MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE Mechanizmy působení proteinů p53 v nádorové buňce Bakalářská práce Robert Helma Vedoucí práce: Mgr. Marie Brázdová, PhD. Brno 2012
Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Robert Helma Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Mechanizmy působení proteinů p53 v nádorové buňce Bakalářský Biochemie Mgr. Marie Brázdová, PhD. Akademický rok: 2011/2012 Počet stran: 67 Klíčová slova: wild-type p53, mutantní p53, transkripční aktivita, gain of function, regulace p53
Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree Programme: Field of Study: Supervisor: Robert Helma Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Mechanisms of p53 action in tumor cell Bachelor's Biochemistry Mgr. Marie Brázdová, PhD. Academic Year: 2011/2012 Number of Pages: 67 Keywords: wild-type p53, mutant p53, transcriptional activity, gain of function, regulation of p53
Abstrakt Nádory mozku patří mezi vysoce invazivní typy nádorů. Inaktivace specifických genů spolu s bodovými mutacemi nádorového supresorového genu TP53 je spojena s nepříznivou prognózou. Mutantní formy p53 disponují celou řadou specifických vlastností spojených s agresivním charakterem nádorů např. inhibice apoptózy, chemorezistence, angiogeneze či zástava diferenciace prostřednictvím transkripční aktivace či represe řady cílových genů. Regulace cílových genů je předmětem intenzivního studia. Mezi mechanismy jejich regulace patří strukturně specifická vazba p53 na DNA, interakce mutantních proteinů p53 s transkripčními faktory (SP1, ETS1 aj.) a jinými proteiny (p63, p73 či TOP1). V rámci bakalářské práce byl studován vliv mutace TP53 na onkogenní chování glioblastomových linií a mechanismus působení mutantní p53. Pro analýzu byly použity jednak základní glioblastomové linie U87 (wtp53), Onda 11 (R273C), U251 (R273H), Onda 10 (G245S) a klony se sníženou expresí p53, odvozené od těchto linií (Usi 12, Usi 16, Osi 10, P1-37). V rámci naší studie byly selektovány stabilní klony odvozené od linie Onda 10 po transfekci shrna-p53 (psuper-p53, P1-37). Míra exprese p53 byla analyzována pomocí imunodetekce a úspěšnost integrace plazmidu psuper-p53 do genomu linie Onda 10 byla ověřena pomocí PCR. Analýza exprese cílových genů mutp53 byla provedena na základě dat z DNA microarray analýz linií U251/Usi 12/Usi 16 a byly navrženy kandidátní geny pro další analýzy (FRMD5, JAK2, NRG1, PPARGC1A, TGFBR2 a VEGFA). Na závěr byl ověřen vliv exprese mutantního proteinu p53 na onkogenní chování, kdy bylo zjištěno, že u linií s potlačenou expresí p53 (Usi 12, Osi 10 a P1) dochází ke snížení jejich schopnosti tvořit kolonie na měkkém agaru.
Abstract Brain tumors belong among highly invasive types of tumors. Inactivation of specific genes along with point mutations of tumor suppressor gene TP53 is linked to poor prognosis. Mutant forms of p53 manage quite a number of specific abilities, associated with aggressive character of tumors e. g. inhibition of apoptosis, chemoresistance, angiogenesis or differentiation block, through transcriptional activation or repression of series of genes. Regulation of target genes is a subject of intensive studies. Into mechanisms of their regulation are involved a structure-specific DNA binding of p53, interaction of p53 mutants with transcriptional factors (SP, ETS1 et al.) and other proteins (p63, p73 or TOP1). In this thesis an influence of TP53 mutation and mutant p53 driven mechanism on oncogenic behaviour of glioblastoma cell lines was studied. Parental glioblastoma cell lines U87 (wtp53), Onda 11 (R273C), U251 (R273H), Onda 10 (G245S) and derived clones with reduced expression of p53 (Usi 12, Usi 16, Osi 10, P1-37) were used for analysis. Stable clones derived from Onda 10 cell line were selected after transfection of shrna-p53 (psuper-p53, P1-37). The amount of p53 expression on protein level was analysed by using immunodetection. Successful integration of plasmid psuper-p53 into the genome of Onda 10 cell line was controlled by PCR. Analysis of mutp53 target genes expression was performed on the basis of DNA microarray data. We analyzed cell line system U251/Usi 12/Usi 16 and suggested couple of a mutp53 target genes, suitable for further analysis (FRMD5, JAK2, NRG1, PPARGC1A, TGFBR2, VEGFA). An influence of mutant p53 expression on oncogenic behaviour was detected by soft agar colony formation assay. The cell lines with repressed expression of mutp53 (Usi 12, Osi 10 and P1) were less able to form colonies in soft agar.
Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval své vedoucí bakalářské práce Mgr. Marii Brázdové, PhD. za cenné rady, připomínky a metodické vedení práce. Zároveň děkuji celému laboratornímu kolektivu za průběžnou pomoc. Tato práce byla podpořena z projektu r.č. P301/10/2370 "Úloha strukturně selektivní vazby proteinu p53 k DNA u nádorů mozku" Grantové agentury ČR. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 11. května 2012 Robert Helma
Obsah 1. Úvod... 1 1.1 Obecné znaky kancerogeneze... 2 1.2 Protein p53 jako nádorový supresor... 3 1.3 Gen TP53 a jeho mutace... 4 1.4 Obecná charakteristika struktury proteinu p53... 6 1.5 Transkripční aktivita p53... 7 1.5.1 Regulace p53 na úrovni mrna... 8 1.5.2 Buněčná lokalizace a regulace hladiny p53... 9 1.5.3 Posttranslační modifikace wtp53... 11 1.5.4 Interakce wtp53 s ostatními proteiny... 12 1.5.5 Přehled nejlépe charakterizovaných efektorových genů wtp53... 13 1.6 Mutantní p53 a jeho regulace... 16 1.7 Získání onkogenních vlastností mutp53 (gain of function)... 18 1.7.1 Interakce s p63 a p73... 18 1.7.2 Vazba mutp53 na DNA a interakce s transkripčními faktory... 19 1.7.3 Ztráta funkce nádorového supresoru ( loss of function)... 21 1.8 Využití znalostí mutací TP53 v klinické praxi... 22 1.9 Cíle bakalářské práce... 23 2. Materiál... 24 2.1 Použité chemikálie... 24 2.2 Složení roztoků a pufrů... 24 2.3 Použité přístroje... 25 2.4 Použité buněčné linie... 26 2.5 Použité plazmidy... 26 2.6 Použité primery při PCR... 27 3. Metody... 28 3.1 Transfekce plazmidů psuper a pci-neo... 28 3.2 Práce s tkáňovými kulturami... 28 3.3 Příprava peletu savčích nádorových linií... 28 3.4 Izolace genomové DNA pomocí fenol-chloroformové extrakce... 29 3.5 Kontrola integrace plazmidů do genomové DNA pomocí PCR... 29 3.6 Elektroforéza DNA v agarózovém gelu... 30 3.7 Detekce DNA v agarózovém gelu... 30 3.8 Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové... 30
3.9 Dělení proteinů metodou SDS-PAGE... 31 3.10 Přenos proteinů na membránu... 31 3.11 Imunodetekce proteinů na membráně... 32 3.12 Test tvorby kolonií v měkkém agaru... 32 4. Výsledky... 33 4.1 Analýza exprese p53 v glioblastomových liniích... 33 4.2 Příprava a analýza stabilních klonů... 34 4.2.1 Analýza integrace plazmidů psuper a pci-neo do genomu klonů pomocí PCR... 36 4.3 Vliv exprese mutp53 na onkogenní chování vybraných glioblastomových linií... 38 4.4 Návrh cílových genů mutp53 pro expresní studie u vybraných glioblastomových linií... 39 5. Diskuze... 41 6. Závěr... 45 7. Seznam použité literatury... 46
Seznam použitých zkratek 11D3 monoklonální anti-p53 protilátka Apaf-1 apoptotic protease activating factor 1 APC adenomatous Polyposis Coli ASPP apoptosis-stimulating protein of p53 ATM ataxia telangiectasia mutated ATR ataxia telangiectasia and Rad3 related BAX BCL2-associated X protein BCL-2 B-cell CLL/lymphoma 2 CDKs cyklin dependentní kinázy CK1 casein kinase 1 CP-31398 cell permeable styrylquinazoline p53 modulator DDB1/ DDB2 damage- DNA binding protein 1 / damage- DNA binding protein 2 DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DNE dominantně negativní efekt DO-1 monoklonální protilátka proti proteinu p53 E1A Early E1A 32 kda protein Ets1 transkripční faktor rodiny ETS (E-twenty six-1) FRMD5 FERM domain containing 5 GADD45 growth arrest DNA damage-inducible gene 45 GOF gain of function GPX glutathione peroxidase HR homologní rekombinace HSP90/ HSP70 heat-shock protein 90 / Heat-shock protein 70 CHIP carboxyl-terminus of Hsp70 Interacting Protein CHK1/ CHK2 checkpoint kinase 1/checkpoint kinase 2, protein kinázy JAK2 Janus kinase 2 LFS Li-Fraumeniho syndrom MAPK mitogeny aktivovaná protein kináza MDM2 human homolog of mouse double minute 2 MDM4 (MDMX) human homolog of mouse double minute 4 MDR-1 multi drug resistance 1 mir-34 microrna 34a mir-34b\c microrna 34b\c MLH1 human mutl homolog 1 MMR mismatch repair MRE11 meiotic recombination 11 mtor mammalian Target Of Rapamycin mutp53 mutantní p53 mutp53 mutantní p53 myc protoonkogen kódující transkripční regulační faktory
MYST MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2, and Tip60, rodina histon acetyltransferáz NER nucleotide excision repair NES nuclear export signal NF-Y transkripční faktor Y NF-κB nuclear factor- κb NLS nuclear localization signal NRG1 neuregulin 1 p21 waf1 gen kódující protein p21 p300/cbp komplex transkripčních koaktivátorů CBP (CREB binding protein) a p300 p53, p53β a p53γ izoformy proteinu p53 p53aip1 p53-regulated Apoptosis-Inducing Protein 1 PAb421 monoklonální protilátka proti proteinu p53 PCAF P300/CBP-associated factor PCNA proliferating cell nuclear antigen PIG-3/PIG-6 p53-inducible gene 3 / p53-inducible gene 6 PMS2 postmeiotic segregation increased 2 POX proline oxidase PPARGC1A peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha PRIMA-1 p53 reactivation and induction of massive apoptosis PTEN phosphatase and tensin homolog PUMA p53 up-regulated modulator of apoptosis PXXP doména bohatá na prolin Rad51 protein z rodiny Rad51, účástnící se opravy DNA dvouřetězcových zlomů Ras onkogen kódující signální transduktory RE responzivní element ROS reactive oxygen species SAM sterile alpha-motif ScFV single chain FV fragments SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SOD2 superoxide dismutase 2 Sp1 specifity Protein 1 SV40 T simian virus 40 T-antigen TGFBR2 transforming growth factor, beta receptor II TIGAR TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator TIP60 tat-interactive protein 60, acetyltransferáza TMEM108 transmembrane protein 108 TNFα tumor necrosis factor-alpha TOP1 topoizomeráza 1 TP53, TP73, TP63 geny kódující proteiny p53/p63/p73 VDR vitamin D3 receptor VEGFA vascular endothelial growth factor A wtp53 wild-type p53, přirozeně se vyskytující typ p53 XPC xeroderma pigmentosum, complementation group C
1. Úvod Problematika vzniku nádorů patří v současnosti stále mezi aktuální témata. Jelikož se na vzniku nádorů podílí velké množství faktorů, je předmětem studia vědců z celého světa najít chybějící díly této skládanky, které by pomohly objasnit úlohu jednotlivých mechanismů zahrnutých do iniciace vzniku nádorů. Jeden z nejdůležitějších faktorů, aktivně se účastnící nádorové suprese, je protein p53. Tento protein může být přirovnán k dirigentovi symfonického orchestru. Jeho hlavní úlohou je udržovat v buňce harmonii všech procesů při odpovědi na různé druhy buněčného stresu. Celkové harmonie je docíleno koordinací exprese velkého množství efektorových genů, které tímto zaujímají roli jednotlivých hráčů symfonického orchestru. Mezi efektorové geny patří i takové, co se přímo podílejí na regulaci buněčného cyklu např. p21. Pokud některý z hráčů orchestru hraje falešně (chybná regulace genové exprese) a zároveň je narušena regulace buněčného dělení, může dojít k transformaci normální buňky v buňku nádorovou. Transkripční aktivita p53 je podmíněna sekvenčně specifickou vazbou k DNA, do oblasti promotorů cílových efektorových genů. Expresí těchto genů poté vznikají molekuly, které se následně účastní boje proti vzniku nádorů. Ztráta zmíněných transkripčních vlastností p53 představuje nejzávažnější problém asociovaný se vznikem nádorů. Nejčastěji bývá v důsledku mutací postižena právě DNA vazebná doména proteinu. Existují však i mutanti s částečně zachovanou transkripční aktivitou. Mutantní formy p53 (mutp53) disponují celou řadou nových schopností, které propůjčují mutp53 vlastnosti onkogenu. Mezi tyto schopnosti patří mj. inhibice apoptózy, chemorezistence či zástava diferenciace. Rozpoznávání a regulace nových efektorových genů (specifických pro mutp53), interakce s jinými transkripčními faktory nebo regulace netranskripčních procesů, pak představují mechanismy, tvořící základ, pro již zmíněné onkogenní vlastnosti mutp53. Každý objev, např. nových mutací či cílových genů mutp53, významně přispívá ke specifikaci daného druhu nádoru a může ve výsledku napomoci lékařům při volbě účinného zacílení léčby. 1
1.1 Obecné znaky kancerogeneze Proces vzniku nádoru je vícestupňový proces, jehož podstatou je postupné hromadění genetických a epigenetických změn. Základní jednotkou genetické informace jsou geny, z nichž každý kóduje specifický produkt, jakým je RNA nebo protein. Pokud některý z genů podlehne mutaci, dochází jeho následnou transkripcí a translací ke vzniku produktu, jenž se svými vlastnostmi liší od produktu, který by vznikl transkripcí genu nepostihnutého mutací. Z mutací účastnících se tvorby nádorů jsou nejdůležitější mutace, které mění strukturu genů, což má za následek změnu struktury vznikajících proteinů a současně změnu míry jejich exprese (Adam et al., 2003). Bylo zjištěno, že u hlodavců jsou zapotřebí alespoň dvě genetické změny k tomu, aby došlo k samotné transformaci buňky. U lidí je transformace buněk znesnadněna a minimální počet genetických změn je odhadován na 4. (Hahn et al., 1999). Konkrétních genů, které při tvorbě nádorů podléhají mutaci, je velké množství. Mezi nejdůležitější mutace, způsobující přeměnu normální buňky v buňku nádorovou, však patří mutace protoontogenů a nádorových supresorů (antiontogenů). Protoontogeny kódují proteiny, které jsou zodpovědně za aktivaci buněčného cyklu a stimulaci proliferace, na rozdíl od nádorových supresorů, které udržují buňku v klidovém stadiu (Adam et al., 2003). Jak již bylo zmíněno, kancerogeneze je vícestupňový proces, který vede ke vzniku buněk, jejichž společným jmenovatelem je defekt v některé z drah, zajišťujících normální buněčnou proliferaci a homeostázu. Dosud bylo objeveno přes 100 různých druhů rakoviny. Je nutné si uvědomit, že proces vzniku nádorové buňky je charakterizován individuálním průběhem, který zahrnuje změny v buněčné fyziologii. Ukázalo se, že pro vývoj maligního nádoru musí v buňce proběhnout několik fyziologických změn, které vedou k potlačení protirakovinných obranných mechanismů. Mezi tyto změny společné pro všechny typy nádorů patří: poškození apoptózy, neomezený replikační potenciál, posílená angiogeneze, tvorba metastáz, nestabilita genomu, soběstačnost v produkci růstových signálů a necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus (obrázek č. 1). Vzhledem k množství druhů maligních nádorů, závisí jejich tvorba na tom, kolik změn proběhne, v jakém pořadí a na konkrétních genech, které jsou zasaženy (Hanahan a Weineberg, 2000). Cílem této kapitoly bylo uvědomit si, že vznik nádoru není důsledkem jednoho zásahu, ale jedná se o více zásahů, které společně umožňují vznik nádoru. 2
Obrázek č. 1. Přehled změn v buněčné fyziologii, nezbytných pro vývoj maligního nádoru (převzato a upraveno dle Hanahan a Weineberg, 2000). 1.2 Protein p53 jako nádorový supresor Nádorové supresory patří do široké skupiny molekul, jejichž primární funkcí je kontrola buněčného dělení, aktivace apoptózy a potlačení tvorby metastáz. Ztrátou některé z těchto funkcí nádorového supresoru, ať už vlivem mutace nebo poškození, může dojít ke vzniku rakoviny. Nejvýznamnějším proteinem, účastnícím se boje proti vzniku rakoviny je protein p53. Od objevu proteinu p53 uběhlo již 33 let. Zpočátku byly tomuto proteinu přisuzovány vlastnosti nádorového antigenu, a to díky jeho schopnosti interagovat s virovým SV40 T-antigenem a díky vysokým hladinám tohoto proteinu detekovaným v nádorových buňkách (Lane a Crawford, 1979; Linzer a Levine, 1979; Kress et al., 1979). Četné pokusy na myších vedly v průběhu 80. let k poznání, že p53 funguje jako pozitivní regulátor buněčné proliferace. S označením p53 jako onkogenu byly spojeny pokusy, zaměřené na kotransfekci myší p53 cdna s plazmidy kódujícími aktivovaný Ras 3
onkogen. Výsledkem těchto pokusů byla buněčná transformace, podobná transformaci vyvolané protoonkogeny myc či E1A (Eliyahu et al., 1984, Prada et al., 1984). Koncem 80. let již bylo jasné, že cdna klony p53, které způsobovaly buněčnou transformaci, obsahovaly ve své struktuře mutaci, a že cdna klony wtp53 zabraňují transformaci způsobené onkogeny. Z tohoto důvodu byl protein p53 zařazen do rodiny nádorových supresorů (Finlay et al., 1989). Protein p53 hraje klíčovou roli v boji proti vzniku nádorů a je právem označován jako strážce genomu (Lane, 1992). V roce 1993 byl p53 zvolen molekulou roku (Koshland, 1993). Protein p53 je exprimován v normálních buňkách a je lokalizován v jádře. Tato lokalizace je důležitá pro schopnost odpovědi na podněty, navozující genotoxický stres (Okorokov et al., 2002). Jako nádorový supresor je středem signálních drah, které zajišťují kontrolu buněčného cyklu a integritu lidského genomu (shrnuto v Joerger a Fersht, 2010). Kromě schopnosti zastavovat buněčný cyklus a indukovat apoptózu, jako odpověď na různé druhy buněčného stresu, účastní se p53 dalších procesů, jako jsou reparace DNA, diferenciace a senescence (shrnuto v Colleen et al., 2010). Funkce nádorových supresorů je podmíněna schopností interagovat s DNA. P53 se váže na oblasti DNA označované jako responzivní elementy (RE) a tím způsobuje zvýšení či snížení transkripční aktivity genu, na kterém se daný RE nachází (el-deiry et al., 1992; Funk et al., 1992). 1.3 Gen TP53 a jeho mutace TP53 je gen, kódující fosfoprotein o velikosti 53 kda. Je lokalizován na 17. chromozomu a obsahuje 11 exonů, z nichž první se neexprimuje. Spolu s TP73 a TP63 patří do rodiny vysoce konzervovaných genů (Guimaraes a Hainaut, 2002). V obranné protirakovinné funkci má tento gen významné postavení a jeho mutace se odráží v poškození nádorové supresorové funkce proteinu p53. U lidských nádorů se mutace v genu TP53 vyskytují ve více jak 50%. Největší část tvoří bodové mutace měnící smysl kodonu, jejichž výsledkem je substituce jedné aminokyseliny za jinou. Nejvíce mutací se nachází na DNA-vazebné doméně p53, což může výrazně ovlivňovat vazbu proteinu na DNA (Guimaraes a Hainaut, 2002). 4
Mezi další změny vedoucí k inaktivaci TP53 patří ztráta alel nebo inaktivace genu virovými či buněčnými proteiny. Mutace genu TP53 můžeme rozdělit na somatické a zárodečné. K tomu, aby se mutace uplatnila při tvorbě nádoru, musí proběhnout inaktivace obou alel daného genu. Proto jsou somatické a zárodečné mutace doprovázeny ztrátou heterozygotnosti během nádorové progrese (shrnuto v Brosh a Rotter 2009). Druhou možností je dělit mutace TP53 podle jejich vlivu na termodynamickou stabilitu proteinu p53. Vzniklé mutantní formy p53 můžeme rozdělit na kontaktní a konformační mutanty. Důsledkem těchto mutací jsou poruchy schopnosti p53 sekvenčně specificky se vázat na DNA (Joerger a Fersht, 2007; Bullock a Fersht, 2001). Četnost a distribuce mutací p53 je zobrazena na obrázku č. 2. Dědičnost mutantní formy TP53, vede k predispozicím vzniku rakoviny, konkrétně rakoviny prsu, mozku a kůry nadledvinek. Tato familiární dědičnost predispozice různých druhů rakoviny je označována jako Li-Fraumeniho (LFS) a Li-Fraumeniho-like (LFL) syndrom (Li et al., 1988, Olivier et al., 2003). LFS je vzácný druh autozomálně-dominantní poruchy. Postižené rodiny vykazují vysokou incidenci při vzniku rakoviny. Zatímco somatické mutace se vyskytují téměř v každém typu rakoviny, pro LFS jsou charakteristické zárodečné mutace v jedné z alel, kódujících p53 (Levine et al., 1991, Brosh a Rotter 2009). Obrázek č. 2. Četnost a distribuce mutací p53 (převzato a upraveno dle Bullock a Fersht, 2001). Římské číslice označují vysoce evolučně konzervované sekvence proteinu p53. Histogram mutací měnících smysl kodonu ukazuje, že 97% mutací se vyskytuje v DNA-vazebné 5
doméně. Nejčastěji frekventovaná místa mutací jsou označována jako hotspots (R175, G245, R248, R249, R273, R282). 1.4 Obecná charakteristika struktury proteinu p53 Protein se skládá celkem z 393 aminokyselin, které jsou uspořádány do čtyř hlavních domén (obrázek č. 3). Na N-terminálním konci se nachází transaktivační doména (TAD), která je zodpovědná za transkripční aktivitu tohoto proteinu. Umožňuje regulaci exprese cílových genů, ať už přímou vazbou na koaktivátory transkripce, či vazbu na komponenty bazální transkripce (shrnuto v Millau et al. 2010). Zároveň je TAD místem, kde se odehrávají četné posttranslační modifikace a interakce negativních regulátorů, jakými jsou např. MDM2, MDM4. TAD se dále dělí na tři části, kterými jsou TAD1, TAD2 a doména bohatá na prolin. (shrnuto v Joerger a Fersht, 2010). Doména bohatá na prolin obsahuje pět kopií PXXP, kde X představuje libovolnou aminokyselinu. Ukázalo se, že její přítomnost je nezbytná pro účinnou supresi buněčného růstu a je klíčová při apoptóze zprostředkované proteinem p53 (Baptiste et al., 2002; Zhu et al., 1999). Tato doména je zároveň zahrnuta do odpovědi na poškození buňky, díky zprostředkování vazby p53 na F-aktin v jaderné matrix (Okorokov et al., 2002). Další součástí domény bohaté na prolin je negativní regulační doména, která snižuje vazebné schopnosti p53 vůči DNA (Müller-Tiemann et al., 1998). DNA vazebná doména zodpovídá za interakci p53 s DNA, jeho konformaci a vazbu zinku. Mimo jiné, umožňuje vazebná doména interakci s celou škálou proteinů a účastní se tak nádorové suprese. Příkladem mohou být proteiny z rodin ASPPs, p63 a p73, které jsou zahrnuty do procesu apoptózy (shrnuto v Millau et al., 2010). Poslední část proteinu p53 tvoří C-terminální oblast. Je složená z oligomerizační domény a bazické domény. Oligomerizační doména umožňuje p53 tvorbu dimerů při kotranslačních procesech a následně tvorbu tetramerů v posttranslačních procesech (Nicholls et al. 2002). Také je zde přítomná sekvence aminokyselin tvořících NES (Nuclear Export Signal), která řídí přesun proteinu z jádra do cytoplazmy. Na bazické doméně se potom nachází několik sekvencí NLS (Nuclear Localization Signal), jejichž úkolem je naopak zprostředkovat migraci proteinu z cytoplazmy do jádra. Nachází se zde také druhá negativní autoregulační doména (Shaulsky et al., 1990). Kromě toho umožňuje 6
bazická doména i sekvenčně nespecifickou vazbu proteinu na DNA (Wang et al., 1993). Obrázek č. 3. Struktura proteinu p53 (převzato a upraveno dle Millau et al. 2010). 1.5 Transkripční aktivita p53 Jako transkripční faktor koordinuje wtp53 buněčnou odpověď na stresové podněty a poškození DNA prostřednictvím iniciace transkripce cílových genů. Výsledkem je především zástava buněčného cyklu, oprava DNA nebo apoptóza (Horvath et al., 2007). Transkripční aktivita p53 je podnícena přímou vazbou proteinu na DNA, do oblastí RE. Tyto oblasti jsou charakteristické tím, že obsahují dvojici invertních pentamerních sekvencí, zpravidla se vyskytujících v tandemech nebo s rozestupem 0-13 bp. RE se nachází v oblasti promotorů nebo prvních intronů efektorových genů (shrnuto v Millau et al. 2010). P53 rozpoznává a váže se na RE ve formě tetramerů. Tvorba tetramerů je umožněna díky oligomerizační doméně na C-terminálním konci proteinu. Tetramery jsou složeny z dvojice symetrických dimerů, z nichž všechny čtyři podjednotky jsou geometricky ekvivalentní (Mc Lure a Lee, 1998). Po rozpoznání a navázání tetrameru na RE dochází k regulaci genové exprese interakcí s bazálním transkripčním faktorem TFIID nebo interakcí transkripčních koaktivátorů, jako jsou p300 a CBP. Vazbou tetrameru na DNA může p53 regulovat transkripci cílových genů také nepřímo, tvorbou komplexů s jinými transkripčními faktory. Příkladem může být Sp1 (Specifity Protein 1), který jakožto transkripční faktor hraje významnou roli v regulaci důležitých biologických procesů kontrolovaných proteinem p53 prostřednictvím genu p21. Expresí genu p21 vzniká stejnojmenný protein, který je zahrnutý do progrese buněčného cyklu v savčích buňkách (shrnuto v Millau et al. 2010; Koutsondotis et al., 2001). 7
1.5.1 Regulace p53 na úrovni mrna První stupeň v regulaci p53 tvoří změny, odehrávající se na úrovni mrna. Transkripce genu TP53 může být iniciována jak z promotoru přítomného na prvním exonu, tak z interního promotoru nacházejícího se na intronu č. 4. Kombinací alternativního sestřihu intronů 2 a 9 společně s využitím interního promotoru na intronu č. 4 a alternativní iniciace translace, můžeme rozlišit až 9 různých izoforem p53. Alternativním sestřihem C-konce vznikají 3 izoformy: p53, p53β a p53γ. Využití alternativního promotoru vede ke vzniku izoforem se zkrácenou N-terminální částí (obrázek č. 4) (Bourdon et al., 2005). Obrázek č. 4. Schéma lidského TP53 a izoforem p53. (A) Schéma genu, kódujícího p53 u lidí. (B) Schéma izoforem p53 teoreticky kódovaných lidským TP53 (převzato a upraveno dle Bourdon et al., 2005). Izoforma p53i9 (p53β) vzniká alternativním sestřihem intronu 9. Na rozdíl od fulllength p53 se tato izoforma skládá pouze z 341 aminokyselin. In vitro se p53i9 není schopný vázat na DNA a in vivo vykazuje defekt v transkripční aktivitě. Příčinou těchto 8
defektů je ztráta části oligomerizační domény na C-terminální části, a tím pádem neschopnost p53 tvořit tetramery a vázat se na DNA (Murray-Zmijewski et al., 2006). Druhá izoforma zvaná p47 vzniká buď alternativním sestřihem 2. intronu nebo alternativní iniciací translace. Na rozdíl od p53i9 je p47 zkrácený o prvních 40 aminokyselin v N-terminální části proteinu. Vzhledem k tomu, že p47 obsahuje velkou část transaktivační domény, může po transfekci aktivovat genovou expresi prostřednictvím sekundární transaktivační domény. Kromě toho může p47 vykazovat dominantně negativní efekt vůči wtp53, jehož důsledkem je inhibice transkripční aktivity a p53-zprostředkované apoptózy. Ukázalo se také, že p47 může modifikovat buněčnou lokalizaci p53 a tím inhibovat jeho degradaci pomocí MDM2 (Bourdon et al., 2005). 1.5.2 Buněčná lokalizace a regulace hladiny p53 Buněčná lokalizace je dalším z faktorů významně se podílejících na regulaci transkripční aktivity p53. Nově vzniklý p53 se během G1 fáze buněčného cyklu akumuluje v cytoplazmě. Na přelomu G1/S fáze vstupuje do jádra a v S fázi se vrací opět do cytoplazmy. Protože primárně vystupuje p53 jako transkripční faktor, přispívá jeho snížená koncentrace v jádře ke snížení transkripční aktivity. Jedním z hlavních mechanismů, které zprostředkovávají přesun p53 z jádra do cytoplazmy a naopak, je ubiquitinace zprostředkovaná proteinem MDM2 (Shaulsky et al., 1990; Moll et al., 1996). Tento mechanismus hraje ústřední roli v odpovědi buňky na různé druhy buněčného stresu. Kromě MDM2 je kontrola stability a aktivity proteinu p53 zprostředkována ještě dalším proteinem (MDM4). Hlavní úlohou těchto proteinů je kontrolovat hladinu p53 a v případě zvýšené hladiny proteinu, zprostředkovat jeho degradaci na proteozomu (Goh et al., 2010). Pokud buňka nečelí stresové situaci, váže se MDM2 na transaktivační doménu proteinu p53. Tato vazba způsobí utlumení transkripční aktivity p53 zablokováním vazebného místa pro koaktivátory transkripce. Druhou vlastností MDM2 je její ubiquitin ligázová aktivita, způsobující ubiquitinaci zbytků lysinu na C-terminálním konci proteinu, což má za následek následné navození jeho degradace na proteozomu. 9
Buněčný stres způsobí aktivaci příslušných kináz, které zahajují fosforylaci zbytků serinu a threoninu na transaktivační doméně. Modifikace způsobené fosforylací, snižují schopnost vazby MDM2 k transaktivační doméně p53. Schopnost specifické vazby MDM2 utlumují také modifikace v doméně bohaté na prolin. Snížení vazebné schopnosti MDM2 vede k akumulaci p53, aby se následně mohly tvořit tetramery. Vznik tetramerů maskuje signály, jejichž úkolem je řídit přesun p53 z jádra do cytoplazmy. Výsledkem je tendence tetramerů zůstat v jádře. Nicméně studie ukázaly, že zlomek molekul p53 může zůstat v cytoplazmě, kde se účastní procesů apoptózy (shrnuto v Toledo a Wahl, 2006). Druhou molekulou spojenou s regulací p53 je MDM4, známý také jako MDMX. Tento protein je strukturou podobný MDM2, zejména v oblasti p53-vazebné domény. Díky této podobnosti je schopen MDM4 vázat se přímo na p53, avšak na rozdíl od MDM2 není schopen zprostředkovat ubiquitinaci. Při zvýšené expresi inhibuje MDM4 degradaci p53 zprostředkovanou MDM2 soupeřením o vazebné místo na p53. Další schopností MDM4 je stabilizace MDM2 prostřednictvím tvorby heterodimeru. Tento komplex zabraňuje vlastní ubiquitinaci MDM2 a zvyšuje schopnost ubiquitinace p53. (Shvarts et al., 1996; Gu et al., 2002). Kromě interakce MDM2 s wtp53, interaguje tento protein také s mutp53. Interakce MDM2 s mutp53 se liší od interakce s wtp53 v tom ohledu, že mutp53 postrádá schopnost aktivovat MDM2. Z tohoto důvodu může být v buňce nedostatečné množství proteinu MDM2, který by zajistil snížení hladiny mutp53 (Terzian et al., 2008). Zjednodušeně je působení negativních regulátorů znázorněno na obrázku č. 5. 10
Obrázek č. 5. Znázornění rozdílů v regulaci wild-type a mutantní formy p53. Za normálních podmínek je hladina p53 držena pomocí MDM2 a MDM4 na nízkých hodnotách. Buněčný stres či aktivace onkogenů mají za následek zvýšení hladiny wtp53 a mutp53. Vzniklý tetramer se poté váže na DNA a umožňuje transkripci cílového genu. Zároveň zvýšená exprese MDM2 obnovuje původní hladinu p53. Mutantní p53 není schopná této negativní regulace a může tak inhibovat wtp53, p63, p73 či jiné proteiny (převzato a upraveno podle Goh et al., 2010). 1.5.3 Posttranslační modifikace wtp53 Jako posttranslační modifikace označujeme kovalentní adici funkčních skupin k proteinu vzniklého translací. Mezi nejdůležitější modifikace p53 patří fosforylace a acetylace zbytků serinu a threoninu (Bode a Dong, 2004). Velké množství serinových a threoninových zbytků se nachází na transaktivační doméně N-terminálního konce p53 a v C-terminální části. Fosforylace umožňuje regulaci biologické aktivity stovek proteinů. Je zprostředkována proteinkinázami, mezi které patří např. ATM, ATR, CHK1, CHK2, MAPK a CK1. Uvedené kinázy jsou aktivovány při poškození DNA nebo následkem působení jiného stresového signálu. Výsledkem je zvýšení stability proteinu a tím pádem zvýšení jeho funkčnosti nebo ovlivnění schopnosti p53 vázat se na cílové sekvence v genomu (shrnuto v Olsson et al., 2007). Hlavním místem kde se odehrávají fosforylace, ovlivňující transkripční aktivitu p53, jsou zbytky aminokyselin Ser15, Thr18 a Ser20. Tyto aminokyseliny se nachází se na transaktivační doméně N-terminálního konce v blízkosti nebo přímo v oblastech, kde se k p53 váže MDM2. Konkrétně je fosforylace Ser15 spojená s transaktivací závislou na p53, zástavou buněčného cyklu a apoptózou, které jsou odpovědí na poškození DNA. Fosforylace Ser20 a Thr18 ovlivňují interakci mezi p53 a MDM2 tím způsobem, že zabraňují ubiquitinaci p53. Specifická vazba p53 k promotoru p53aip1 a následná indukce apoptózy je způsobena fosforylací Ser46 (Bode a Dong, 2004; Apella a Anderson, 2001; Oda et al., 2000). Mezi další významné posttranslační modifikace patří acetylace. Acetylovány jsou především zbytky lysinu za účasti různých acetyltransferáz. Na rozdíl od fosforylací, probíhají acetylace na C-terminálním konci proteinu. Acetylace zbytků Lys370, 372, 373, 381, 382 je zajištěná heterodimery CBP/p300. Naproti tomu, Lys305 a Lys320, nacházející se v jaderné lokalizační doméně C-konce, jsou acetylovány pomocí PCAF a p300. 11