.5.1 Azulenogenní seskviterpeny... 18 3.5.5.2 Jiné seskviterpeny... 19 3.6 OBVYKLÉ METODY SEPARACE TERPENŮ A SILIC... 19 3.6.1 Destilace s vodní parou... 19 3.6.2 Lisování... 20 3.6.3 Extrakce... 20 3.6.4 Extrakce tuky neboli enfleuráž... 21 3.6.5 Extrakce organickými rozpouštědly... 21 3.6.6 Extrakce v Soxhletově extraktoru... 21 3.6.7 Nadkritická fluidní extrakce (SFE)... 22 3.6.8 Extrakce rozpouštědlem za zvýšeného tlaku a teploty (PSE)... 27 3.6.9 Mikrovlnná rozpouštědlová extrakce (MAE, MWAE)... 28 3.6.10 Mikroextrakce na tuhé fázi (SPME)... 29 3.6.11 Mikroextrakce kapalnou fází (LPME) spojená s hydrodifúzí... 31 3.6.12 Mikroextrakce jednou kapkou (SDME)... 31 3.7 OBVYKLÉ METODY STANOVENÍ SLOŽENÍ OBSAHU SILIC... 32 3.7.1 Chromatografické metody... 32 3.7.2 Plynová chromatografie (GC)... 33

3.7.3 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)... 34 3.7.4 Vysoceúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)... 34 4 METODIKA... 36 4.1 DESTILACE S VODNÍ PAROU... 36 4.2 SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE (SFE)... 37 4.3 IDENTIFIKACE GC/FID... 37 5 VÝSLEDKY A DISKUSE... 38 6 ZÁVĚR... 39 7 SEZNAM POUŽITÉ A CITOVANÉ LITERATURY... 40 8 SEZNAM OBRÁZKŮ... 45 9 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 46 10 PŘÍLOHY... 47

1 ÚVOD V dnešní uspěchané době je každý z nás ovlivňován různými civilizačními faktory. Ať se jedná o zhoršené životní prostředí, stres nebo civilizační choroby. Proto se hledají účinné prostředky, které by zlepšily, zmírnily a zharmonizovaly naše fyzické a psychické zdraví. Obracíme se proto k samotné matičce přírodě, z níž čerpáme přírodní produkty. K těm patří i léčivé rostliny a jejich produkty látkové přeměny, jako jsou silice. Vonné produkty přírodního charakteru odjakživa sloužily k podpoře dobrého zdravotního stavu, včetně psychického. Užívaly se vonné látky, jak živočišné, tak z rostlinné říše pro stimulaci dobrých pocitů, nálady a optimismu. Věda, jež je součástí alopatické medicíny, zabývající se využíváním vonných a těkajících látek, jejichž součástí jsou přírodní a syntetické rostlinné silice, se nazývá aromaterapie. V alopatické medicíně bez novodobého atributu aromaterapie slouží silice jako doplněk, pomocná látka či účinná složka vybraných léčiv nebo jsou součástí naší každodenní kuchyně jako koření (JURIČ, 2003). Každou silici lze charakterizovat dle barvy, vůně a koncentrace obsahových látek. Jde o složité organické sloučeniny, které se izolují destilací s vodní parou, lisováním, extrakcí s následnou separací pomocí plynové, kapalinové a tenkovrstvé chromatografie. V rostlinách působí kromě silic na lidský organismus pozitivně i další složky, z nichž můžeme jmenovat např. alkaloidy, hořčiny, saponiny, třísloviny, vitamíny, minerály. Jak už bylo řečeno, získávají se z rostlinných materiálů nejčastěji destilací s vodní parou, která je oficiální metodou uvedenou v Českém lékopisu. Tato metoda však není moc šetrná, je zdlouhavá a vyžaduje větší množství vzorku, i organického rozpouštědla, což má nepříznivý vliv na cenu a čas. Čím dál tím více se začínají prosazovat extrakční metody a specifické mikroextrakční techniky, které pracují s menší navážkou vzorku a spotřebou rozpouštědla než klasické extrakce. Navíc umožňují rychlejší separaci silice. Následně je provedeno analytické stanovení obsahu, kde se nejvíce využívá plynová chromatografie s plamenově ionizačním a hmotnostním detektorem, avšak lze využít i další možné alternativy. 9

2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce je prostudování dostupné literatury, která se týká metod izolace a stanovení složení silic známých siličnatých druhů léčivých rostlin. V laboratoři ústavu stanovit obsah silic ze vzorků druhů, které probíhají pod garancí vedoucí práce (kmín kořenný, koriandr setý, heřmánek lékařský, perila křovitá) pomocí destilace s vodní parou podle platného Českého lékopisu nebo ISO normy. U kmínu použít i superkritickou fluidní extrakci a ve spolupráci s Ústavem chemie a biochemie identifikovat složení kmínové silice. 10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Éterické oleje, těkavé oleje či olea aetherea nazýváme rostlinné silice, tedy vonné složky, které jsou obsaženy v různých částech tzv. siličnatých rostlin (kořenech, listech, plodech, květech atd.). Jde o produkty sekundárního metabolismu rostlin (HAY, 1993). Silice lze izolovat z rostlinného materiálu různými metodami. Nejrozšířenější je parní destilace neboli destilace s vodní parou. Známe i oleje z citrusových plodů, které se získávají lisováním za studena (LZS) nebo odstřeďováním. Rostlinný materiál se rozmělní a mechanicky lisuje. Tím se získá malé množství oleje v nejvyšší kvalitě (HÁDEK, 2006). Působením světla se často rozkládají, proto se uchovávají v dobře uzavřených lahvičkách z tmavého skla, aby byla zajištěna jejich ochrana před denním světlem a UV zářením. Zároveň se jedná o těkavé látky, které se skladují v uzavřených nádobách za nízkých teplot. Z chemického hlediska jde o velmi složité směsi, skládající se z jednotlivých biosubstancí terpenů, nejrůznějších alkoholů, esterů, fenolů, aldehydů, ketonů a mnoha dalších složek. Tyto látky komplexně vytvářejí éterický olej a ovlivňují svým biochemickým složením organizmus člověka (TOMKO, 1999). 3.1 Vlastnosti silic Z technologického hlediska a na základě jejich fyzikálních vlastností je lze definovat jako lipofilní těkavé látky organického původu, charakteristického zápachu a vůně (mátová silice), světlolomné (index lomu), opticky aktivní, hustoty obvykle nižší než voda (MELICHAROVÁ & POTRUSILOVÁ, 1993). Ve vodě jsou nerozpustné a s vodou nemísitelné. Dobře rozpustné jsou v organických rozpouštědlech (líh, chloroform, hexan, aceton). Charakteristickým znakem je také rozpustnost v lihu určité koncentrace, kdy Český lékopis uvádí pro každou silici poměr a koncentraci lihu, při němž se musí čiře rozpustit (ČESKÝ LÉKOPIS, 2009). Většina éterických olejů je téměř bezbarvá. Některé oleje se však vyskytují v různých barevných odstínech. K modrým například patří heřmánek nebo řebříček, k rudým pomeranč, k rezavým jasmín (HÁDEK, 2006). Heřmánková silice je po destilaci s vodní parou modrá, ale po extrakci např. superkritickou fluidní extrakcí je žlutá. 11

Čistotu silice znehodnocují polymerační a oxidační produkty při špatném uchovávání, přítomné stopy vody, olejů, těžkých kovů a cizích silic. Beze zbytku by měly vytěkat. Tmavnutí a pryskyřičnatění silic je způsobeno světlem, vzdušnou vlhkostí, teplem nebo oxidací vzdušným kyslíkem, kdy se mění barva a jejich vůně. Syntetizují se ve speciálních sekrečních buňkách (siličných kanálcích, trichomy) v různých orgánech rostlin (na povrchu květů, uvnitř plodů, semen, na listech, v nati) (HAY, 1993). 3.2 Chemické složení silic Terpeny, obvykle extrahované z rostlinných materiálů, jsou výrazně vonící těkavé látky (TOMKO,1999; VACEK,1995). Základem struktury terpenů je uhlovodík izopren. V přírodě se samostatně nevyskytuje, běžně však nacházíme jeho polymery, terpenické uhlovodíky a jejich kyslíkaté deriváty. Terpeny rozdělujeme podle počtu uhlíkových atomů na monoterpeny (C10), seskviterpeny (C15), diterpeny (C20), triterpeny (C30), tetraterpeny (C40) a polyterpeny (PAVEL, 1989). Některé ze složek silice jsou zastoupeny ve více rostlinách, např. (+)-limonen byl nalezen v pomerančové, citrónové a kmínové silici. (-)-limonen je obsažen v silici ze smrkového a jedlového jehličí. α-pinen je zase nejdůležitějším uhlovodíkem terpentýnové silice a spolu s β-pinenem tvoří základ terpentýnového oleje. Citronelol je obsažen v růžové a geraniové silici. Hlavní složkou růžového oleje je geraniol. Mentol je dominantní terpenoid máty peprné (ŠKÁRKA et al., 1987). Pro své antiseptické vlastnosti se přidává do zubní pasty. Řada seskviterpenů má zase funkci bioregulátorů, feromonů a kancerostatik (VACEK, 1995). Existují silice, u nichž převládá jediná vonná složka, např. hřebíčková, která je až z 90 % složena z eugenolu. Ve většině případů jde však o směs různých látek, které se podílí na vůni. Jejich struktura je po chemické stránce velice pestrá. Jsou tvořeny uhlovodíky, alkoholy, aldehydy, ketony, estery, oxidy a fenoly. 3.3 Výskyt silic Silice se v přírodě vyskytují v mnoha čeledích zejména v Pinaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Geraniaceae, Rutaceae, Apiaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Iridaceae, Zingiberaceae (MINAŘÍK et al., 1979). Vyskytují se v různých částech rostlin: v květech, plodech, listech, nati, kůře, oplodí i kořenech. Ukládají se v žláznatých chlupech, papilách, žláznatých buňkách, nádržkách, kanálcích a mezibuněčných 12

prostorách, odkud se při rozrušení rostlinných orgánů uvolňují. Silice se vyskytují v rostlinných materiálech jak čerstvých, tak sušených. Sbírá se květ, plod, list, stonek, nať, kořen, kůra nebo celá rostlina. Jednotlivé části rostliny se sbírají v době, kdy obsah účinných látek je co nejvyšší. Plody se sbírají obvykle na podzim a byliny na jaře. Na obsah účinných složek má vliv lokalita, vláha, roční období, délka dne, odrůda, hnojení, ochrana a celá řada dalších faktorů (SEDLÁKOVÁ, 2003). 3.4 Použití siličných drog a silic Jejich použití je velice široké. Uplatňují se jednak v potravinářství, v kosmetickém průmyslu, ve farmacii a nalezneme je v každé domácnosti. Při vnitřním podání silice dráždí i chuťové a čichové receptory sliznic zažívacího traktu, čímž zvyšují tvorbu zažívacích šťáv a zlepšují trávení. Potravinářský průmysl využívá siličné rostliny jako koření, v nápojích a jako ochucovadla pokrmů. Citrusové silice (látky myrcen, limonen), silice z černého čaje (bergamot) a řada dalších slouží k přípravě nápojů nealkoholických, tak alkoholických (UHLÍŘOVÁ, 2008). K ochucování pokrmů se využívají často i silice česnekové a hořčičné, obsahující alifatické sirné sloučeniny (izothiokyanáty u hořčice, dialyldisulfidy u česneku) (MINAŘÍK et al., 1979). Siličné drogy se používají v potravinářské technologii i při výrobě aromat (VOLDŘICH, 2009). Farmacie využívá silice pro přípravu léčiv a doplňků stravy. Ze silice izolovaný mentol, kafr, terpentýnová silice, jalovcová silice, levandule, rozmarýn mají dráždivý i prokrvující účinek na pokožku, tak derivační účinek, kdy bolest rozptylují či odvádějí. Protizánětlivě působí heřmánek, řebříček a šalvěj. Pro podporu a regulaci trávení nebo jako léčivo odstraňující plynatost můžeme použít např. silice majoránky, fenyklu, kmínu, koriandru, hřebíčku, skořice, muškátu, máty peprné, tak i oplodí citrusů, hlavně z pomerančovníku hořkého. Rozdělení do terapeutických skupin: - dráždidla kůže (obsahují více karvakrolu, cineolu, citronelalu, pinenu a limonenu, vyvolávají zčervenání a pocit tepla, Oleum terebithinae, Oleum galtheriae, Oleum rosmarini, Kafr, Tymol, součástí mastí a liniment proti revmatickým a neuralgickým bolestem); - antiflogistika (Oleum chamomilae a jeho obsahové látky, např. β-farnesen, chamazulen); 13

- expectorancia (k inhalaci se používá Oleum pini pulmilionis, Oleum eucalypti, Oleum menthae piperitae, perorálně: Herba a extrakt thymi, Fructus a oleum foeniculi, Fructus a oleum anisi, taky mají antiseptické působení); - stomachika aromatika, karminativa (Menthae folium, Origani herba, Carvi fructus, Anisi fructus, Foeniculi a Coriandri fructus, Curcumae radix); - diuretika (Juniperi fructus a oleum, Levistici radix, Petroselini fructus, pozor na toxické dávky, které způsobují anurii); - emenagoga a abortiva (apiol, Myristicae semen, Caryophylli flos, Crocus, Lauri folium, Cinnamomi cortex, toxické dávky, ale způsobují záněty v pánevních orgánech a GIT jsou životu nebezpečné); - antiseptika, desinficiencia, antiparasitika (drogy obsahující karvakrol, cineol, thymol, eugenol); - anthelminthika (Chenopodii oleum, askaridol, santhonin, thymol); - insekticida (rod Chysanthemum); - repelenty (Cassiae oleum, kafr, Therebinthinae oleum, Cinnamomi oleum, Menthae oleum, Citronellae oleum) (TOMKO, 1999). 3.5 Rozdělení silic 3.5.1 Silice tvořené převážně deriváty fenylpropanu Nejvýznamnější sloučeniny tohoto typu jsou skořicový aldehyd, hlavní složka silice skořicové, eugenol silice hřebíčkové, anetol, anýzový aldehyd a fenikulin silice anýzové a fenyklové, asaron silice puškvorcové a apiol silice petrželové. Eugenol a anetol mají výrazné antiseptické účinky. Anetol může být výchozí látkou k syntéze některých důležitých léčiv nebo estrogenně účinného dietylstilbestrolu. Skořicová silice je slabě žlutá tekutina skořicové vůně. Získává se z usušené kůry stromu skořicovníku ceylonského (Cinnamomum ceylanicum), která obsahuje až 2 % silice tvořené až 75 % skořicového aldehydu, až 8 % eugenolu a terpenických látek. Kůra musí obsahovat nejméně 65 % skořicového aldehydu. Používá se jako stomachikum a dochucovadlo. Hřebíčková silice se získává z usušených květních poupat stromu hřebíčkovce kořenného (Jambosa caryophyllus). Droga obsahuje až 20 % silice, z níž až 95 % ji tvoří eugenol, dále karyofylen a aceteugenol. Silice se užívá jako antiseptikum dutiny ústní ve formě ústních vod a droga jako koření. 14

Anýzová silice je bezbarvá nebo nažloutlá světlolomná tekutina nebo krystalická hmota nasládlé chuti. Získává se destilací usušeného zralého plodu dvounažky bedrníku anýzu neboli anýzu obecného (Pimpinella anisum). Obsahuje až 5 % silice, z nichž až 90 % je zastoupen anetol. Droga musí obsahovat nejméně 1,5 % silice. Silice i droga se užívá jako karminativum, stomachikum a expektorans se spasmolytickým účinkem. Fenyklová silice je bezbarvá nebo nažloutlá, nasládle aromatické, později hořké chuti. Získává se z usušených zralých plodů nažek jednoleté a vytrvalé byliny fenyklu obecného (Foeniculum vulgare). Až 6 % silice obsahují plody, z nichž až 60 % je zastoupen anetol. Dále ji tvoří fenikulin, karyofylen, fenchon, α-pinen. Fenykl se užívá jako karminativum, laktagogum, expektorans, v likérnictví a v potravinářství jako koření. Droga musí obsahovat nejméně 3 % silice. Z usušeného kořene dvouleté byliny petržele kadeřavé (Petroselinum crispum) se získává až 0,3 % silice, která je tvořena až z 80 % apiolem, dále myristicinem a flavonovým glykosidem apiinem. Musí obsahovat alespoň 0,1 % silice. Droga se užívá jako diuretikum, protože dráždí ledviny a dělohu, ale nejčastěji se spotřebovává jako zelenina do polévek a salátů. Usušený oddenek puškvorce obecného (Acorus calamus) obsahuje až 4 % silice tvořené převážně asaronem, některé variety obsahují i terpeny (geranylacetát, geraniol). Oddenek obsahuje i hořčiny a třísloviny, které mají pozitivní účinek na zažívání. 3.5.2 Silice tvořené převážně acyklickými monoterpeny Z těchto látek se v silicích nejčastěji vyskytují bezkyslíkaté myrcen, ocimen, alkoholy linalool, geraniol, citronelol a nerol, aldehydy citral a citronelal. Látky tohoto typu jsou hlavními složkami silice geraniové, citronelové, levandulové, koriandrové, meduňkové a kosatcové. Mají příjemnou vůni, a proto se používají nejčastěji jako korigencia vůně. Geraniol má i výrazný anthelmintický účinek. Linalool a geraniol jsou výchozími látkami pro přípravu citralu, vhodného pro výrobu vitaminu A. Citronelal slouží k syntéze mentolu. Citronelol je dobré antioxidans a antiseptikum v zubním lékařství. Citronelová silice se získává destilací trav z rodu Cymbopogon. Je bezbarvá nebo nažloutlá s charakteristickým citrónovým zápachem a aromatickou chutí. Silice je součástí derivačních, karminativních a stomachických přípravků. Z různých druhů pelargónií se získává bezbarvá, nazelenalá nebo nažloutlá tekutina příjemné růžové vůně, neboli geraniová silice. 15

Z levandulových květů levandule lékařské (Levandula officinalis), která obsahuje až 3 % silice, se izoluje levandulová silice. Má dobré derivační účinky, zvláště antirevmatické. Z usušených zralých plodů koriandru setého (Coriandrum sativum) se získává koriandrová silice, která obsahuje až 70 % linaloolu, geraniol, p-cymen, felandren. Má dobrý karminativní účinek a používá se jako koření. 3.5.3 Silice tvořené převážně monocyklickými monoterpeny Patří sem např. bezkyslíkaté p-mentan, limonen citrusových silic, α-terpinen, p-cymen, alkoholy a fenoly mentol silice mátové, a-terpineol, karvakrol a tymol silice tymiánové, ketony menton, karvon silice kmínové, diosfenol listů buko, oxidy a peroxidy mentofuran, cineol eukalyptové silice, askaridol silice merlíkové. Některé z nich mají dobré anthelmintické účinky (cineol, mentol, askaridol, p-cymen, tymol, karvakrol). Mentol dráždí kůži a sliznici, zejména nervová zakončení vnímající chlad, a vyvolává proto chladivý pocit. Je dobrým antiseptikem žlučníku, neboť je žlučí vylučován. Dobré antiseptické účinky má i cineol, tymol a karvakrol. Antiseptikum ledvin a močových cest je diosfenol vylučovaný močí. Destilací čerstvě kvetoucí natě máty peprné (Mentha piperita) se získává silice obsahující přes 50 % mentolu, jeho estery s kyselinou octovou a valerovou, menton, felandren, pinen, cineol, jasmon a další. Rozeznává se mentol levotočivý a syntetický (tzv. racemický). Za obyčejné teploty sublimuje. Listy blahovičníku (eukalyptu) kulatoplodého obsahují až 3 % eukalyptové silice, která je tvořena až z 85 % cineolem. Čistý cineol se ze silice získává obvykle vymrzáváním. Kmínová silice (Oleum carvi) se získává destilací s vodní parou ze zralých dvounažek kmínu kořenného (Carum carvi). Kmín obsahuje 3 7 % silice jejíž hlavní složkou je D-karvon (60 %) a D-limonen (40 %), malé množství dihydrokarvonu, karveolu. V průběhu zrání se zvyšuje obsah karvonu na úkor limonenu podle schématu: HO O O-P HO O limonen geranylfosfát karveol dihydrokarveol karvon dihydrokarvon 16

Užívá se jako karminativum se spasmolytickými vlastnostmi, laktagogum, koření. Silice v plodě kmínu kořenného obsahuje: karvon 45 79 %, limonem až 35 %, vláknina 13 19 %, tuk 13 21 %, N-látky 25 36 %, popeloviny 5 7 %, bez dusíkatých extraktivních 5 18 %, vosk 1,5 %, voda 9 13 %. Od roku 1996 existuje v České Republice sdružení Český kmín, které se zabývá pěstováním a šlechtěním odrůd. Římský kmín pro svoji hořkou chuť a silné aroma se stal populární složkou koření kari. V minulosti se také používal k léčení koliky a nadýmání. Dnes je jeho použití omezeno na veterinární praxi (KŘESŤANOVÁ et al., 1997). 3.5.4 Silice tvořené převážně bicyklickými monoterpeny Bicyklické siličné monoterpeny jsou odvozeny od tří základních typů: pinanového, kamfanového a tujanového. K tujanovému typu patří bezkyslíkatý sabinen, alkohol tujol a keton tujon, obsažený v silicích některých rostlin čeledi Asteraceae (pelyněk, vratič) nebo Lamiaceae (yzop, šalvěj), ale i některých jehličnanů. Tujon má anthelmintické účinky. Je však značně toxický a může vyvolat psychické poruchy, avšak u šalvějové natě (silici) nebyla toxicita prokázána. Typ pinanový tvoří bezkyslíkatý α a β-pinen vyskytující se např. v terpentýnové silici získané z terpentýnového balzámu destilací. Autooxidací se v ní vytvářejí snadno dráždivé peroxidy pinenů. Do kamfanového typu patří např. alkohol borneol a jeho estery (bornylacetát, bornylpropionát, bornylkapronát) v kosodřevinové silici a keton kafr získaný ze dřeva kafrovníku nebo připravený synteticky. Rozdílná teplota tání rozlišuje přírodní kafr od kafru syntetického. Typický zápach kozlíkové silici dává bornylester kyseliny valerové, ale i pyridinové alkaloidy, které spolupůsobí jako látky vábící kočky. Sedativní účinek je podmíněn především přítomností triesterů polyhydroxycyklopentapyrenů, zvaných valepotriáty, např. valtratum. 3.5.5 Silice tvořené převážně seskviterpeny Siličné seskviterpeny jsou látky různé struktury, monocyklické (zingiberen, kurkumen, bisabolol, turmeron, humulen), acyklické (farnesol) i bicyklické (chamazulen, karyofylen). 17

3.5.5.1 Azulenogenní seskviterpeny Azuleny jsou látky s výrazným protizánětlivým účinkem. K terapeuticky využívaným drogám patří květ heřmánku pravého a římského, nať a květ řebříčku obecného, nať pelyňku pravého, oddenky a kořeny omanu pravého. Azuleny jsou v rostlinách přítomné jako proazuleny (azulenogeny). Destilací s vodní parou přecházejí v modře zbarvené azuleny; v guajakové pryskyřici obsažený guajol přechází v guajazulen, proazulen heřmánku a řebříčku matricin přechází destilací přímo v chamazulen. Není však vyloučeno, že tento děj se zvolna uskutečňuje i při obyčejné teplotě. Proazulen pelyňku artabsin přechází přes chamazulenogen v chamazulen teprve v kyselém prostředí. I další proazuleny pelyňku absintin a anabsintin přecházejí přes chamazulenogen v chamazulen. Proazuleny jsou účinné hořčiny, zvláště proazuleny pelyňku. V nati benedyktové je obsažena hořčina azulenového typu knicin. Na rozdíl od pelyňku se benedikt řadí mezi hořčiny, protože obsahuje jen zanedbatelné množství silice. V potravinářství se pelyněk využívá k výrobě absinthu. Heřmánkový modrý éterický olej z Chamomilla recutita Vůně: příjemná, silně bylinná Hlavní složky: seskviterpeny chamazulen, bisabolol, bisaboloxid, izobutylangelát, matricin Aromaterapeutické účinky: má protizánětlivé, antialergické, antiseptické a uklidňující účinky. Podporuje hojení kůže, tlumí bolest, stimuluje zažívání (podporuje trávení a chuť k jídlu, uvolňuje při nadýmání), působí proti depresím a utišuje pokožku. Je součástí masážních a koupelových přípravků (HÁDEK, 2006). Heřmánkový žlutý éterický olej z Ormenis multicaulis Vůně: příjemná, teplá, bylinná Hlavní složky: pinen, camphen, limonen, germacren, bisabolen, santalinaalkohol, bornylacetát Aromaterapeutické účinky: antimikrobiální, uklidňující, antialergické. V kosmetice je vhodný na pleť citlivou, podrážděnou, zánětlivou až aknózní. Najde uplatnění při neurodermatitidě, ekzémech včetně atopického, jako,,neurotonikum (HÁDEK, 2006). Obecně heřmánkový květ obsahuje až 1 % modré silice, z níž 20 % tvoří modrý chamazulen. Obsah silice má být nejméně 0,4 % a chamazulenu nejméně 0,03 %. V nadestilované silici lze chamazulen stanovit kolorimetricky. 18

3.5.5.2 Jiné seskviterpeny Do této kategorie můžeme zařadit drogy jako usušenou samičí šištici chmelu otáčivého, z níž obsah silice je zhruba 0,5 %, tvořený až z 20 % pryskyřičnými látkami a až 5 % tříslovinami. Dále kurkumový kořen, obsahující až 5 % silice tvořené až 60 % seskviterpenických ketonů turmeronů, zinziberenem. V potravinářství slouží k výrobě kari koření a k obarvování těstovin. Zázvorový kořen obsahuje až 30 % silice. Zázvor dráždí nervová zakončení vnímající teplo, a proto vyvolává pocit pálení. Používá se při dyspepsii, jako stomachikum a karminativum, dnes převážně v potravinářství např. k výrobě zázvorového piva (TOMKO,1999; MINAŘÍK et al., 1979). 3.6 Obvyklé metody separace terpenů a silic K separaci těkavých složek z rostlinného materiálu lze využít destilaci s vodní parou podle ČSN 58 0110 (SEDLÁKOVÁ et al., 1998, 2001) a ČSN 6571 (ČSN 58 0110; ČSN 6571), rychlou parní destilaci (rapid steam distillation) (MUZIKA et al.,1990), extrakci hexanem (BOUWMEESTER, DAVIES & TOXOPEUS, 1995), zrychlenou extrakci rozpouštědlem (ASE) a extrakci v mikrovlnné peci (SCHAEFER & HANOVER, 1986). Z plynného prostředí lze těkavé složky izolovat také mikroextrakcí na pevném sorbentu (SPME) s následnou tepelnou desorpcí s přímým dávkováním na kapilární GC kolonu (KOVAR & BOCK, 1983; ADAM et al., 2005, 2009) a dalšími metodami (ADAM et al., 2008). 3.6.1 Destilace s vodní parou Destilace je fyzikální proces dělení látek na základě jejich rozdílnosti bodů varu. Látka o nižším bodu varu se přenáší do plynného skupenství a chladičem se převede zpět do skupenství kapalného. Většinou se tímto způsobem čistí látky, které jsou ve vodě málo rozpustné a při bodu varu vody mají znatelný tlak nasycených par. Páry obou nemísitelných složek tvoří při destilaci azeotrop, který má nižší bod varu než níže vroucí látka. Tím lze za teploty nižší než 100 C předestilovat látky o bodu varu podstatně vyšším a vyhnout se jejich zahřívání na vysokou teplotu, při níž by se mohly rozkládat. Destilaci s vodní parou lze provést třemi způsoby: 1) Destilace, při níž se materiál vaří s vodou. 2) Destilace parou bez odděleného zdroje páry. 3) Destilace s odděleným zdrojem páry (VOLDŘICH, 2009). 19

3.6.2 Lisování Využívá se výhradně k získávání silic z kůry citrusových plodů. Vnější vrstva slupky tzv. flavedo je před lisováním plodu ostrouhána, spláchnuta proudem vody a po scezení je lisována. Silice se oddělí odstředěním na odstředivce (VOLDŘICH, 2009). 3.6.3 Extrakce Extrakce je separační metoda, při které přechází látka či látky z jedné fáze do druhé na základě rozpustnosti v jednotlivých fázích. Jde o přechod složky mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi (MERGL & KOZÁČKOVÁ, 2000). Extrakční soustavy se dělí podle skupenství: a) z pevné fáze do kapaliny, kdy se z tuhého materiálu rozpouští ve vhodném rozpouštědle požadovaná složka, zatímco ostatní složky ne. Využívá se především Soxhletova extrakce. b) z kapaliny do kapaliny; tato metoda je založená na rozdělovací rovnováze v soustavě dvou nemísitelných kapalin. Dosažení rovnovážného stavu je umožněno dokonalým vzájemným stykem obou fází na co největší ploše. Rychlost ustanovení rovnováh lze zvýšit protřepáním a opětovným usazením. Po ustanovení rovnováhy je koncentrace látky v obou fázích vyjádřena distribuční konstantou: K D = c org /c aq, kde c org a c aq jsou rovnovážné látkové koncentrace složky v organickém rozpouštědle a ve vodě. Konstanta charakterizuje látku v systému voda organické rozpouštědlo při určité teplotě a tlaku. Čím je hodnota vyšší, tím je větší podíl složky v organickém rozpouštědle a naopak. c) z kapaliny do pevné fáze extrakce pevnou fází (SPE) (KARLÍČEK et al., 2001). Extrakce vonných a chuťových látek probíhá za nižších teplot než destilace. Kromě velmi těkavých látek přecházejí při tradičních postupech extrakce do extraktu i další extrahovatelné látky. Extrahované silice mají hnědou nebo zelenou barvu, po naředění se jejich vlastnosti více blíží vůni a chuti původních surovin než u destilovaných silic. Tradiční metody extrakce jsou nákladnější než destilační, proto se tato technika používá pro získávání hodnotnějších silic, zejména z květů rostlin (UHLÍŘOVÁ, 2008; LEHOTAJ, 2009). Podstatným rozdílem je také mnohem menší navážka vzorku než je tomu u destilace s vodní parou. Toho se využívá hlavně v případě, že úroda dané odrůdy není velká. 20

3.6.4 Extrakce tuky neboli enfleuráž Extrakce tuky patří ke tradičním postupům získávání extraktů vonných látek zejména z květů rostlin (např. Rosae oleum, jasmínová silice). Provádí se za studena, zpravidla bezpachým vepřovým sádlem nebo za tepla macerací horkým tukem. Při prvním způsobu se minerální tuk nanáší v tenké vrstvě na obě strany skleněných desek nebo plátna uchycených ve dřevěných rámech. Na vrstvy tuku se položí nebo nasypou květy určené k extrakci a rámy se naskládají na sebe. Tuk postupně pohlcuje těkavé látky z květů. Tvrdí se, že květy ještě několik hodin po utržení žijí a produkují silici, proto je výtěžek takovéto extrakce vyšší než u jiných způsobů extrakce. Tuku nasycenému silicí se říká pomáda, uvádí se číslo - počet násad květů. Po opakování určitého počtu násad je tuk silicí nasycen a další těkavé látky se v tuku nerozpouští. Pomáda je poté extrahována ethanolem, alkoholický výluh se vymrazí a je odfiltrován tuk. Ethanol je oddestilován a výsledkem je tzv. silice absolutní neboli absol. K extrakci za normální teploty může být použit i rostlinný olej (olivový), květy se macerují v oleji, jsou odfiltrovány a po opakování několika násad je postup stejný jako v případě tuku. Pro zrychlení procesu se používá také extrakce olejem za vyšších teplot, např. 500 C. Enfleuráž se uplatňuje ve voňavkářství při výrobě parfémů, kdy je požadavek na kvalitní čistou silici (VOLDŘICH, 2009). 3.6.5 Extrakce organickými rozpouštědly Extrakce organickými rozpouštědly (petroletherem, benzenem, hexanem) je častější než enfleuráž. Opět se provádí v extraktorech. Po odpaření rozpouštědla výsledná silice obsahuje také vosky a další v alkoholu nerozpustné složky. Říká se jí konkrétní silice neboli konkrét, která se dále zpracovává na absolutní silici rozpuštěním v ethanolu za tepla filtrací a odpařením (MINAŘÍK et al., 1979). Kromě silic jsou získávány i další složky k výrobě aromat, jako jsou přírodní pryskyřice (fixátory), které zpomalují odpařování silice (VOLDŘICH, 2009). 3.6.6 Extrakce v Soxhletově extraktoru Jde o kontinuální extrakci látky, prováděnou na Soxhletově přístroji, který se skládá ze tří částí: destilační baňky, extraktoru a zpětného vodního chladiče. Mletý nebo drcený vzorek drogy se vloží do extrakční papírové patrony. Ta se vloží do extraktoru a překryje kouskem vaty. Destilační baňka s extrakčním činidlem se umístí do vodní lázně a zahřeje se k varu. Páry rozpouštědla stoupají boční trubičkou 21

do chladiče, kde dochází ke kondenzaci par a zkondenzovaný extrakční solvent kape na patronu se vzorkem a promývá ji. V místě, kde je umístěna patrona, se postupně shromažďuje zkondenzované extrakční činidlo. Až se prostor naplní, odteče přepadovou trubičkou směs extrakčního činidla a vyextrahované látky zpět do destilační baňky. Po skončení extrakce se vyextrahovaná látka zakoncentruje za vyšší teploty pomocí rotační vakuové odparky (DOUBRAVA, KOŠTÍŘ & POSPÍŠIL,1984). Samotná extrakce trvá několik hodin, je pod bodem varu rozpouštědla a je při ní zapotřebí většího množství extrakčního rozpouštědla. Jako extrakční činidlo při extrakci silic se používá acetaldehyd. Podmínkou je, aby rostlinná droga byla dobře namletá na drobnější částice a byla suchá, z důvodu dobrého prostupu extrakčního činidla vzorkem. Kromě klasické Soxhletovy extrakce lze provést i její modifikaci, kdy je vzorek ponořen do solventu v prostoru mezi extrakční nádobou a chladičem. Vzorek je extrahován při teplotě varu rozpouštědla (UHLÍŘOVÁ, 2008). 3.6.7 Nadkritická fluidní extrakce (SFE) Moderní technologie získávání vonných a chuťových látek využívají extrakci kapalinami v superkritickém stavu (nejčastěji se používá CO 2, ale také N 2 O, propan, methanol, amoniak nebo toluen). V případě CO 2 probíhá extrakce zkapalněným plynem za podmínek nad kritickou teplotu a kritický tlak (pro CO 2 31 C, 7,38 MPa). Nadkritický CO 2 je nepolární rozpouštědlo a používá se k extrakcím nepolárních látek. U oxidu dusného je kritická teplota 36,5 C a kritický tlak 7,28 MPa. Prakticky se však pracuje s tlaky 8 až 40 MPa a teplotami 60 až 150 C (KLOUDA, 1996). Obecným problémem oxidu uhličitého a oxidu dusného je jejich nízká polarita. Se stoupající polaritou analytů, totiž klesá jejich rozpustnost. Tento problém se obchází přídavkem malého množství polární organické látky zvané modifikátor (cca 10 objemových %) do extrakční cely (dodávání modifikátoru in situ) nebo do proudu nadkritického CO 2 (dodávání modifikátoru on-line). Mezi běžně používané modifikátory patří např. methanol, ethanol, kyselina mravenčí nebo octová, acetonitril, toluen, hexan, sirouhlík nebo voda (SEDLÁKOVÁ, 1997). Volba optimálního modifikátoru a jeho množství závisí na mnoha faktorech, které ovlivňují samotnou extrakci - na tlaku a teplotě, matrici, typu extrahované látky a použité nadkritické tekutině. Použití modifikátorů při extrakci látek může vést k překvapivému zvýšení účinnosti: např. přídavek 3,5 mol % methanolu 22

k nadkritickému CO 2 zvýší rozpustnost kyseliny 2-aminobenzoové o 620 % (DOBBS et al., 1987). Vhodné spektrum analytů bývá charakterizováno takto: nepolární lipofilní látky, např. uhlovodíky, ethery, estery, ketony, polyaromatické uhlovodíky (PAH) a polychlorované bifenyly (PCB) do molekulové hmotnosti 300 400 g/mol lze snadno extrahovat v tlakovém rozsahu do 30 MPa. Polární funkční skupiny (-OH, -COOH) extrakci znesnadňují nebo znemožňují. Uspokojivě lze extrahovat deriváty benzenu s maximálně třemi hydroxylovými skupinami. Neextrahovatelné jsou v rozsahu do 40 MPa polární látky, např. cukry, glykosidy, aminokyseliny a polární proteiny: lecitin, celulóza, polyterpeny a syntetické polymery. Nepolární oligomery jsou rozpustné pouze nepatrně (VENTURA, 1995). Volbou podmínek, případně přídavkem dalších látek, lze upravovat vlastnosti (polaritu) rozpouštědla a ovlivnit složení extraktu. Díky snadnému odpaření rozpouštědla nehrozí rezidua jako v případě klasické extrakce organickými látkami. Technologie je výhodná i při nanášení vonných a chuťových látek na různé nosiče. Na trhu jsou k dispozici přípravky nepolárních látek zakotvených na polysacharidických nosičích, které jsou lehce dispergovatelné ve vodě a lze je snadno a standardně dávkovat (silice, extrakty koření, včetně v tucích nerozpustných barviv, např. extrakt papriky). Nadkritickým stavem rozumíme takový stav hmoty, kdy její tlak a teplota jsou vyšší než odpovídající kritické hodnoty (p k, T k ). V tomto stavu nelze rozlišit kapalinu od plynu, používá se tedy termínu tekutina. Nadkritická oblast je názorně vyznačena na fázovém diagramu v p-t souřadnicích (Obrázek 1) (SEDLÁKOVÁ, 2003). Křivka T r - K vyznačuje stav rovnováhy plynné a kapalné fáze. Kapalná fáze přechází vlivem teplotní expanze do oblasti nižších hustot, plynná fáze přechází do oblasti vyšších hustot vlivem rostoucího tlaku. Kritický bod K se nachází na konci výparné křivky (jež označuje rovnováhu plynné a kapalné fáze), je charakterizován kritickým tlakem p k a kritickou teplotou T k a kapalina v tomto bodě kontinuálně přechází v nadkritickou tekutinu. Kromě své vysoké rozpouštěcí schopnosti mají nadkritické tekutiny (Supercritical Fluids, SF) několik vlastností, které je činí užitečnými pro rychlou a kvantitativní extrakci organických látek z reálných vzorků. Mají tzv. dualistickou povahu - některé jejich vlastnosti se blíží vlastnostem plynů (viskozita, difusivita), jiné vlastnostem 23

kapalin (solvatační schopnosti). Hustota nadkritické tekutiny je vyšší než hustota plynu, bývá srovnatelná s hustotami kapalin (PLANETA, 1993). Díky nízké viskozitě a vysoké difusivitě v sobě tedy SF spojují solvatační sílu kapalin s výhodnými podmínkami pro přestup hmoty v průběhu extrakce, což je činí zajímavými extrakčními médii. Nižší viskozita, vyšší difúzní koeficient a nulové povrchové napětí dělají z nadkritické tekutiny velmi silné extrakční činidlo, neboť umožňují vyšší rychlost transportních dějů než kapaliny (CHURÁČEK, 1992). Extrakce nadkritickou tekutinou je díky těmto vlastnostem rychlejší a účinnější než klasická kapalinová extrakce v důsledku rychlejší a dokonalejší penetrace extrakčního média do pevné matrice (CAMEL, TAMBUTE & CAUDE, 1993). Rozpustnost látky v nadkritické tekutině závisí na tlaku a hustotě tekutiny. Ta závisí na teplotě; rozpustnost je tedy funkcí tlaku a teploty. Nejdůležitějším parametrem je tlak. S rostoucím tlakem vzrůstá hustota nadkritické tekutiny a tím i její solvatační schopnost, ale s rostoucí teplotou hustota nadkritické tekutiny i její solvatační schopnost klesá. Volbu nadkritické tekutiny ovlivňují především tři faktory: rozpustnost analytu, difúze a matrice. Extrahovaná látka musí být v daném solventu dostatečně rozpustná (za příslušných extrakčních podmínek: teploty, tlaku, eventuelně s přídavkem modifikátoru). Stanovovaná látka musí být z matrice dostatečně rychle transportována. Časový průběh difúze závisí na množství vzorku a na typu matrice. Extrakci analytu z matrice negativně ovlivňuje adsorpce molekul na povrchu pevné matrice, záchyt analytu ve složitých organických molekulách matrice (aktivní centra) a průchod molekul analytu stěnami buněk biologické matrice. Nadkritické tekutiny mají téměř nulové povrchové napětí a do vzorku pronikají snadněji než jiná kapalná rozpouštědla. Difusivita závisí na teplotě a tlaku nadkritické tekutiny. S rostoucí difusivitou roste extrakční rychlost. Viskozita závisí na teplotě a tlaku. S rostoucí teplotou viskozita klesá. Účinnost SFE ovlivňuje tlak, teplota a doba extrakce, průtoková rychlost tekutiny a velikost namletého tuhého vzorku. Dochází k tzv.,,přenosu hmoty analytu ze vzorku do nadkritické tekutiny. Analyt se jímá v extrakční nádobě, do níž je veden restriktorem. Při průchodu nadkritické tekutiny obohacené o analyty restriktorem dochází k poklesu tlaku, extrakční médium se zplyní a samo vytěká do ovzduší. Separace analytu od nadkritické tekutiny se tedy nemusí provádět. 24

Záchyt analytu se u nadkritické fluidní extrakce provádí v zásadě dvěma způsoby: proud plynného CO 2 na konci restriktoru je veden do kapaliny v záchytné nádobce nebo do záchytné kolonky se sloupcem sorbentu. Záchytné zařízení musí obsahovat dostatečné množství solventu či sorbentu potřebné za daných podmínek (teplota, průtok CO 2, výška záchytného sloupce) pro kvantitativní přestup hmoty z expandované nadkritické fáze (v průběhu posunu restriktorem dochází k poklesu tlaku směsi nadkritická tekutina/analyt), na konci z restriktoru proudí plynný CO 2 do záchytného média bez možnosti úniku části analytů ze záchytného zařízení. Zároveň nesmí docházet ani k degradaci analytu. Záchytný systém by měl produkovat extrakty přímo použitelné pro analýzu, tedy např. roztoky v rozpouštědlech vhodných pro nadkritickou kapalinovou chromatografii (SFC) nebo plynovou chromatografii (GC), aby se předešlo ztrátě těkavých analytů při odpařování záchytného solventu a jejich ulpívání na skle odpařovací baňky při opětném rozpouštění před nástřikem na kolonu. Dále by nemělo být nutné analyt předčišťovat a zakoncentrovávat. V neposlední řadě je při použití delších extrakčních časů nezbytné zabránit odpařování zachycených analytů ze systému a tzv. stripovacímu efektu (molekuly analytu zachycené v kapalině jsou strhávány proudem plynného CO 2 a spolu s ním unášeny ze systému). Vyskytla se celá řada způsobů, jak výše uvedeným nevýhodám zamezit nebo je alespoň omezit. I v případě velmi těkavých analytů (např. benzen, toluen, xylen) může být záchyt proveden kvantitativně do běžné záchytné nádobky se 4 ml rozpouštědla, aniž by docházelo k odpařování analytu nebo k jeho stripování proudem plynného CO 2 (při průtoku 260 ml (g)/min na konci restriktoru) při teplotě 20 C až 30 C s výtěžkem 94 100 % při záchytu do chloroformu a 92 100 % pro záchyt do méně vhodných rozpouštědel (ether, acetonitril). U čerstvě kontaminovaných vzorků je tato metoda velmi efektivní, u přírodních vzorků však může nízká teplota záchytného rozpouštědla vést k ucpávání restriktoru, zvláště za předpokladu, že vzorek obsahuje stopy vody. V experimentálním uspořádání je vzorek umístěn v extrakční cele do níž se shora přivádí extrakční médium. Existuje buď statický nebo dynamický režim extrakce. U statického provedení se po určitou dobu nadkritický solvent sytí analytem: výhodou je nižší spotřeba solventu, vymývá se méně balastních látek a působení in-situ modifikátoru je delší. V dynamickém režimu se cela promývá proudem nadkritické tekutiny: rovnováha se posunuje ve směru extrakce, což je účinnější, ale nevýhodou 25

je vyšší spotřeba a vyšší koncentrace balastních látek, vymytí in situ modifikátoru a riziko stripování analytu ze záchytného solventu na sorbent nebo do kapaliny (KLEJDUS, 2010). Mezi nevýhody patří: - malá navážka vzorku u nedostatečně homogenních vzorků zvyšuje RSD - bez použití modifikátorů jsou tyto metody vhodné pouze pro nepolární látky - při záchytu na sorbent kondenzující modifikátor vymývá analyty ze sorbentu - při záchytu do kapaliny může docházet ke stripování analytu ze záchytného solventu - ucpání restriktoru vznikem klastrů analytu při snížení rozpustnosti CO 2 Mezi výhody patří: - nízká viskozita a vysoká difuzivita nadkritické tekutiny - solvatační schopnosti se mění s tlakem a teplotou, za vhodných podmínek je dosažena vysoká selektivita extrakce - použití modifikátoru umožňuje extrahovat polárnější látky, dále ovlivňuje i selektivitu - malá spotřeba vzorku, malý objem extraktu ve vhodném rozpouštědle: často bez nutnosti přečištění a zkoncentrování - doba extrakce: 10 60 min. Extrakce silic nadkritickou tekutinou je velmi rozšířena, ale jen málo původních prací se zabývá separací terapeuticky účinných látek z léčivých rostlin. Ahmad (AHMAD et al., 1994) se zabýval extrakcí rhizomů zázvoru (Zingiber. zerumbet) ve snaze izolovat látky s cytotoxickými účinky, Sanagi (SANAGI et al., 1993) extrahoval drcené sušené rhizomy Curcuma longa. Ze sedmikrásky (Tanacetum parthenium) byl izolován seskviterpen lakton parthenolid, užívaný při léčbě migrény a artritidy (SMITH & BURFORD, 1992). Heaton (HEATON et al., 1993) využil SFE k izolaci protirakovinných taxanů ze sušeného tisového jehličí. Protinádorové pyrrolizidinové alkaloidy byly vyextrahovány ze semen Crotalaria spectabilis (SCHAEFFER, ZALKOW & TEJA,1989) a ze dvou druhů Senecio (SEIF EL DIN et al.,1983). Hartonem (HARTONEM et al., 1992) využil off-line SFE/SFC ke stanovení obsahu matricinu v květech heřmánku. Mnohem běžnější je extrakce a separace esenciálních olejů (silic) nebo jednotlivých účinných látek z koření. Kocourková a Sedláková-Fojtová ve spolupráci s Ing. Šmirousem (Agritec Šumperk) vyvinuli, validovali a popsali řadu metod pro extrakci a stanovení silic ze vzorků kmínu, koriandru, anýzu, fenyklu, heřmánku a dalších koření a léčivých rostlin (ŠMIROUS et al., 2004; FOJTOVÁ J. et al., 2005). 26

Analýza těkavých složek rostlinného původu je velmi rozšířená (SEDLÁKOVÁ, LOJKOVÁ & KUBÁŇ, 2003). Často se provádějí např. studie obsahů terpenů jehličnatých stromů v závislosti na environmentálních podmínkách, vzhledem k jejich chemotypu a sledování odlišností založených na zeměpisném původu (GLOWACKI, 1994; SCHAEFER & HANOVER, 1986). Také byly prováděny studie vlivu znečištěného ovzduší v městských lokalitách na skladbu monoterpenů (SUPUKA et al., 1997, 1998) a byla zkoumána jejich role v atmosférických poruchách (SCHÜRMANN & ZEIGLER, 1993). 3.6.8 Extrakce rozpouštědlem za zvýšeného tlaku a teploty (PSE) PSE i Soxhletova extrakce se řadí do skupiny extrakcí kapalinou. Bývá také nazývána jako zrychlená extrakce rozpouštědlem (ASE), kapalinová extrakce za zvýšeného tlaku (PFE), tlaková kapalinová extrakce (PLE), tlaková extrakce horkým rozpouštědlem (PHSE), extrakce rozpouštědlem za vysokého tlaku (HPSE) a subkritická extrakce rozpouštědlem (SSE). Využívá se k extrakci vzorku z pevných matric, na získávání látek nerozpustných či částečně rozpustných ve vodě (některé těkavé organické sloučeniny solí, jílů, sedimentů) (GRULICHOVÁ, 2008). Jde o extrakci polotuhé a tuhé matrice kapalným (velmi účinná pro suché matrice) rozpouštědlem při zvýšeném tlaku (10 až 15 MPa) a zvýšené teplotě (50 až 200 C) za čas 5 až 20 minut. Vzorek se staticky umístí do sloupcové cely, zrychlí se extrakční kinetika pomocí zvýšené teploty organického rozpouštědla, díky zvýšenému tlaku, aby se rozpouštědlo udrželo v kapalném stavu, aby nepřešlo do plynného skupenství. Pokud by rozpouštědlo přešlo do plynného stavu, klesla by extrakční kinetika na nulu. Tento stav je nežádoucí. Zvýšená extrakční teplota ovlivňuje rozpustnost vody v rozpouštědle, sníží se viskozita extrahovadla a extrahovadlo lépe proniká do matrice, protože se sníží povrchové napětí roztoku a analyt se rozpouští rychleji. Zvýšený tlak ulehčí extrakci analytu z matrice tím, že se extrahovadlo natlačí do pórů matrice (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Výhoda metody spočívá ve vynikající solvatační schopnosti organických solventů. Vysoká teplota urychluje přestup hmoty analytu z matrice do rozpouštědla a dochází ke kontinuálnímu vyhřívání analytu. Nevýhodou je, že za vysokých teplot se lépe extrahují balastní látky (nižší selektivita přečištění), nestabilní je řada analytů a čím lepší promytí, tím více vzniká extraktu, který se musí následně zakoncentrovat. (KLEJDUS, 2010). 27

Použita byla na izolaci některých pesticidů, polyaromatických uhlovodíků, polyaromatických bifenylů z půd, jílů, sedimentů a kalů. Dále na stanovení aditiv ve výbušninách a polymerních materiálů, tuků v potravině, ropných látek v půdě a také na účinné složky v léčivě (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Schellenberg a Richterová z Německa srovnávali metody separace silic pomocí hydrodestilace, extrakci rozpouštědlem, ASE, SPME a SFE na vzorcích kmínu, majoránky, tymiánu a šalvěje. Rozdíly byly v navážce vzorku, době extrakce a v dalších parametrech. Bylo prokázáno, že všechny použité metody vykazovaly vhodné výsledky pro další analýzu pomocí plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC/MS) (RICHTER & SCHELLENBERG, 2007). 3.6.9 Mikrovlnná rozpouštědlová extrakce (MAE, MWAE) Využívá generované mikrovlny na ohřev rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel, která jsou ve styku s tuhou matricí. Vzorek s extrakčním činidlem se zahřívá v extrakční nádobě mikrovlnným zářením o frekvenci 300 MHz až 300 GHz a vlnovou délkou až 1 m. Mikrovlnné záření je pohlcováno materiály, které obsahují polární molekuly (např. voda). Tyto molekuly mají v dané látce neuspořádanou orientaci. Mikrovlnnou extrakci ovlivňuje použití vhodného extrakčního činidla a jeho množství, dále teplota a čas extrakce. Jako extrakční činidla se používají kapaliny, které jsou schopny absorbovat mikrovlnné záření (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Interakce mikrovlnného záření se vzorkem v mikrovlnném zařízení se může uskutečňovat dvěma způsoby. První způsob je takový, že se mikrovlnné záření rozptyluje v celém vnitřním prostoru mikrovlnného zařízení rovnoměrně. Rovnoměrně je ozařován i vzorek. Druhý způsob využívá usměrněného mikrovlnného záření. Vzorek v mikrovlnném zařízení je vložen např. do teflonové nádobky a mikrovlnné záření je usměrněné na vyhraněnou zónu vzorku, která se zajistí pomocí výseče. Mikrovlnná zařízení využívající rozptýleného záření, jsou nazývána systémy s uzavřenými nádobami, kdy extrakční rozpouštědlo má vysokou dielektrickou konstantu a silně absorbuje mikrovlny. Mikrovlnná zařízení využívající usměrněného záření neboli systémy s otevřenými nádobami s kapalinou, s nízkou dielektrickou konstantou neabsorbují mikrovlny (UHLÍŘOVÁ, 2008). MAE může probíhat tak, že se extrahovaný rostlinný materiál ponoří do rozpouštědla, které silně absorbuje mikrovlnné záření nebo se extrahuje v takovém rozpouštědle, které toto záření propouští. Často se využívá extrakce směsí rozpouštědel, 28

která absorbují a neabsorbují mikrovlnné záření. Spojením mikrovlnné (MAE) a zrychlené (ASE) rozpouštědlové extrakce vzniká zrychlená mikrovlnná extrakce (MASE). MAE i MASE jsou vhodné pro termolabilní analyty, na izolaci reziduí fenylmočovinových herbicidů, pesticidů z půdy nebo polychlorovaných bifenylů ze sedimentů (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Smain a kol. studovali kinetiku extrakce terpenů (limonen a karvon) z kmínu. Obě látky byly extrahovány pomocí MAE a identifikovány pomocí GC s hmotnostní detekcí. Efekt mikrovln při 5 a 10 kv na siličné kanálky kmínu ukázal strukturní změny po extrakci pomocí elektronového mikroskopu (SMAIN et al., 2005). 3.6.10 Mikroextrakce na tuhé fázi (SPME) Mikroextrakce na tuhé fázi neboli na vlákně je rychlá bezrozpouštědlová technika ke konvenčním metodám extrakce analytu z kapalné fáze. SPME je založena na zadržování analytu na malém množství sorbentu. SPME používá křemenné vlákno, které pokrývá film polydimethylsiloxanu (PDMS), polyakrylátu (PA) nebo kopolymeru dimethylsiloxanu a divinylbenzenu, které je uloženo v duté ocelové jehle. Je založena na dvou procesech. První je adsorpce analytu na povrch SPME vlákna technikou purge & trap nebo headspace. Druhá fáze zahrnuje následnou desorpci analytu z povrchu vlákna na kolonu GC nebo HPLC chromatografu. Od sebe se vlákna liší různou polaritou, porozitou, tloušťkou vrstvy sorbentu a opakovaně je lze používat (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Odběr vzorku probíhá tak, že ocelová jehla propíchne septum v zátce zkumavky. Vysune se sorpční vlákno, které se ponoří do kapalného vzorku (netěkavé analyty) nebo se drží v plynném prostoru nad vzorkem, tzv. headspace analýza (těkavé analyty). Vlákno se ponoří při sorpci analytu do roztoku a provede se statická nebo dynamická sorpce analytu na povrch vlákna. Po uplynutí expozičního intervalu se vlákno zasune zpět do ocelové jehly a vytáhne ze vzorku. Jehla se přenese do plynového chromatografu, kde se dávkuje analyt z vlákna. Desorbci analytu je možno uskutečnit termicky v injektoru plynového chromatografu (SPME/GC) nebo může být desorbovaný mobilní fází (vhodným rozpouštědlem) na kolonu kapalinového chromatografu (SPME/HPLC). Dynamická headspace analýza se provádí kontinuální extrakcí analytu ze vzorku pomocí proudu inertního plynu N 2 nebo He. Inertní plyn prochází vzorkem, kde dochází k sorpci analytu do plynu. Až se plyn obohatí, vede 29