Vyšetřovací metody v hematologii MUDr. Dana Galuszková, Ph.D., MBA

Název studijního předmětu Téma Název kapitoly Autor - autoři Hematologie Hematologie Vyšetřovací metody v hematologii MUDr. Dana Galuszková, Ph.D., MBA Vlastní opora: 1. Motivační úvod ke kapitole: V předmětu hematologie student získá základy nejen do problematiky se kterou bude setkávat v rutinní provozu, ale i do problematiky superspecializované. Student budete bude schopen se orientovat v základních vyšetřovacích metodách v hematologii a koagulaci. Bude umět posoudit fyziologické hodnoty a identifikovat patologické hodnoty. Pro správné pochopení je v úvodu zařazené opakování z fyziologie a patologické fyziologie krve. 2. Studijní cíle: Seznámení s fyziologii a složením krve a vyšetřovacími metodami v hematologii. 3. Vlastní obsah kapitoly: Funkce krve 1. Krev přenáší kyslík z plic do tkání a oxid uhličitý odvádí z tkání zpět do plic. Za minutu lze transportovat 250-3 500 ml kyslíku, v závislosti na aktuální tělesné zátěži organismu 2. Krev transportuje živiny a ostatní látky resorbované v gastrointestinálním traktu ke tkáním a odvádí z tkání odpadní zplodiny k místu, kde se odstraňují. 3. Přenáší taktéž hormony, organické i anorganické látky z místa jejich sekrece nebo resorpce k cílovým orgánům a tkáním. 4. Vyrovnává rozdíly v teplotě orgánů. Při chladu dojde k vasokonstrikci cév a teplá krev se využívá pro ohřátí a zajištění činnosti vnitřních orgánů. 5. Udržuje stálost vnitřního prostředí ve fyziologickém rozmezí (ph, osmotický tlak, vzájemný poměr iontů). 6. Účastní se imunitních reakcí - funkce specifické i nespecifické obrany organismu. 7. Stálý objem krve má vliv na hodnotu - stabilitu krevního tlaku. Hlavním krvetvorným (hemopoetickým) orgánem je kostní dřeň, kde se nacházejí kmenové buňky, které proliferují a diferencují se do jednotlivých krevních řad. Dospělý člověk má kolem 5-6 litrů krve, na 1 kg hmotnosti lidského těla cirkuluje v lidském těle asi 60 70 ml krve. Ženy mají o něco méně krve ve vztahu k tělesné hmotnosti než muži. Objem krve se může měnit z různých příčin, např. trénovaní sportovci mají větší objem krve než ostatní. Normální objem krve se nazývá normovolémie, snížený objem hypovolémie, zvýšený objem hypervolémie. Složení krve: 55% plazma

45% krevní elementy Krevní plazma tekutá složka krve Objem plazmy u dospělého člověka je kolem 5 % tělesné hmotnosti, tj. zhruba 3 litry.. Složení: na vodu připadá v plazmě 91 % - 92 %, na rozpuštěné látky 8-9 %. Z organických látek jsou v plazmě nejdůležitější bílkoviny, které se dělí zejména na albuminy, globuliny a fibrinogen. Z ostatních organických látek se v plazmě vyskytují tuky a cukry. Glukóza v plazmě (glykémie) je udržována na poměrně stálé hladině. V plazmě jsou dále přítomny zplodiny rozpadu bílkovin (hlavně močovina, kyselina močová) a některé další organické látky. Krevní elementy Červené krvinky - erytrocyty Bílé krvinky - leukocyty Krevní destičky - trombocyty Erytrocyt (ERY) červená krvinka: bezjaderná buňka, nejpočetnější, životnost 120 dnů, má bikonkávní tvar, umožňující deformaci při průchodu kapilárou. Základní funkcí červené krvinky je přenos kyslíku. Tvorba a obnova červených krvinek se nazývá erytropoéza. Je regulována řadou hormonů, mezi kterými hlavní roli má erytropoetin. Jde o růstový faktor produkovaný hlavně v ledvinách. Leukocyt bílá krvinka: Hlavní úlohou bílých krvinek je ochrana organismu před cizorodými látkami. Leukocyty jsou jaderné buňky, které se dělí na granulocyty a agranulocyty. Granulocyty mají členěné jádro a granulovanou cytoplazmu. Podle barvitelnosti, tvaru, velikosti a množství granul se dělí na neutrofilní, eozinofilní a bazofilní granulocyty. Neutrofilní granulocyty tvoří u dospělého člověka 50 až 60 % všech leukocytů. Jsou schopny prostupovat stěnou kapiláry, vstoupit do tkání a fagocytovat. Při štěpení pohlcených zárodků se uplatňují enzymy z granul. K jejich vzestupu dochází při bakteriální infekci, při maligních nádorech, traumatech, fyzické námaze. Eozinofilní granulocyty mají částečnou schopnost fagocytózy. jejich množství je kolem 3 %, jejich počet stoupá při alergických, parazitárních a kožních onemocněních. Bazofilní granulocyty tvoří jen 1 % leukocytů, jejich granula obsahují například histamin a heparin, tím se uplatňují u alergických stavů a maligních onemocněních.

Agranulocyty mají protoplazmu bez granulace a nesegmentované jádro. Patří k nim monocyty a lymfocyty. Monocyty jsou největší krvinky s výraznou schopností fagocytovat. V tkáních mohou žít i několik měsíců a pohlcovat nejen různé částice, ale i nádorové buňky nebo jejich části. Lymfocyty jsou druhé nejpočetnější bílé krvinky (asi 30 %). Nacházejí se prakticky ve všech tkáních. Dělíme je na T-lymfocyty a B-lymfocyty, tvoří součást obranného systému organismu proti infekcím. Trombocyt - krevní destička nejmenší, bezjaderné tělísko v krvi. Po vyplavení z kostní dřeně přežívají asi 8-12 dní. Jejich počet v 1 mm 3 se pohybuje v rozmezí 150 000-350 000. Nejvýznamnější funkcí je účast na zástavě krvácení: shlukování a rozpad trombocytů v místě poranění tj. tvorba primární zátky a uvolnění hemokoagulačních látek Shrnutí kapitoly Fyziologie krve je klíčovou znalosti pro následující studium klinického hematologie. Vyšetřovací metody v hematologii Vyšetřovací metody: 1) Krevní obraz (KO) představuje základní vyšetření v hematologii, určuje počet krevních buněk a jejich parametrů. Zjišťuje se rutinně na analyzátorech krevních elementů, v indikovaných případech je vyšetření doplněno mikroskopicky. Výsledek krevního obrazu tvoří: Erytrocyty (ERY) Počet červených krvinek v jednom litru krve - fyziologické hodnoty: Muži: 4,3-5,7. 10 12 /l Ženy: 3,8-4,9. 10 12 /l fyziologické zvýšení počtu - novorozenci, lidé žijící delší dobu ve vyšších nadmořských výškách patologické zvýšení (polyglobulie) - srdeční vady, plicní onemocnění, polycytemia vera Hemoglobin (Hb) - červené krevní barvivo, vyplňuje zralý erytrocyt a umožňuje mu plnit funkci přenosu kyslíku. Muži: 136 176 g/l Ženy: 120-168 g /l Hematokrit ( Htk) poměr mezi objemem erytrocytů a plazmy:

- muži 40 : 60 % - ženy 35 : 65 % Příklad: Htk 0,40 znamená, že v 1 litru krve je 400 ml erytrocytů Fyziologické hodnoty: Muži: 0,39-0,49 l/l Ženy: 0,35-0,46 l/l Snížení anémie Zvýšení polyglobulie nebo zahuštění krve, např. při dehydrataci Střední objem erytrocytů MCV (Mean Cell Volume) Hodnotu lze vypočítat: ve jmenovateli je hematokrit, v čitateli počet erytrocytů, krát 1000 Fyziologické hodnoty : 84 95 femtolitr (fl) hodnota 80 fl: jde o mikrocyty hodnota 95 fl: jde o makrocyty Střední množství hemoglobinu v 1 erytrocytu Lze vypočítat: ve jmenovateli je hodnota hemoglobin, v čitateli počet erytrocytů Fyziologické hodnoty: 27 32 pg Střední koncentrace hemoglobinu Lze vypočítat: ve jmenovateli je hodnota hemoglobinu, v čitateli hodnota hematokritu Fyziologické hodnoty 0,31 0,37 normochromie Morfologické anomálie červených krvinek Hodnotí se na základě krevních nátěrů viz. obrázek Patologické změny se mohou projevit změnou tvaru, velikosti, barvitelnosti. Pokud se tyto útvary vyskytují ve více než v 10 %, jde o patologii. Změny velikosti: Mikrocyty MCV menší než 80 fl Makrocyty MCV větší než 95 fl Změny tvaru: Anizocytosa - v krvi převládají erytrocyty různé velikosti. Anulocyty - erytrocyty chudé na hemoglobin, proto se barví jen na okraji.

Leptocyty - terčovité erytrocyty, např. u hemolytické anémie. Sférocyty - erytrocyty kulovitého tvaru, tlustší než normální erytrocyty. Ovalocyty - erytrocyty oválného tvaru. Poikilocyty - erytrocyty různého tvaru - bizarní tvar. Schistocyty - útržky erytrocytů tvarů helmice, fragmentované erytrocyty. Akantocyty - erytrocyty s ostnatými výběžky, např. u pacientů po splenectomii, při alkoholovém poškození jater. Odchylky zbarvení Hypochromie - snížený obsah hemoglobinu. Anisochromie - nestejný obsah hemoglobinu v erytrocytu. Retikulocyty - nejmladší erytrocyty v periferní krvi, obsahují po vypuzení jádra zbytky některých organel - ribozomů, endoplazmatického retikula. Relativní zastoupení: 0, 005-0, 015 Absolutní zastoupení: 4,5-5,9 x 10 12 /l Jsou projevem aktivity kostní dřeně. Snížení počtu útlum erytropoézy Zvýšení počtu - retikulocytóza svědčí o zvýšení krvetvorby Leukocyty: Hlavní úlohou bílých krvinek je ochrana organismu před cizorodými látkami. Fyziologické hodnoty: Dospělý jedinec: 4,4 10,0 x 10 9 /l Zvýšení celkového počtu leukocytů nad 10 000 u člověka nazýváme leukocytóza. Pokles leukocytů pod 4 000 nazýváme leukopenie. Diferenciální rozpočet leukocytů: Poruchy: Udává zastoupení jednotlivých druhů leukocytů v krvi Vyjadřuje se v relativním (%), nebo v absolutním počtu neutrofilie x neutropenie eozinofilie x eozinopenie bazofilie x bazopenie lymfocytóza x lymfopenie Trombocyty Počet trombocytů 150-350 x 10 9 / l Nejvýznamnější funkcí trombocytů je účast při primární hemostáze.

Nadměrné zvýšení počtu trombocytů nazýváme trombocytóza (např. u polycytémie, zánětů), jejich úbytek pak trombocytopenie (idiopatická nebo sekundární). Hematologický analyzátor na vyšetřování krevního obrazu. 2) Hladina erytropoetinu erytropoetin je hormon tvořený především v ledvinách, stimuluje tvorbu a vyzrávání červených krvinek v kostní dřeni. Tvorba erytropoetinu stoupá při některých typech anémií, snížená produkce je u onemocnění ledvin a anémie vyvolané nedostatkem erytropoetinu. 3) Sedimentace (metoda Fahraeusova- Westergrenova - FW) Sedimentace erytrocytů je jedno z nejběžnějších krevních vyšetření, při kterém se zjišťuje rychlost poklesu červených krvinek v nesrážlivé krvi; závisí na množství bílkovin krevní plazmy. Norma: ženy 4-20 mm/hod., muži 2-10 mm/hod. Jde o vyšetření nespecifické, zvýšená hodnota, nelze zjistit přesná příčina zánětu. 4) Cytochemické vyšetřovací metody pomocí barevných reakcí prokazují přítomnost některých substancí, nebo enzymů, a tím umožní prokázat příslušnost krevních elementů k určité vývojové řadě. Například: Reakce na železo - lze prokázat přítomnost železa v erytrocytech nebo erytroblastech. Alkalická fosfatáza v leukocytech přítomna v plazmě zralých neutrofilních leukocytů. Kyselá nespecifická esteráza - u lymfocytů reakce tečkovitá, u monocytů difuzní PAS (Periodic Acid Schiff) identifikace lymfoblastické populace, pozitivní i v erytroblastech erytroleukémií.

5) Imunologické markery CD (Cluster of Differention) klasifikační systém - pomocí průtokové cytometrie jsou určovány populace lymfocytů (T a B) a jsou stanovovány antigeny, jejichž kombinace jsou typické pro různé typy leukocytů a různá stádia zralosti. např. CD3 - T lymfocyty CD19, CD20, CD21, CD22 - B lymfocyty. 6) Molekulárně biologické metody cytogenetické metody průkaz translokací genů. U hematologických onemocnění je nález klonu s patologickým karyotypem důkazem probíhajícího maligního procesu - např. Philadelphia chromosom u chronické myeloidní leukemie. Při opakovaných vyšetřeních v průběhu léčby leukémií umožní výsledek cytogenetického vyšetření posoudit úspěšnost léčby, potvrdit remisi choroby nebo odhalit blížící se relaps onemocnění. U pacientů po transplantaci kostní dřeně se pomocí cytogenetických metod sleduje úspěšnost léčby. 7) Punkce kostní dřeně se provádí aspirací nejčastěji ze sterna. Po lokálním znecitlivění se speciální jehlou pronikne do dutiny hrudní kosti, kde se nachází kostí dřeň, a malé množství se nasaje do stříkačky a rozetře na podložní sklíčka, která jsou odeslána do laboratoře. Tyto preparáty se v laboratoři obarví a hodnotí se morfologické změny buněk počet, velikost, poměr jádra a cytoplazmy, změny tvaru; dále lze provést vyšetření cytogenetické, fytochemické a imunocytologické. 8) Perkutánní trepanobiopsie kostní dřeně Odběr se provádí nejčastěji z lopaty kosti kyčelní. Za pomocí trepanobioptické jehly o průměru asi 2 mm, lze získat vzorek kostní tkáně s kostní dření o délce 10-20 mm a provést vyšetření nejen cytologické, ale i histologické, jehož cílem je posoudit buněčnost, přítomnost fibrózy, infiltrace dřeně chorobným procesem.

Trepanobioptické jehly 9) Onkologické markery - význam pro sledování a prognózu nádorového onemocnění např. Beta2 mikroglobulin používá se pro monitorování pacientů s mnohočetným myelomem a nádory lymfatického systému Ferritin signifikantní pro lymfomy a leukémie. 10) Vyšetření železa Železo (Fe) tvoří nezbytnou součást organismus Obsah železa v organismu: 35-45 mg na kg tělesné váhy, tedy dospělý člověk má v těle 3,5 5 g železa. 60-70 % v erytrocytech, 1g Hb obsahuje 3,34 mg Fe. 10 % v myoglobinu 20-30 % tvoří zásobní železo Chybění železa je nejčastější nedostatek ve světě, postihuje kolem 750 miliónů obyvatel (zejména rozvojové země - Afrika, Asie). Metabolismus železa jde o uzavřený systém - nedostatek železa v krvi zvyšuje vstřebávání železa v tenkém střevě, při nadbytku Fe se produkuje více tzv. gastroferinu, který resorpci železa potlačuje. Za normálních okolností přijmeme denně v potravě asi 10-15 mg Fe, resorbuje se pouze 0,5-1,5 mg. V těhotenství se vstřebávání zvýší až dvojnásobně, jelikož potřeba železa při jednom těhotenství může dosáhnout až 1 000 mg. Vstřebané železo nahradí ztráty, které jsou asi 0,6 mg denně, např. ztráty při menses, stolicí, potem.

Transport Fe zabezpečuje bílkovina transferin. V těle je asi na jednu třetinu transferinu navázáno železo, zbytek tvoří volný transferin, který je připraven vázat Fe při vyšší potřebě. Transportní (transferinové) železo představuje asi 4 mg. Při nedostatku železa je navázáno na transferin málo Fe, proto je vysoká jeho volná kapacita. Naopak při hemolytických anémiích je vysoká hodnota vázaného Fe, kapacita transferinu je tedy nízká. Zásobní železo je uloženo ve formě feritinu nebo hemosiderinu. Množství zásobního železa je u mužů kolem 800 mg, u žen je toto množství menší. Fyziologická hladina feritinu: Muži: 22-322 µg/l Ženy: 10-291 µg/l Laboratorní příznaky deficitu železa: - prelatentní nedostatek Fe hodnota feritinu snížena, vazebná kapacita Fe vyšší, plazmatická hladina Fe v mezích normy. - latentní forma- hladina Fe i feritinu snížena, vazebná kapacita Fe vysoká, v krevním obraze mikrocytóza, hypochromie. - manifestní nedostatek Fe nulová hodnota feritinu, nízká hladina plazmatického Fe, známky anémie v KO, poškození tkání např. patol. změny nehtů (lámavost), vlasů, sliznice. Shrnutí kapitoly Vyšetřovací metody a hodnocení jejich výsledků patří k základům hematologie, potkáte se s nimi napříč všemi obory a tvoří základ k pochopení patologických stavů. 4.. Evaluační a autoevaluační a aktivizační prvky dle charakteru obsahu kapitoly - krátké úkoly, - dlouhé úkoly, otázky k zamyšlení Kontrolní otázky: Dospělý člověk má kolem: 1) jednoho litru krve 2) 1 až 2 litry krve 3) 5-6 litrů krve 4) 2-3 litry krve Funkce trombocytů souvisí s: 1) imunitou 2) přenosem kyslíku 3) primární hemostázou 4) přenosem výživy

Erytropoéza znamená: 1) tvorbu a obnovu erytrocytů 2) tvorbu a obnovu krve 3) tvorbu a obnovu trombocytů 4) tvorbu a obnovu leukocytů Vyberte typy buněk, které kolují v krvi a) plazma, voda, erytrocyty b) erytrocyty, trombocyty, leukocyty c) sérum, enzymy, leukocyty d) plazma, vitamíny, hormony Správné odpovědi na kontrolní otázky 1c 2c 3a 4b Kontrolní otázky: Krevním obrazem zjišťujeme: 1) množství plazmy 2) hladinu železa v krvi 3) jedná se o cytogenetické vyšetření krve 4) počet krevních elementů v krvi a jejich parametry Makrocyty jsou: a) erytrocyty nad 95 fl b)t rombocyty nad 80 fl c) všechny druhy krevních buněk nad 90 fl d) leukocyty nad 90 fl Retikulocyty jsou: a) erytrocyty různé velikosti b) terčovité erytrocyty c) nejmladší erytrocyty v periferní krvi d) buňky, mající bizardní jádro CD klasifikační systém slouží: a) morfologickému ohodnocení erytrocytů b) popisu zralosti trombocytů c) analýze všech buněk v krvi d) stanovování antigenů pro různé typy leukocytů a jejich stádia zralosti Odpověď na kontrolní otázky 1d 2a 3c 4d 6. Pojmy k zapamatování- krevní obraz, diferenciál, erytrocyt, trombocyt, sedimentace, feritin, transferin, punkce kostní dřeně.

7. Literatura Klener, K a kol. Vnitřní lékařství, Praha: Galén, 1999. ISBN 80-7262-007-X Matýšková, M., a kol. Hematologie pro zdravotní laboranty 2. Díl, Brno: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1999. ISBN 80-7013-278-7 Češka, R. a kol. INTERNA,Praha, Triton, 2010. ISBN 978-80-7387-423-0 ZIMA, T. a kol. Laboratorní diagnostika. Praha: Galén, 2002. ISBN 80-7262-201-3 Pecka, M. Praktická hematologie- laboratorní metody, Český Těšín, Infiniti art, s.r.o., 2010.ISBN 978-80-903871-9-5 Nečas, E. a kol. Patologická fyziologie orgánových systémů, Praha, Karolinum, 2003. ISBN 80-246-0615-1