Motto: Zastaralé tvrzení, že radiační poškození je nevyléčitelné, je zodpovědné za nevynucená úmrtí a tělesnou zchátralost.

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 24 Motto: Zastaralé tvrzení, že radiační poškození je nevyléčitelné, je zodpovědné za nevynucená úmrtí a tělesnou zchátralost. 2. MOLEKULÁRNÍ A BUNĚČNÉ ZMĚNY O EXOZICI IONIZUJÍCÍMU ZÁŘENÍ (Jan Österreicher, Jiřina Vávrová, Jiří Stulík, Tomáš Olejár, Jiří Škopek) Úplné popsání efektu ionizujícího záření v organizmu není úkolem této kapitoly. Zde jsou vybrány úseky z radiobiologie, které mají největší význam z hlediska patogenetického a klinického. V této kapitole je problematika postradiačních změn po expozicích ionizujícímu záření uměle rozdělena na úroveň molekulární, buněčnou a orgánovou. Je nutné si uvědomit, že popisované změny v ozářeném organizmu probíhají komplexně a nedělitelně. 2.1 ostradiační změny na úrovni molekulární 2.1.1 Vznik volných radikálů po ozáření oškození na subcelulární úrovni může být způsobeno přímým radiačním zásahem cílových molekul (jejich excitací a ionizací) v závislosti na LE. ravděpodobnost zásahu organické molekuly je totiž relativně malá oproti mechanizmům spojeným s tvorbou reaktivních metabolitů z vody. Radiolýzou vody zářením vznikají následující metabolity: 2H 2 O OH, e-aq, H., H 2 O 2 Atomy vodíku a elektrony jsou okamžitě vychytávány molekulárním kyslíkem za tvorby superoxidu (O 2 - ). Oxidační poškození molekul organických sloučenin je pak v podstatě kaskáda degradačních chemických reakcí, na jejímž konci se jako terminální produkt objevuje malondialdehyd, který je jedním ze základních markerů stupně oxidačního poškození. Volné radikály lze definovat jako atomy, molekuly nebo jejich fragmenty, které mají jeden nebo více nepárových elektronů a jsou schopné krátkodobě samostatné existence. Mohou být elektroneutrální, ale mohou mít i charakter kationtu nebo aniontu. okud radikál střetne neradikálovou molekulu se spárovanými elektrony, může z ní vytvořit nový radikál a reakce se řetězově rozbíhá. okud se střetnou dva radikály, mohou své nepárové elektrony spárovat a radikálovou řetězovou reakci tak ukončit. Volné radikály mohou být odvozené od kyslíku, dusíku nebo od organických sloučenin. Mezi volné kyslíkové radikály řadíme superoxidový radikál O 2.-, perhydroxylový radikál HO 2., peroxid vodíku H 2 O 2, hydroxylový radikál OH. a singletový kyslík 1 O 2.. Hydroxylový radikál je nejvíce poškozují substancí pro cílové biomolekuly. Hydroxylový radikál je extrémně reaktivní oxidační radikál, který vzniká trojelektronovou redukcí molekuly kyslíku anebo jednoelektronovou redukcí peroxidu vodíku. Tento

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 25 radikál reaguje s většinou biomolekul. Je natolik nestabilní, že v podstatě nedifunduje do okolí a všechny jeho reakce probíhají v místě vzniku. Svou vysokou reaktivitou způsobuje velké poškození biomolekul. Vzhledem ke své vysoké reaktivitě totiž s velkou rychlostí reaguje se všemi biomolekulami (sacharidy, aminokyselinami, fosfolipidy, nukleotidy a organickými kyselinami), kdy jim odnímá vodík. říkladem odnětí vodíku (H + ) je reakce OH. s lecitinem, který je významným membránovým fosfolipidem. Touto reakcí vzniká lipidový radikál, který spouští další radikálové reakce s výsledným poškozením membrán. Stejným způsobem reaguje OH. s deoxyribózou v DNA a aminokyselinovými zbytky bílkovin. Tento kyslíkový radikál je také schopen adiční reakce s aromatickými kruhy purinových a pyrimidinových zásad, jež jsou součástí DNA a RNA. Organické radikály vznikají homolytickým štěpením kovalentní vazby nebo v reakcích přenosu elektronu. Tyto radikály vznikají působením ionizujícího záření nebo ostatními fyzikálními, chemickými a ekologickými mechanizmy. Celá řada těchto radikálů vzniká fyziologicky nebo patologicky při metabolických procesech (např. semiubichinonový radikál při přenosu elektronů v dýchacím řetězci, askorbátový radikál při detoxikačních reakcích kyseliny askorbové, atd.). Radikály odvozené od organických sloučenin mají nepárový elektron na uhlíku nebo na dusíku. 2.1.2 oškození biologických systémů prostřednictvím volných radikálů Cílovými strukturami radikálového poškození jsou lipidy (mastné kyseliny), jejichž peroxidací vzniká lipidový radikál. Vzhledem ke skutečnosti, že lipidy jsou základní stavební součástí buněčných membrán, jejich poškozením dochází zejména k poruchám transportu a ke změnám v odolnosti, což může v důsledku způsobit, že membrána přestane působit jako překážka pro makromolekuly (enzymy). Rovněž nekontrolovaným se stává pohyb iontů na membránách. Tato skutečnost má v případě kalciových iontů pro buňku letální následky. Dalším mechanizmem, kterým se peroxidované mastné kyseliny podílejí na membránové poruše, je snížená mobilita proteinů membrány. Reaktivní metabolity vzniklé radiolýzou vody modifikují aminokyselinové jednotky na proteinech, čímž se mění jejich konformace. Tato změna má za následek ztrátu nebo omezení původní biologické funkce. Změněné funkční skupiny aminokyselin mohou vytvářet mezi sebou navzájem nebo s jinými látkami další vazby, čímž se zásadně mění původní podstata proteinu. Např. i malé dávky záření porušují oxidativní fosforylaci v mitochondriích. Změny v konformaci, způsobené oxidačním poškozením, způsobují hydrofobii a následnou agregaci bílkovin. Oxidačně poškozené proteiny jsou odstraňovány hydrolýzou proteolytickými enzymy. Nahromaděné poškozené proteiny mohou samy působit prooxidačně a způsobit poškození dalších struktur, zejména jiných proteinů či DNA. Nukleové kyseliny (zejména DNA) jsou zvlášť citlivé vůči oxidačnímu poškození způsobenému ionizujícím zářením či fotooxidací. oškození se uskutečňuje na purinové a pyrimidinové heterocyklické bázi, anebo na sacharidové jednotce. Oxidace dusíkatých bází zapříčiňuje mutace a oxidační štěpení indukuje štěpení jednoho nebo obou řetězců dvojšroubovice DNA. DNA je vůči záření mnohem citlivější než RNA. Neporušená DNA je in vivo podstatně citlivější než in vitro. Hydroxylový radikál a proton, které se tvoří radiolýzou vody, vytrhnou vodík z vazby uhlík-vodík na deoxyribóze v molekule DNA. Vzhledem k vysoké reaktivitě hydro-

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 26 xylového radikálu s aromatickými zbytky jsou modifikovány i dusíkaté zásady na molekulách nukleových kyselin. Superoxid působí sekundárně jako reduktant iontů přechodných kovů a jako substrát pro dismutační reakci, při které vzniká H 2 O 2. Redukovaný kov pak spolu s H 2 O 2 tvoří hydroxylový radikál. Účast H 2 O 2 na poškození DNA závisí na jeho koncentraci, která je za fyziologických podmínek velmi malá účinkem katalázy, která ji rozkládá na kyslík a vodu. Nadměrná produkce H 2 O 2 vede k mutacím, štěpení DNA a až ke smrti buňky. eroxid vodíku je totiž substrátem pro tvorbu hydroxylového radikálu. Výsledným efektem, který je iniciován ionizujícím zářením na genomu, jsou bodové mutace jednotlivých nukleotidových párů (konverze, delece, adice) a chromozomální translokace. 2.1.3 Vliv ionizujícího záření na DNA a RNA ostradiační změny na molekule DNA jsou závislé na velikosti molekuly, struktury a konformaci. Ozáření vyvolává zlomy, které se mohou týkat obou řetězců dvojšroubovice DNA a které vedou k fragmentaci molekuly na více úseků s menší molekulovou hmotností; vícenásobné zlomy jen na jedné spirále a uvolnění vodíkových vazeb, které je spojují vedou ke zvýšené ohebnosti molekuly. Následně mohou vznikat nové vazby (retikulace) uvnitř jedné molekuly DNA, anebo mezi dvěma molekulami DNA navzájem. Výsledným efektem, který je iniciován ionizujícím zářením na genomu, jsou bodové mutace jednotlivých nukleotidových párů (konverze, delece, adice) a chromozomální translokace. o ozáření dochází v buňkách ke zpomalení syntézy vlastní DNA, neboť buňka reaguje na poškození genetického kódu tvorbou supresorových proteinů (např. p53), aby zamezila přenos případných genových defektů do filiálních buněčných generací. Značná část radiačního poškození DNA je reverzibilní. Buňky jsou vybaveny enzymovými systémy, které mohou poškození částečně anebo úplně opravit. oškození DNA jsou reparována postupně pomocí 3 -fosfodiesterázy, DNA polymerázy β a DNA ligázy. oškozené baze jsou odstraněny DNA glykosylázou s následnou náhradou, nebo endonukleázou a DNA deoxyribofosfodiesterázou. Reparace je pak ukončena za pomoci DNA polymerázy a DNA ligázy. Radiační poškození RNA je podstatně menší než u DNA. Rozsah retikulací je malý, neboť jejich molekulová hmotnost je proti DNA podstatně menší. 2.1.4 Rozvoj postradiační molekulární odpovědi Současný pohled na buněčnou odpověď vůči ionizujícímu záření je spojením tradičních radiobiologických pojmů a zároveň zcela nových informací o molekulárních mechanizmech regulujících průběh buněčného cyklu, aktivaci reparačních mechanizmů poškozených vláken DNA a také spuštění programované buněčné smrti. Vzájemná koordinace těchto klí-

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 27 čových dějů zabraňuje vzniku genové nestability v buňce, genovým mutacím a případné nádorové transformaci. Obecně můžeme hovořit o indukci buněčné stresové reakce, jejíž nástup je závislý na přítomnosti signálu, jenž informuje jednak o možném poškození molekul DNA a jednak obecně o působení škodlivé noxy (ionizujícího záření) na buněčnou populaci. Výsledkem je pak indukce exprese celé řady genů, které kontrolují průběh buněčné stresové reakce na působící agens. Šíření informace v buňce je zprostředkováno pomocí signálních řetězců, které jsou většinou složeny z pěti základních komponent, a to membránových proteinů, enzymů regulujících fosforylaci proteinů, adapterů tj. propojovacích proteinů, buněčných protoonkogenů a transkripčních faktorů. receptor s kinázovou aktivitou MEMBRÁNA Sos Ras proto-onkogen CYTOLASMA adapter Raf serinová proteinkináza serinová a tyrosinová proteinkináza MEK MEK MAK MAK MAK J Á D R O transkripční faktor Obr. 2.1 řenos signálu přes buněčnou membránu do jádra prostřednictvím MA kináz Vysvětlivky: - fosfátová skupina; Sos adapter ( Son of sevenless protein navazující na kinázu nevyžadující fotoreceptor R7 v oku Drosofily)- ; Ras proto-onkogen; Raf- serinová proteinkináza; MEK mitogeny aktivovaná kináza, MAK-mitogeny aktivovaná protein kináza.

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 28 Jak může ionizující záření ovlivňovat přenos signálu v buňce? ředpokládá se, že záření zasahuje klasickou signální cestu probíhající od membránového receptoru směrem do buněčného jádra a navíc vlastní poškození molekuly DNA aktivuje další signální dráhu, pomocí které buňka vnímá alteraci DNA a reaguje na tuto situaci příslušnými reparačními pochody. Nejprve se zmíníme o modulaci klasické signální cesty, která může nastávat na několika úrovních. V prvním případě se jedná o aktivaci membránového receptoru s kinázovou aktivitou, a to zcela nezávisle na přítomnosti specifické ligandy. Jak již bylo zmíněno, vazba ligandy na receptor s kinázovou aktivitou vede k jeho autofosforylaci, která je nezbytná pro další šíření signálu do buňky. Aktivace receptoru je později zablokována pomocí membránově vázané fosfatázy, která odštěpí fosfát z receptorové bílkoviny a tím se spojení se signální cestou přeruší. V případě ionizujícího záření dochází pravděpodobně k reversibilní oxidaci SH-skupiny ležící v aktivním centru fosfatázy, čímž je funkce tohoto enzymu inhibována a tím se indukuje spontánní na přítomnosti ligandy nezávislá aktivita receptorové kinázy. Další složkou signální cesty, která je ovlivněna ionizujícím zářením, je Ras protoonkogen. Ionizující záření stimuluje zvýšenou produkci tohoto proto-onkogenu, což je spojeno s nárůstem radiorezistence buněk. Třetí úrovní, kde se uplatňuje vliv ionizujícího záření, je aktivace transkripčních faktorů. V tomto směru je pro indukci buněčné odpovědi vůči ionizujícímu záření významná zejména aktivace nukleárního transkripčního faktoru κb (NF-κB). Tento faktor se za normálních okolností nachází v cytoplazmě buněk, a to ve vazbě na inhibiční protein IκB-α, který zabraňuje přemístění NF-κB do jádra. ro aktivaci NF-κB je tedy nezbytné odštěpení od tohoto inhibičního proteinu, což fyziologicky nastává po předchozí fosforylaci IκBα proteinu. Ionizující záření přímo aktivuje NF-κB, poněvadž u ozářených buněk byla opakovaně prokázána vazba NF-κB na DNA molekulu. Tato aktivace je v tomto případě pravděpodobně zprostředkována reaktivními kyslíkovými mediátory a s tím související změnou redox potenciálu buňky. Další signální cesta, jak již bylo zmíněno, je aktivována neopravenými nebo nereplikovanými úseky DNA. Výsledkem aktivace této signální dráhy je stresová reakce vedoucí k charakteristické blokádě buněčného cyklu v G 1 /S a G 2 /M fázi. Inhibice buněčného cyklu by měla poskytnout čas nezbytný pro reparaci poškozených úseků DNA. ředpokládá se, že klíčovou molekulou, která je odpovědná za zastavení buněčného cyklu v G 1 fázi, je protein T53. Tento protein působí vlastně jako transkripční faktor, jenž po vazbě na specifické sekvence DNA aktivuje transkripci dalších genů, které zprostředkují účinky T53 na inhibici buněčného dělení či aktivaci procesu programované buněčné smrti. Za výkonnou molekulu blokující buněčný cyklus v G 1 fázi se považuje protein CDKN1A (inibitor cyklin dependentních kináz). CDKN1A svým účinkem brání cyklin dependentním kinázám fosforylovat a tím inaktivovat retinoblastoma protein-rb. Tedy, CDKN1A do jisté míry pomáhá zachovat RB protein v aktivní formě. Funkce RB proteinu potom spočívá v negativní regulaci exprese transkripčního faktoru E2F, jenž je nezbytný pro aktivaci transkripce genů specifických pro S-fázi. Nefosforylovaný (aktivní) RB protein váže E2F faktor a tím brání jeho vazbě na DNA. Jakmile ale dojde k fosforylaci RB proteinu pomocí cyklin-dependentní kinázy, E2F transkripční faktor se uvolní z vazby na RB protein a spouští se proces transkripce genů typických pro S fázi buněčného cyklu.

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 29 Dále CDKN1A spouští cestou aktivace proteinu RAD 51 opravu poškozené DNA. RAD 51 opravuje zejména nebezpečné dvojité zlomy DNA. Buněčná odpověď na radiační působení se ukazuje být mnohem komplikovanější. Výzkumy prokazují, že kromě indukce inhibice buněčného dělení a reparace DNA dochází také k aktivaci transkripce tzv. rychle reagujících genů, které většinou kódují různé transkripční faktory převážně onkogenní povahy patřící do genových seskupení typu c-jun, c-fos, a Egr-1. Tyto transkripční faktory, které za normálních okolností zprostředkovávají obecné buněčné pochody jako je proliferace nebo diferenciace, přenášejí v případě radiace časné signály, na jejichž základě se spouští dlouhodobě trvající změny genové exprese, které umožňují savčím buňkám adaptovat se na radiační stres. Identifikace produktů těchto tzv. genů sekundární odpovědi je velmi důležitá, protože tyto proteiny pravděpodobně vystupují jako efektorové molekuly v biologických následcích ionizujícího záření. Jako příklady některých efektorových genů působících v pozdější fázi buněčné reakce na ionizující záření lze uvést např. tumor nekrotizující faktor alfa (TNF α), basický fibroblastový růstový faktor (bfgf) a transformující růstový faktor beta (TGF β). Tento poslední cytokin je pravděpodobně odpovědný za vznik radiační fibrózy plic. Jednou z posledních možností, jak zabránit vzniku buněčného klonu s poškozenými úseky DNA, je navození programované buněčné smrti. Již jsme naznačili, že pro spuštění programované buněčné smrti je významná účast T53 proteinu. řítomnost nemutované formy tohoto proteinu je totiž nezbytná pro indukci Fas (CD95) receptoru v membráně ozářených buněk. Fas receptor patří do rodiny receptorů vázajících TNF-α a jeho hlavní funkcí je po vazbě Fas ligandy vyvolat proces programované buněčné smrti v senzitivních buňkách. rávě ionizující záření se ukazuje být výrazným induktorem Fas ligandy, a to přes uvolnění ceramidu v buněčné membráně (Obr.2.2). Je tedy možné shrnout, že aktivace T53 a produkce ceramidu spojují stresovou reakci vyvolanou zářením s CD95 signální cestou indukcí programované buněčné smrti. Záření sphingomyelináza CD95-L CD95 R Membrána CERAMID apoptóza CD95-L jádro Obr 2.2 Mechanizmus postradiační indukce programované buněčné smrti Vysvětlivky: CD 95-L liganda CD 95; CD 95-R receptor CD 95.

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 30 2.2 ostradiační změny na úrovni buněčné 2.2.1 Efekt ionizujícího záření v buňkách Máme-li charakterizovat citlivost buněk k ionizujícímu záření, stále platí základní radiobiologický zákon formulovaný v roce 1906 francouzskými vědci Bergonié a Tribondeauovou, že radiosenzitivní tkáně jsou tkáně s velkým počtem rychle se dělících málo diferencovaných buněk. Naopak radiorezistentní jsou tkáně s málo se dělícími nebo nedělícími se diferencovanými buňkami. Skutečně, použijeme-li jako kriterium buněčnou smrt, rychle se dělící systémy (kostní dřeň, gonády a střevo) jsou více radiosenzitivní než nedělící se systémy nervové buňky. Dále platí, že nediferencované buněčné typy (kmenové buňky) jsou více citlivé k ionizujícímu záření než buňky diferencované. Vysoce radiosenzitivní jsou dále všechny typy tkání v průběhu ontogeneze a postnatálně v průběhu růstu. Ozáření tkání v průběhu diferenciace a růstu má za následek těžké malformace orgánů spojené s vysokou letalitou a karcinogenezí. eriferní lymfocyty představují výjimku z tohoto zákona, přestože jsou buňkami diferencovanými, jsou velmi radiosenzitivní (D 0 = 2 Gy). D 0 je dávka ionizujícího záření, po které je frakce přežívajících buněk redukován na 37 %. Tato radiosenzitivita je vysvětlována způsobem buněčné smrti. Diferencované lymfocyty hynou po malých dávkách záření tzv. programovanou buněčnou smrtí označovanou jako apoptóza. Je dobře známo, že stupeň radiačního poškození záleží jednak na buněčném typu a dále na celkové dávce záření, dávkovém příkonu, typu radiačního poškození (vysoký LET versus nízký LET), způsobu ozáření (jednorázová versus frakcionovaná dávka) a také na růstových podmínkách v mediu. Vysoké dávky záření (> 100 Gy) vedou k tzv. okamžité (instant) smrti buněk v důsledku koagulace proteinů. o nižších dávkách hynou nedělící se buňky tzv. interfázovou smrtí. Buněčná smrt v G 0 fázi může být způsobena nekrózou nebo apoptózou. Nekróza je spojována s vyššími dávkami záření a jejím důsledkem je zvětšení buněčných organel, dezorganizace buňky a porušení buněčné membrány. Apoptóza je spojována s nižšími dávkami záření a buňky jsou charakterizovány některými změnami, zahrnujícími kondenzaci chromatinu, tvorbu apoptotických tělísek, tvorbou puchýřků na membráně a degradací chromozomální DNA endonukleázami na nukleozomální kousky obsahující asi 180 párů bází. Dělící se buňky hynou tzv. mitotickou smrtí. V důsledku ozáření dochází k inhibici buněčného dělení. Buňka ozářená v kterékoliv fázi buněčného cyklu pokračuje ve svém metabolizmu, ale není schopna průchodu mitózou, která klade vysoké nároky na mechanické podmínky pro přeskupení subcelulárních struktur. okud je poškození menšího stupně, buňka projde jednou či dvěma mitózami, než ztratí schopnost dalšího dělení. Nejnižší dávky vedou k tzv. bloku v určité fázi buněčného cyklu. V této době se buňky nedělí a je jim poskytnut čas pro reparaci poškození. V případě, že je poškození irreparabilní, je iniciována apoptóza. Z prací na buněčných liniích se ukazuje, že celkový čas, který mají buňky k dispozici při reparaci poškození DNA před potenciálním vstupem do apoptózy, je kritickým determinantem radiosenzitivity těchto buněk. Obecně se má za to, že nejcitlivější fází buněčného cyklu je vlastní mitóza, dále pak G 1 fáze, nejnižší je radiosenzitivita v S fázi. rotichůdné trendy byly zjištěny u G 2 fáze. Dávky řádově v cgy mohou vyvolat genové či chromozómové mutace buněk, není-li poškození reparováno, může vést ke vzniku maligní transformace buňky. Jevy, které byly popsány v předchozích odstavcích, nepostihují konečný výsledek působení ionizujícího záření na buňku a její komponenty. Ten je spoluurčován teprve uplatněním obnovných mechanizmů, reparačních dějů, které v závislosti na časovém faktoru odstraní část důsledků ozáření. V savčím organizmu je mechanizmus reparace významný především u

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 31 tzv. pomalu reagujících tkání (plíce, ledviny). ro obnovu rychle reagujících tkání (kostní dřeň, střevo) je nejdůležitější obnova cestou proliferace, buněčného dělení vycházejícího z přežívající frakce kmenových buněk. 2.2.2 Vliv ionizujícího záření na rozvoj zánětlivé odpovědi a fibrózy V konvenčních radiobiologických modelech je reakce tkáně na ozáření ionizujícím zářením chápána a vysvětlována mechanizmem úbytku potenciálně mitotických buněk (model kmenové buňky). Vedle tohoto modelu však existuje velké množství dokladů o působení cytokinového systému, tvořícího humorální komponentu této reakce. Ten tvoří základ pro mezibuněčnou komunikaci mezi imunitními buňkami, stromálními buňkami, funkčními buňkami a fibroblasty. Cytokiny, intercelulární signální polypeptidy, jsou látky produkované určitým typem buněk na základě genové exprese již hodiny po ozáření. o svém uvolnění jsou schopny cestou autokrinní (vazba na receptor na povrchu membrány stejné buňky), parakrinní (vazba k jiné buňce v místě vzniku) či endokrinní (účinek zprostředkovaný přenosem krví do vzdálených míst), informovat a ovlivňovat sebe samy či jiné buňky (obr. č. 2.5). Jedná se o multifunkční faktory kontrolující širokou škálu procesů, zahrnujících aktivaci, růst a diferenciaci buněk, chemotaxi, syntézu polypeptidů a mezibuněčné matrix. Vyskytují se buď volné, vázané k povrchu buňky (lehce, kovalentními vazbami nebo asociací s receptorem), či nekovalentně, např. transmembránově vázané. Molekulární hmotnost se pohybuje okolo 15 25 kda, jejich molekuly jsou rozměrově velmi heterogenní, což je způsobeno především rozličným karboxylovým či aminokyselinovým zakončením molekuly. Většina cytokinů je vytvářena ve formě prekurzorů, obsahující tzv. signální peptid, který se zúčastňuje průchodu membránou. rvní cytokin interferon byl popsán roku 1957 Lindemannem. Od té doby se podařilo izolovat více než sto látek podobné povahy a objevují se stále nové druhy a poddruhy. Názvy a řazení jednotlivých cytokinů bylo a je odvozováno jednak od buněk, které je produkují (interleukiny, monokiny, lymfokiny), ale také jsou pojmenovávány podle objevitelů, podle prvních poznaných účinků a pod. To vše činí velkou skupinu cytokinů poněkud méně přehlednou. V tabulce 2.1. jsou uvedeny nejdůležitější cytokiny, které se účastní cytokinové mezibuněčné komunikace odstartované ozářením. Dá se říci, že této reakce se zúčastňují stejné cytokiny, které se podílejí při rozvoji zcela odlišných reakcí např. hojení ran, infekčních onemocnění či šokových stavů. Jedná se tedy o universální látky, které jsou zapojeny v různých tkáňových procesech. Cytokiny indukované zářením můžeme z hlediska funkce rozdělit v podstatě do dvou skupin. rvní, tvořená pro-zánětlivými cytokiny (především IL-[Interleukin] 1, IL-6, TNF [Tumor necrosis faktor] alfa) a druhá skupina, pro-fibrogenních cytokinů (IL-1, IL-4, TNFα, DGF [platelet-derived growth factor], TGF [transforming growth factor] β, peptidy extracelulární matrix). Dalšími látkami, které hrají roli v komunikaci buněk a matrix, jsou adhezivní molekuly.

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 32 Tabulka č. 2.1 řehled nejdůležitějších cytokinů, které se uplatňují v procesu postradiační odpovědi Interleukin 1 název zkratka zdroj produkce funkce IL-1α, β makrofágy, fibloblasty, endoteliální buňky, pmn indukce syntézy kolagenu, mitogen fibroblastů, matrix, chemotaxe lymfocytů Interleukin 4 IL-4 makrofágy, T lymfocyty indukce syntézy kolagenu Interleukin 6 IL-6 makrofágy, T lymfocyty, diferenciace B lymfocytů, aktivace T lymfocytů fibroblasty, pmn makrofágy, aktivované Tumor necrosis factor chemotaxe a adheze pmn, mitogen fibroblastů, TNF α lymfocyty, fibroblasty, alfa matrix pmn latelet-derived growth factor Transforming growth factor beta Intercellular adhesion molecule - 1 Lymphocyte function associated antigen 1 Extracelulární matrix (kolagen I, II, IV, fibronektin) DGF TGF β ICAM-1 LFA-1 destičky, makrofágy, fibroblasty destičky, makrofágy, fibroblasty, endoteliální buňky,pneumocyty ii typu monocyty, makrofágy, endoteliální a epiteliální buňky leukocyty fibroblasty proliferace fibroblastů indukce syntézy kolagenu, fibronektinu, chemotaxe a mitogen fibroblastů, indukce il-1 adhezivní molekula usnadňující vazbu leukocytů a jiných buněk a matrix adhezivní molekula ze skupiny integrinů zprostředkovávající vazbu endoteliálních buněk a leukocytů chemotaxe a mitogen fibroblastů fibrotická reakce mn olymorfonukleární buňky. Anglické názvy cytokinů jsou uvedeny pro objasnění zkratek, užívaných v odborné literatuře. Jak toto rozdělení naznačuje, po ozáření dojde k rozvoji dvou typů reakce, které do jisté míry přechází plynule jeden ve druhý. V akutní fázi se jedná o zánětlivou reakci, ve které se účastní typicky zánětlivé cytokiny IL-1, IL-6, TNFα produkované především aktivovanými imunitními buňkami (makrofágy, lymfocyty, MN-[olymorfonukleární buňky]). Díky uvolnění těchto cytokinů dojde k aktivaci dalších imunitních buněk, především makrofágů a dále stromálních buněk, které začnou produkovat pro-fibrotické cytokiny (TGFβ, DGF, TNFα, IL-1, IL-4 a další). Tato produkce, řádově měsíce po ozáření, vede k rozvoji typické pozdní, chronické fáze, tedy fibróze. V této fázi, které může, ale v mnoha případech nemusí předcházet klinicky vyjádřená forma akutní reakce, se pomocí zmíněných pro-fibrotických cytokinů, které jsou produkovány hlavně makrofágy, fibroblasty, destičkami, endoteliálními a epiteliálními buňkami, aktivují pochody s výslednou nadprodukcí intercelulární matrix, metaloproteinás a fibrocytů. Tímto mechanizmem, tedy postupné cytokinové aktivity až k fibrotizaci tkáně, ke kterému se přidává i možný přímý vliv ionizujícího záření indukující předčasnou diferenciaci fibroblastů ve fibrocyty schopné produkce extracelulární matrix, dochází k nahromadění především kolagenních vláken, které jsou pak ve tkáních příčinou konstrikcí, snížení prokrvení, zhoršení metabolických poměrů, vedoucí ke snížení funkceschopnosti orgánů s možností jejich selhání. Z tohoto důvodu jsou pozdní reakce na ozáření nebezpečné a principům jejich vzniku je věnována velká pozornost. Jako aplikace cytokinové reakce ve tkáni uvádíme modelové příklady ozářených plic, kůže a střevní sliznice. V plicní tkáni dochází po ozáření k rozvoji zánětlivé reakce s edémem v akutní fázi od 4 týdnů po ozáření, charakterizované známkami pneumonitidy, která přechází posléze do

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 33 chronické fáze vznikem fibrózy po měsících až letech. Tato pozdní reakce se mnohdy objeví i bez klinicky vyjádřené předchozí akutní fáze. rvní týden po ozáření dochází k úbytku počtu alveolárních makrofágů z alveolárního prostoru, který pak v 2-4 týdnu převýší 2-3 krát normální počty při zvýšených hladinách TGFβ, IL-1, IL-4, DGF, TNFα, ICAM-1, LFA-1. Např. zvýšená exprese mrna pro TNFα detekována již 1 hodinu po ozáření se poté vrací k normální úrovni, aby se hladina TNFα následně zvýšila pro celé období akutní a subakutní fáze pneumonitidy. Exprese mrna pro IL-1β v průběhu prvního týdne vede ke zvýšené hladině IL-1β 2 26 týden po ozáření. V období 2 8 týdne, a poté ve 26. týdnu jsou zvýšeny hladiny TGFβ (podtypy β1 a β3) a peptidů extracelulární matrix ( kolagenu typů I, II, IV a fibronektinu ). Tyto výsledky přinesly studie in vitro a in vivo na myších a potkaních modelech, které jsou vhodné pro srovnání s klinickými studiemi. V průběhu radioterapie dochází většinou ke konci ozařovacího schématu k rozvoji radiační pneumonitidy s elevací hladiny TGFβ. Silný vliv TGFβ u radiačního postižení plic je zřejmý i ze studií, prokazujících vyšší výskyt fibrózy při použití doplňujících terapeutických zásahů, které zvyšují hladinu TGFβ. Velmi zkráceně můžeme shrnout, že jak experimentální tak i klinické práce ukazují na složitost cytokinového komplexu při postižní plicní tkáně. Nejdůležitější roli v rozvoji akutní a chronické fáze plicního poškození zřejmě hrají cytokiny TGFβ, TNFα a IL-1 produkované především alveolárními makrofágy, MN a fibroblasty. Reakce kůže je charakterizována především vznikem erytému, dermatitidy s edémem, deskvamacemi až vznikem puchýřů a ulcerací. V chronické fázi se pak objevují teleangiektazie a fibróza. Většina experimentálních prací používá model ozáření prasečí kůže pro její největší podobnost s kůží lidskou. V těchto pracích je zaznamenána zvýšená exprese mrna TGF β1 jak ve fázi erytému (3 6 týdnů) tak v chronické fázi fibrózy (26 52 týdnů) po ozáření jednorázovou dávkou 14 až 140 Gy. Rok po ozáření je zvýšená hladina TGFβ v myofibroblastech či endoteliálních buňkách a nové fibrotické tkáni. odobné nálezy se objevují v pracích na jiných zvířecích modelech. Lidská kůže je tvořena hlavním intercelulárním materiálem, což jsou kolagenní vlákna. Ze 70 80 % jsou tvořena kolagenem typu I a asi z 10-15 % kolagenem typu III. V klinické studii byla potvrzena aktivace tvorby kolagenních vláken souměrně obou typů I a III radiací, která je výsledkem spolupráce pro-fibrotických cytokinů, mezi něž patří TGFβ, IL-2, DGF či ICAM-1, které vedou k proliferaci a diferenciaci fibroblastů. Zvýšená tvorba kolagenních vláken přetrvává 1 až 2 roky a poté se vrací k normální úrovni. Reakce střevní sliznice, která je citlivá na ozáření, se projevuje především vznikem enteritidy a ulceracemi v akutní fázi a poté rozvojem fibrózy v chronické fázi. odle experimentálních i klinických studií dochází k patologickým změnám na sliznici, které jsou vždy spojeny s vyššími hladinami TGF β jak v akutní fázi (se zvýšeným počtem zánětlivých buněk makrofágů, lymfocytů a MN ve střevní sliznici), tak i ve fázi vzniku fibrózní reakce. V experimentu je ověřena účast i dalších cytokinů IL-1β, DGF po celou dobu reakce po ozáření. V některých současných studiích byl pozorován pozitivní efekt léčebné aplikace jiných růstových faktorů, např. KGF [keratinocytární růstový faktor] na zmírnění těžké akutní fáze enteritidy a zlepšení trofiky střevní sliznice.

KLINICKÁ RADIOBIOLOGIE 34 2. Ionizující záření Cílová buňka Cytokiny DNA m RNA 1. Cílová buňka Mezibuněčná matrix 2. Obr. 2.3 Schéma intercelulární komunikace. 1. autokrinní účinek, 2. parakrinní účinek, 2. cytokin v pevné vazbě na membránu.