CERTIFIKOVANÁ METODIKA

VÝZKUMNÝ ÚSTAV ŽIVOČIŠNÉ VÝROBY, v.v.i. Praha Uhříněves CERTIFIKOVANÁ METODIKA Predikce střevní stravitelnosti dusíkatých látek uniklých degradaci v bachoru in vitro metodou Autoři Ing. Olga Tománková Ing. Petr Homolka, Ph.D. Oddělení výživy a krmení hospodářských zvířat Oponenti Doc. Ing. Bohuslav Čermák, CSc. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Ing. Juraj Saksún Ministerstvo zemědělství České republiky Odbor živočišných komodit Metodika vznikla jako součást řešení výzkumného záměru MZe ČR MZE0002701404. 2009

ISBN 978-80-7403-036-9

OBSAH I. CÍL METODIKY A DEDIKACE 6 II. VLASTNÍ POPIS METODIKY 6 Teoretická část metodiky 6 Experimentální část metodiky 8 Výsledky 11 Závěr 20 III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ 20 IV. POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY 20 V. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY 21 VI. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE 22

I. CÍL METODIKY A DEDIKACE Cílem práce je poskytnout, pomocí ověřené in vitro metody s vhodným enzymem, predikční rovnice pro stanovení střevní stravitelnosti dusíkatých látek krmiv nedegradovaných v bachoru přežvýkavců. Poskytnout metodu s predikčními rovnicemi zemědělským laboratořím za účelem rychlejšího a méně náročného stanovení, s lepším zabezpečením standardních podmínek a reprodukovatelností výsledků. Metodika vznikla jako součást řešení výzkumného záměru MZE0002701404. II. VLASTNÍ POPIS METODIKY Teoretická část metodiky Experimentální část metodiky: Cíl práce Materiál a metodika Výsledky Závěr Teoretická část metodiky Nově získané teoretické poznatky z výzkumu fyziologie výživy přežvýkavců přispěly k vyvinutí dnes už prakticky aplikovaných systémů hodnocení krmiv a potřeby živin. Součástí těchto systému je i systém hodnocení N-látek pro přežvýkavce, který byl převzat z francouzského systému PDI - protein skutečně stravitelný v tenkém střevě (Vérité et. al., 1987, INRA. 1989) a postupně novelizován (Baudet, 1995). Umožňuje komplexněji zhodnotit množství a kvalitu N-látek v krmivech a krmných dávkách a optimalizovat zastoupení jednotlivých frakcí N-látek až na úroveň aminokyselin (Bateman, 2001, Borucki Castro, 2007). Praktickým přínosem dokonalejšího hodnocení krmiv je přesnější sestavování krmných dávek a ekonomičtější krmení. Dříve používané stravitelné dusíkaté látky (SNL) nerespektovaly fyziologické pochody trávení dusíkatých látek a protein dostupný organismu se odvozoval z rozdílu mezi množstvím N-látek přijatých v krmivu a vyloučených výkaly. Základním rysem vývoje současného systému byla snaha kvantifikovat změny přijatých N-látek individuálně, v jednotlivých úsecích trávícího traktu a zohlednit degradovatelnost jako důležitou charakteristiku tohoto systému. Z hlediska degradovatelnosti se N-látky krmiva dělí na dvě části s odlišným využitím a to na degradovatelné, které představují zdroj dusíku pro bachorové mikroorganismy a nedegradovatelné, které jsou přímým zdrojem aminokyselin pro zvíře. Tímto rozlišením má systém možnost odděleně hodnotit stupeň krytí požadavků mikroorganizmů osídlujících bachor a organizmus hostitele na přívod N-látek. 6

Každé krmivo je především zdrojem energie pro mikrobiální proteosyntézu v bachoru a zároveň je zdrojem nedegradovaných N-látek přecházejících přes bachor do tenkého střeva, kde probíhá enzymatické trávení. Celkový protein vstupující do tenkého střeva má rozdílný původ. Větší část tvoří mikrobiální protein, menší část nedegradovaný protein krmiva který unikl degradaci v bachoru a zbytek proteinu je endogenního původu (Sniffen et al., 1992, Russel et al., 1992). Vzájemný poměr mikrobiálního proteinu a proteinu nedegradovaného v bachoru je ovlivňován degradovatelností. Hlubší poznání trávících a metabolických pochodů u přežvýkavců je podmíněno i intenzivním rozvojem jednodušších a rychlejších alternativních metod, umožňujících predikci výživné hodnoty. Pro hodnocení využitelnosti krmiv přežvýkavci mají údaje o střevní stravitelnosti N-látek nedegradovaných v bachoru značný význam. Spolu s mikrobiálním proteinem představují využitelné N-látky krmiva. Stern et al., (1997) nabízí ve své práci sumarizaci alternativních metod proteinové degradace. Jiní autoři uvádějí vzájemné porovnání hodnot stanovených těmito metodami (Schwab et al., 2003, Kononoff et al., 2007). Základní metodou pro zjišťování stravitelnosti N-látek krmiv je metoda in vivo (Vencl, 1992, Třináctý et al., 2005). Pomocí metody in vivo se hodnoty získávají výpočtem na základě údajů bilančních pokusů. Přiblížit se těmto hodnotám je možné metodou mobile bag, která je nejběžnější optimální metodou pro vyhodnocení stravitelnosti jak proteinu tak aminokyselin (Berthiaume, 2000, Van der Poel et al., 2005, Borucki Castro, 2007, Homolka et al., 2007, Homolka et al., 2008). Je však obtížnější neboť využívá kanylovaná zvířata s bachorovou a duodenální kanylou. Metody stanovení stravitelnosti a degradovatelnosti na zvířatech jsou technicky náročné, vyžadují standardizované podmínky krmení a nelze je realizovat v běžných laboratořích. I z důvodů časové a finanční náročnosti jsou vyvíjeny in vitro metody jako laboratorní postupy aplikovatelné v praxi (Antoniewicz et al., 1992, Van Straalen et al., 1993, Calsamiglia and Stern, 1995) a následně jsou porovnávány jejich hodnoty s hodnotami získanými metodou mobile bag (Tománková and Homolka, 2002, Woods et al., 2003). Perspektivní je v případě in vitro metod využití proteolytických enzymů. S rozvojem produkce proteáz byla zkoumána možnost využití komerčních enzymů i pro predikci stravitelnosti N-látek krmiv nedegradovaných v bachoru. Výhodou in vitro metod je, že stanovení nemusíme provádět na zvířatech. Z toho vyplývá menší variabilita stanovení vlivem prostředí a tím i relativně jednoduší standardizace metody. Nedávají však skutečné hodnoty zjištěné na zvířatech, vhodné jsou především pro měření relativních rozdílů mezi krmivy a proto je nevyhnutné je pro jejich aplikaci v praxi korigovat predikčními rovnicemi. Experimentální práce je zaměřena na stanovení a porovnání hodnot střevní stravitelnosti N-látek uniklých degradaci v bachoru přežvýkavců a na stanovení predikčních rovnic pro dané skupiny krmiv. Porovnání se uskutečnilo na krmivech u kterých byly hodnoty stanoveny enzymaticky in vitro metodou a současně metodou mobile bag. 7

Experimentální část metodiky CÍL PRÁCE Cílem práce je pomocí ověřené in vitro metody s vhodným enzymem odvodit predikční rovnice pro stanovení střevní stravitelnosti dusíkatých látek krmiv nedegradovaných v bachoru přežvýkavců. Izolované proteázy mohou mít odlišné účinky na strukturu proteinu než proteázy bachorové mikroflóry a tenkého střeva. Proto důležitým předpokladem aplikace ověřovaných metod je odvození regresních rovnic závislosti hodnot stanovených metodou mobile bag na hodnotách získaných in vitro enzymaticky pro jednotlivé skupiny krmiv. Stupeň závislosti hodnot pro jednotlivé skupiny krmiv je daný hodnotou korelačního koeficientu r, směrodatnou odchylkou RSD a parametry regresních rovnic a, b. MATERIÁL A METODIKA Pokusná krmiva Soubor krmiv (n = 75) rozdělen do tří skupin obsahoval objemná krmiva (n = 40), jadrná krmiva (n = 24) a extrahované šroty (n = 11). Objemná krmiva zahrnovala zelenou píci, siláže, silážované drtě, zavadnutou siláž, slámu a seno. Do skupiny jadrných krmiv byly zahrnuty i luskoviny a jeden vzorek pšeničních otrub. Třetí skupina obsahovala kromě extrahovaných šrotů i vzorek lněných a podzemnicových pokrutin. Metoda mobile bag Experimenty byly uskutečněny metodou mobile bag (Frydrych, 1992) na čtyřech kanylovaných kravách černostrakatého plemene. Krmivo bylo naváženo do sáčků, inkubováno a pasážováno trávícím traktem přežvýkavců. Metoda mobile bag sestávala ze tří částí: 1. 16hodinová inkubace krmiva v bachoru krávy za účelem získání reziduí. Po inkubaci byly rezidua pečlivě proprány studenou vodou, zlyofilizovány a poté homogenizovány. 2. 2,5hodinová inkubace homogenizovaného rezidua v umělém bachoru v roztoku pepsinu s 0,01 N HCl při teplotě 39 ºC a ph 2. 3. Stanovení střevní stravitelnosti krmiva v sáčcích po jejich vložení do duodena a po pasáži trávícím traktem. In vitro enzymatická metoda: Jako základ pro stanovení bylo použito krmivo, které bylo 16 hodin degradováno v bachoru, následně usušeno a zhomogenizováno. Metoda je dvoustupňová. 8

1. 2hodinová inkubace krmiva v roztoku HCl s pepsinem v inkubační lázni, za účelem simulace prostředí v slezu. 2. 24hodinová inkubace preinkubovaného krmiva v roztoku fosfátového pufru s pankreatinem v inkubační lázni simulující trávení N-látek krmiva v prostředí tenkého střeva. Každý vzorek byl stanoven v trojím opakování. Do každé série byly zařazeny 2 slepé pokusy jako kontrolní měření samotného enzymu v pufru. Slepé pokusy dovolují poznat obsah proteinu v inkubačním roztoku. Pro výpočet stravitelnosti N-látek nedegradovaných v bachoru je nutné stanovit v reziduu krmiva po 16hodinové degradaci obsah dusíku a rozborovou sušinu. Z hodnot obsahu dusíku v reziduích krmiva po inkubaci v čase 24 hodin bylo vypočteno procento dusíku z navážky vzorku. Reciproká hodnota vyjadřuje dusík stravitelný v tenkém střevě. Postup práce: Vzorek rezidua (0,5g), semletý na mlýnku s propadem přes 1 mm síto, byl navážen do centrifugační kyvety a inkubován v třepací vodní lázni po dobu 2 hodin ve 20 ml roztoku 75 mm HCl s pepsinem (2 g. l -1, aktivita 3 manson units mg -1 ) při 39 ºC. Po ukončení inkubace byly kyvety s obsahem centrifugovány při otáčkách 5100 x g po dobu 5 minut a opatrně, pomocí vývěvy, byl odstraněn supernatant. Následně bylo krmivo promyto 3 krát destilovanou vodou, znovu centrifugováno, odstraněn supernatant a neutralizováno přibližně 20 ml předhřátým fosfátovým pufrem ph 7,4. Po neutralizaci byly kyvety s obsahem znovu centrifugovány, supernatant odstraněn a bylo přidáno 20 ml výsledného inkubačního roztoku. Příprava výsledného inkubačního roztoku: Do zásobního roztoku 0,1M fosfátového pufru, ph 7,4 (80 ml 0,2 M NaH 2PO 4 + 420 ml 0,2 M Na 2HPO 4 doplněno do 1litru destilovanou vodou) byl před každým stanovením přidám pancreatin (aktivita 4 x USP, koncentrace 600 mg.l -1 fosfátového pufru). Takto připravený výsledný inkubační roztok byl použit ke 2hodinové inkubaci vzorku. Po dvou hodinách bylo přidáno ještě 20 ml pufru ph 7,4 bez pancreatinu do každé centrifugační kyvety. Celková inkubace probíhala v třepací vodní lázni při teplotě 39 ºC po dobu 24 hodin. Po ukončení inkubace byly vzorky chlazeny ve studené vodě a následně centrifugovány při otáčkách 5100 x g po dobu 5 minut. Zbytek krmiva byl kvantitativně převeden na navlhčený filtrační papír (Filtr kval. KA 1, ø 125 mm, Fischer Scientific), pětkrát promyt destilovanou vodou a po důkladné filtraci zmineralizován podle Kjeldahla (AOAC, 2005). Spektrofotometrické stanovení amoniaku Nesslerovým činidlem. Princip stanovení: Dusík vázaný v bílkovinách se mineralizací s H 2SO 4 převede na amonnou sůl, která se stanoví spektrofotometricky s Nesslerovým 9

činidlem. Nesslerovo činidlo tvoří s amoniakem žlutě zbarvený komplex Hg 2J 2NH 2. Intenzita zbarvení se měří spektrofotometrem. Postup stanovení: Do připravených zkumavek pipetujeme 100 μl zmineralizovaného vzorku, ředíme destilovanou vodou na konečný objem 5 ml, přidáme 200 μl Nesslerova činidla a po promíchaní měříme extinkci na spektrofotometru při vlnové délce 410 nm. Obsah amoniaku odečteme z kalibrační křivky. Příprava kalibrační křivky: Navážíme přesně 0,161 g vysušeného NH 4Cl, po rozpuštění v destilované vodě ve 100 ml odměrné bance doplníme do objemu 100 ml destilovanou vodou. Vzniklý zásobní roztok ještě zředíme 100x a z tohoto ředění připravíme sadu pracovních kalibračních roztoků (pracovní roztok musí být vždy připraven těsně před stanovením): do zkumavek pipetujeme 0, 1, 2, 3, 4 a 5 ml zásobního (již 100x ředěného) kalibračního roztoku, což odpovídá 0; 4,2; 8,4; 12,6; 16,8; 21,0 μg N doplníme do konečného objemu 5 ml destilovanou vodou. přidáme 200 μl Nesslerova činidla do každé zkumavky změříme extinkci při vlnové délce 410 nm proti destilované vodě (měříme po 10 minutách od přidání Nesslerova činidla). Stanovení kalibrační křivky z XY bodového grafu v Excelu (který porovnává dvojici hodnot) umožňuje pomocí lineární regrese vypočítat parametry lineární rovnice y = a + bx a korelační koeficient. V grafu je možnost zobrazit rovnici regrese a zobrazit hodnotu spolehlivosti R, která by měla být co nejbližší hodnotě 1. V opačném případě je nutné připravit nové kalibrační roztoky a postup zopakovat. Hodnota parametru b umožňuje stanovit přepočítávací faktor = 1/b. Násobením extinkce přepočítávacím faktorem (po odčítaní slepého pokusu a násobení faktorem ředění) vypočítáme obsah dusíku v reziduích krmiv po inkubaci v čase 24 hodin. Z hodnot obsahu dusíku vypočítáme procento dusíku z navážky vzorku. Reciproká hodnota vyjadřuje dusík stravitelný v tenkém střevě. Postup při in vitro enzymatické metodě s enzymy trypsin-chymotrypsin je stejný jako při použití enzymu pancreatin ale s rozdílnou aktivitou enzymů (trypsin 40 U.mg -1, chymotrypsin 350 U.mg -1 ). Statistické metody: Rozdíly mezi metodami mobile bag a in vitro byly vyhodnoceny analýzou variance a jednoduchou lineární regresí (Schéffeho metoda, PROC GLM) a korelační analýzou (PROC CORR) za použití statistického programu SAS Institute Inc. (2003). 10

VÝSLEDKY Experiment byl rozdělen na dvě etapy. V první etapě jsme porovnávali dvě in vitro metody enzymatického stanovení střevní stravitelnosti N-látek a to metodu využívající proteolytické enzymy trypsin-chymotrypsin a metodu s pancreatinem. Jako výchozí byla použita metoda autorů Antoniewicz et al.,1991 s pancreatinem, kterou jsme modifikovali pro použití enzymů trypsinchymotrypsin. Porovnání se uskutečnilo na souboru krmiv n=14. Jejich přehled a hodnoty střevní stravitelnosti nedegradovaných N-látek získaných oběma in vitro metodami jsou uvedeny v Tab.1. Vztah mezi hodnotami stanovenými mobile bag metodou a metodami in vitro (trypsin-chymotrypsin a pancreatin) byl vyjádřen rovnicemi lineární regrese (Tab. 2). Po porovnání hodnot korelačních koeficientů a směrodatných odchylek byla vybrána metoda využívající enzym pancreatin s vyšším korelačním koeficientem (r = 0,949) a nižší směrodatnou odchylkou (RSD = 5,347). Závislost stanovených hodnot mezi metodami in vitro a mobile bag byla u metody s enzymem trypsin-chymotrypsin slabší (r = 0,913, RSD = 10,624) ale statisticky významný rozdíl mezi oběma metodami nebyl prokázán. Tab. 1. Střevní stravitelnost dusíkatých látek nedegradovaných v bachoru získána dvěma in vitro enzymatickými metodami Krmivo Střevní stravitelnost NL (%) trypsin-chymotrypsin pancreatin Zelená píce jetel 71,16 79,19 Siláž skrojky řepy 50,57 58,71 kukuřice 10,34 50,00 Silážované drtě bob 41,54 70,88 ječmen 49,25 59,70 Zavadnutá siláž tráva 45,93 57,56 Seno vojtěška vojtěška 30,92 64,47 Sláma ječmen 47,08 61,11 Luskoviny hrách 94,39 96,14 Jadrná krmiva pšenice 78,04 87,45 ječmen 77,92 87,92 kukuřice 82,55 93,63 Extrahované šroty sója 92,82 96,45 Pokrutiny len 81,46 85,54 11

mobile bag (%) Predikce střevní stravitelnosti dusíkatých látek uniklých degradaci v bachoru in vitro metodou Tab. 2. Lineární regrese mezi hodnotami zjištěnými enzymatickými in vitro metodami a metodou mobile bag Enzym n a b r RSD trypsin-chymotrypsin 14 42,971 0,584 0,913 10,624 pancreatin 14 8,540 0,935 0.949 5,347 pancreatin - celý soubor 75 7,589 0,960 0,895 4,733 n - počet vzorků a, b parametry predikčních rovnic, r - korelační koeficient, RSD reziduální směrodatná odchylka Obr. I - II: Závislost hodnot střevní stravitelnosti N-látek nedegradovaných v bachoru získaných metodami mobile bag a enzymaticky s enzymem trypsin-chymotrypsin a pankreatin Obr. I Trypsin-chymotrypsin (n = 14) 100 90 80 70 60 50 40 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 in vitro (%) r = 0,913 y = 42,971 + 0,584x 12

mobile bag (%) Predikce střevní stravitelnosti dusíkatých látek uniklých degradaci v bachoru in vitro metodou Obr. II Pancreatin (n = 14) 100 90 80 70 60 50 40 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 in vitro (%) r = 0,949 y = 8,540 + 0,935x V druhé etapě jsme ověřovali metodu s pancreatinem v rozšířeném souboru krmiv (n = 75). Soubor obsahoval základní druhy krmiv. Jejich přehled je uveden v Tab. 3 a 4 včetně hodnot střevní stravitelnosti N-látek stanovených metodami mobile bag a in vitro. Všechny hodnoty v tabulkách 3 a 4 jsou uvedeny jako průměrné hodnoty se směrodatnou odchylkou. Pro upřesnění predikovaných hodnot střevní stravitelnosti byl soubor rozdělen do tří základních skupin, objemná krmiva, jadrná krmiva a extrahované šroty. Čtvrtou skupinu jsme vytvořili sloučením dvou skupin s nejnižším počtem testovaných vzorků krmiv, za účelem porovnání hodnot korelačních koeficientů (r) a směrodatných odchylek (RSD). Nejvyšší počet testovaných krmiv byl u skupiny objemných krmiv (n = 40). Skupina zahrnovala zelenou píci, siláž, silážované drtě, zavadnutou siláž, slámu a seno (Tab. 3). Objemná krmiva vykazují značnou variabilitu hodnot střevní stravitelnosti N-látek stanovených metodou in vitro. Pro skupinu objemných krmiv je korelační koeficient nejnižší ze sledovaných koeficientů (r = 0,768). Vzhledem k tomu, že hodnoty korelačních koeficientů nad 0,7 ještě svědčí o silné korelační závislosti, je korelační koeficient pro skupinu objemných krmiv vhodným měřítkem závislosti. Vytvořením skupin krmiv s podobnými vlastnostmi dusíkaté frakce se zvyšuje přesnost stanovení. U skupiny jadrných krmiv (n = 24), zahrnující základní zrniny, luskoviny a jeden vzorek pšeničních otrub má korelační koeficient a směrodatná odchylka příznivější hodnoty (r = 0,820, RSD = 3,385) než skupina objemných krmiv. U skupiny krmiv extrahovaných šrotů s pokrutiny byl 13

zjištěn vysoký stupeň korelační závislosti (r = 0,935, RSD = 2,998) mezi metodami mobile bag a in vitro. Skupina však obsahovala nejnižší počet sledovaných krmiv (n = 11). Proto byly vyhodnoceny dvě skupiny s nižším počtem krmiv (jadrná krmiva a extrahované šroty) jako jeden soubor. Rozšířený soubor vykazuje příznivou hodnotu korelačního koeficientu a směrodatné odchylky (Tab. 5). Grafické znázornění lineární závislosti mezi oběma metodami (mobile bag a in vitro) je uvedeno v grafech III až VII. Všechny vypočtené korelační koeficienty pro dané skupiny krmiv byly statisticky významné na hladině P<0,0001. Na základě dosažených výsledků lze konstatovat, že in vitro enzymatická metoda s pancreatinem je vhodná a použitelná pro stanovení střevní stravitelnosti N-látek uniklých degradaci v bachoru stejně jako metoda mobile bag. Neposkytuje však skutečné hodnoty zjištěné na zvířatech pomocí metody mobile bag. Proto odvození regresních rovnic a jejich použití k přepočtu hodnot stanovených in vitro metodou je důležitým předpokladem aplikace této metody. Výhodou in vitro enzymatické metody pro běžnou praxi je její snazší uplatnění, protože nejsou potřebná zvířata s duodenálními kanylami. 14

Skupina Objemná krmiva Zelená píce Siláž Silážované drtě Zavadnutá siláž Sláma Seno Krmivo vojtěška travní porost jetel+ jetelotráva luční porost+psárka+bojínek vojtěška, jetel kukuřice skrojky řepy luskovinoobilné travní ječná vojtěška n 11 5 3 5 7 1 1 3 1 1 2 Celkové N-látky % 20,39 ± 3,9 10,66 ± 1,0 17,78 ± 4,9 8,31 ± 1,4 17,85 ± 1,1 9,48 11,19 13,11 ± 2,5 14,31 4,70 18,56 ± 1,1 Reziduum N-látky % 13,99 ± 3,2 8,78 ± 1,0 16,56 ± 6,0 6,94 ± 1,3 14,63 ± 3,7 7,25 9,06 6,79 ± 3,9 10,75 4,50 16,13 ± 9,4 Střevní stravitelnost NL Mobile bag In vitro % % 80,99 ± 5,3 76,35 ± 5,1 78,27 ± 7,1 71,33 ± 7,2 82,49 ± 4,5 73,92 ± 5,2 74,82 ± 5,6 73,79 ± 2,6 74,31 ± 5,7 69,31 ± 3,8 48,25 50,00 69,69 58,71 60,18 ± 3,7 62,14 ± 7,8 55,43 57,56 61,54 61,11 77,26 ± 4,7 69,33 ± 6,9 Tab. 3. Přehled krmiv, obsah dusíkatých látek v původním krmivu a v reziduu po inkubaci v bachoru, porovnání hodnot střevní stravitelnosti dusíkatých látek nedegradovaných v bachoru stanovených metodami mobile bag a in vitro enzymaticky s pancreatinem u objemných krmiv 15

Skupina Jadrná krmiva, luskoviny (L) a otruby (O) Extrahované šroty a pokrutiny (P) Krmivo kukuřice žito ječmen oves pšenice hrách a bob (L) pšenice (O) bavlna sója řepka sezam len a podzemnice (P) n 7 3 4 3 4 2 1 2 3 2 2 2 Celkové N-látky % 11,07 ± 1,3 10,38 ± 0,7 12,92 ± 1,5 11,44 ± 0,6 13,52 ± 0,3 27,44 ± 6,4 17,13 47,94 ± 1,2 48,48 ± 2,5 36,75 ± 0,8 44,94 ± 0,9 44,29 ± 6,8 Reziduum N-látky % 12,69 ± 0,9 8,42 ± 1,6 16,86 ± 3,3 5,92 ± 2,2 15,34 ± 3,6 15,50 ± 5,2 7,63 45,16 ± 5,1 68,92 ± 4,6 41,19 ± 5,6 47,94 ± 4,1 37,56 ± 2,4 Střevní stravitelnost NL Mobile bag In vitro % % 93,57 ± 4,6 86,86 ± 3,1 88,92 ± 4,8 84,09 ± 0,6 92,64 ± 3,2 86,82 ± 1,4 76,95 ± 10,3 76,62 ± 6,9 93,28 ± 3,5 86,70 ± 6,3 89,15 ± 4,8 88,79 ± 10,4 70,92 75,33 94,91 ± 0,1 89,53 ± 0,8 97,84 ± 1,0 96,74 ± 0,4 77,44 ± 4,1 74,18 ± 3,1 97,31 ± 0,3 89,27 ± 1,1 89,79 ± 6,2 87,83 ± 3,2 Tab. 4. Přehled krmiv, obsah dusíkatých látek v původním krmivu a v reziduu po inkubaci v bachoru, porovnání hodnot střevní stravitelnosti dusíkatých látek nedegradovaných v bachoru, stanovených metodami mobile bag a in vitro enzymaticky u jadrných krmiv a extrahovaných šrotů 16

mobile bag (%) Predikce střevní stravitelnosti dusíkatých látek uniklých degradaci v bachoru in vitro metodou Tab. 5. Lineární regrese mezi hodnotami zjištěnými in vitro enzymatickou metodou s pancreatinem a metodou mobile bag Skupina krmiv n a b r RSD Objemná krmiva 40 12,946 0,883 0,768 * 5,004 Jadrná krmiva s L a O 24-8,051 1,143 0,820 * 3,385 Extrahované šroty s P 11 7,750 0,954 0,935 * 2,998 Jadrná krmiva s L a O a extrahované šroty s P 35 0,642 1,042 0,855 * 3,495 n - počet vzorků, a, b parametry predikčních rovnic, r - korelační koeficient, RSD reziduální směrodatná odchylka, L luskoviny, O otruby, P - pokrutiny * P < 0.0001 Obr. III - VII: Závislost hodnot střevní stravitelnosti N-látek nedegradovaných v bachoru získaných metodami mobile bag a in vitro enzymaticky ve skupinách krmiv Obr. III Objemná krmiva (n = 40) 100 90 80 70 60 50 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 in vitro (%) r = 0,768 y = 12,946 + 0,883x 17

mobile bag (%) mobile bag (%) Predikce střevní stravitelnosti dusíkatých látek uniklých degradaci v bachoru in vitro metodou Obr. IV Jadrná krmiva (n = 24) 100 95 90 85 80 75 70 65 70 75 80 85 90 95 100 in vitro (%) r = 0,820 y = -8,051 + 1,143x Obr. V Extrahované šroty (n = 11) 100 95 90 85 80 75 70 70 75 80 85 90 95 100 in vitro (%) r = 0,935 y = 7,750 + 0,954x 18

mobile bag (%) mobile bag (%) Predikce střevní stravitelnosti dusíkatých látek uniklých degradaci v bachoru in vitro metodou Obr. VI Jadrná krmiva a extrahované šroty (n = 35) 100 95 90 85 80 75 70 65 70 75 80 85 90 95 100 in vitro (%) r = 0,855 y = 0,642 + 1,042x Obr. VII Celý soubor (n = 75) 100 90 80 70 60 50 40 40 50 60 70 80 90 100 in vitro (%) r = 0,895 y = 7,589 + 0,960x 19

ZÁVĚR In vitro enzymatické stanovení stravitelnosti N-látek nedegradovaných v bachoru přežvýkavců je závislé na výběru vhodné proteázy. Přesnost stanovení je zajištěna vytvořením skupin krmiv s podobnými vlastnostmi dusíkaté frakce. Metody in vitro neposkytují skutečné hodnoty zjištěné na zvířatech pomocí metody mobile bag. Proto odvození regresních rovnic závislostí hodnot stanovených metodou mobile bag na hodnotách získaných in vitro enzymaticky u souboru krmiv je důležitým předpokladem aplikace této metody. Pro jednotlivé skupiny krmiv byly vypočteny predikční rovnice: objemná krmiva: y = 12,946 + 0,883x jadrná krmiva, luskoviny (L) a otruby (O): y = - 8,051 + 1,143x extrahované šroty s pokrutiny (P): y = 7,750 + 0,954x jadrná krmiva s L a O a extrahované šroty s P: y = 0,642 + 1,042x celý soubor krmiv: y = 7,589 + 0,960x Na základě našich výsledků s hodnotami korelačních koeficientů a parametrů regresních rovnic doporučujeme enzymatickou in vitro metodu střevní stravitelnosti N-látek s pankreatinem a predikční rovnice pro dané skupiny krmiv k testování krmiv pro přežvýkavce. III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ Nezbytným předpokladem pro praktické využití in vitro metod je jejich korelace s metodami stanovenými na zvířatech. Stejně jako jiné alternativní metody ani in vitro metoda střevní stravitelnosti dusíkatých látek krmiv nedegradovaných v bachoru neposkytuje skutečné hodnoty zjištěné na zvířatech. Proto odvození predikčních rovnic závislosti hodnot, stanovených na zvířatech metodou mobile bag a in vitro enzymaticky, je důležitým předpokladem aplikace této metody k predikci stravitelnosti dusíkatých látek nedegradovaných v bachoru méně nákladným a jednodušším způsobem. IV. POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY Na základě našich výsledků doporučujeme metodu s odvozenými predikčními rovnicemi jako vhodnou pro stanovení střevní stravitelnosti dusíkatých látek krmiv u přežvýkavců. Jednoduché a rychlé stanovení v laboratorních podmínkách způsobem in vitro se stává v praxi nezbytným při posuzování nutriční hodnoty a kvality krmiv a najde uplatnění v laboratořích zemědělské praxe. 20

V. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY [AOAC] 2005. Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis. 15 th Edition, Washington, DC Antoniewicz A.M., Van Vuuren A. M., Van der Koelen C. J., 1991. Comparison between the mobile bag technique and an enzymatic in vitro method to measure post-ruminal digestibility of undegraded protein. In: 6-th Int. Symp. Protein Metabolism and Nutrition. Herning Denmark 9-14 june. Antoniewicz A.M., Van Vuuren A.M., Van der Koelen C. J. and Kosmala J., 1992. Intestinal digestibility of rumen undegraded protein of formaldehydetreated feedstuffs measured by mobile bag and in vitro technique. Anim. Feed Sci. and Technol., 39, 1992, 111-124. Bateman H. G., II, Clark J. H., Patton R. A., Peel J. C., and Schwab C. G., 2001. Accuracy and precision of computer models to predict passage of crude protein and amino acids to the duodenum of lactating cows. J. Dairy Sci., 94, 649-664. Baudet H. M., 1995. Nouvelles tables INRA. Alimentation, 228, 119-121 Berthiaume R., Lapierre H.,Stevenson M., Coté N., and McBride B. W. 2000. Comparison of the in situ and in vivo intestinal disappearance of ruminally protected methionine. J. Dairy Sci., 83, 2049--2056. Borucki Castro S. I., Phillip L. E., Lapierre H., Jardon P. W., and Berthiaume R., 2007. Ruminal degradability and intestinal digestibility of protein and amino acid in treated soybean meal product. J. Dairy Sci., 90, 810-822. Calsamiglia S., Stern M. D., 1995. A three-step in vitro procedure for estimating intestinal digestion of protein in ruminants. J. Anim. Sci., 73, 1459-1465. Frydrych Z., 1992. Intestinal digestibility of rumen undegraded protein of various feeds as estimated by the nylon bag technique. Anim. Feed Sci. and Technol., 37, 161-172. Homolka P., Harazim J., Třináctý J., 2007. Nitrogen degradability and intestinal digestibility of rumen undegraded protein in rapeseed, rapeseed meal and extracted rapeseed meal. Czech J. Anim. Sci., 52 (11), 378-386 Homolka P., Koukolová V., Němec Z., Mudřík Z., Hučko B., Sales J., 2008. Amino acid contents and intestinal digestibility of lucerne in ruminants as influenced by growth stage. Czech J. Anim. Sci., 53 (12), 499-505 INRA, 1989. Ruminant nutrition. Recommended allowances and feed tables. R. Jarrige, ed. Libbey Eurotex, Paris. Kononoff P., J., Ivan S. K., and Klopfenstein T. J., 2007. Estimation of the proportion of feed protein digested in the small intestine of cattle consuming wet corn gluten feed. J. Dairy Sci., 90, 2377-2385. Russell J. B., O Connor J. D., Fox D. G., Van Soest P. J., Sniffen C. J., 1992. A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets. I. Ruminant fermentation. J. Anim. Sci., 70, 3551-3561. 21

[SAS] Statistical Analysis Systems Inc. 2003. SAS; Statistic s Version 9.1 Edition. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA. Schwab C. G., Tylutky T. P., Ordway R. S., Sheaffer C., and Stern M. D., 2003 Characterization of proteins in feeds. J. Dairy Sci., 86, (E. Suppl.): E88-E103. Sniffen C. J., O Connor J. D., Van Soest P. J., Fox D. G., Russel J. B., 1992. A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets: II. Carbohydrate and protein availability. J. Anim. Sci., 70, 3562-3577. Stern, M.D., Bach, A., Calsamiglia, S., 1997. Alternative techniques for measuring nutrient digestion in ruminants. J. Anim. Sci., 75, 2256-2276. Tománková O., Homolka P., 2002. Intestinal digestibility of crude protein in concentrates determined by a combined enzymatic method. Czech J. Anim. Sci., 47 (1), 15-20 Třináctý J., Richter M., Homolka P., Rabišková M., Doležal P., 2005. Comparison of apparent and true digestibility of nutrients determined in dairy cows either by the nylon capsule or in vivo method. Czech J. Anim. Sci., 50 (9), 402-410 Van der Poel A.F.B., Prestlokken E., and Goelema J. O., 2005. Feed processing: Effect on nutrient degradation and digestibility. Pages 627-661 In Quantitative Aspect of Ruminant Digestion and Metabolism 2 nd ed. J. Dijkstra, J. M. Forbes, and J. France, ed. CABI Publishing, New York, NY Van Straalen W. M., Dopper F. M. H., Antoniewich A. M., Van Vuuren A.M., 1993. Intestinal digestibility in dairy cows of protein from grass and clover measured with mobile nylon bag and other method. J Dairy Sci. 76, 2970-2981 Vencl B. 1992. Vliv obsahu dusíku v acido-detergentní vláknině krmiv na stravitelnost dusíkatých látek pro přežvýkavce. Živočišná výroba, 2 (37), 117-124 Vérité R., Michalet - Doreau B., Chapoutot P., Peyrand J.L., Poncet C., 1987. Revision du systéme des protéines digestibles dans l Intestin (PDI). Bull. Tech. C.R.Z.V. Theix, INRA., 70, 19-34. Woods V. B., Moloney A. P., Calsamiglia S. and O'Mara F. P., 2003. The nutritive value of concentrate feedstuffs for ruminant animals Part III. Small intestinal digestibility as measured by in vitro or mobile bag techniques. Anim. Feed Sci. Technol. 110, 145-157. VI. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE Tománková O., Homolka P., 1996. Použití enzymatických metod při stanovení jednotek PDI. In: Hodnocení proteinové kvality krmiv pro přežvýkavce. Seminář Opava, 51-53. Tománková O., Komprda T., Homolka P., 1996. Stanovení degradovatelnosti dusíkatých látek krmiv. In: Hodnocení dusíkatých látek krmiv pro přežvýkavce podle systému PDI. Studijní informace ÚZPI, řada Živočišná výroba, 16-21. 22

Kopečný J., Tománková O., Homolka P., 1998. Comparison of protein digestibility of rumen undegraded protein estimated by an enzymatic and mobile bag method: feeds for ruminants and anaerobic fungus. Anim. Feed Sci. Technol. 71, 109-116 Tománková O., Homolka P.,1999. Prediction of intestinal digestibility of protein undegradable in rumen by a combined enzymatic method. Czech J. Anim. Sci., 44, 323-328. Tománková O., Homolka P., Škeříková A., Břenek Z., 2001. Intestinal digestibility of rumen undegraded protein by a combined enzymatic method. The Annual Meeting of the E.A.A.P., Budapest, Hungary, 105. Homolka P., Tománková O., Břenek T.,2002. Prediction of crude protein degradability and intestinal of rumen undegraded protein of protein supplements in cattle. Czech J. Anim. Sci., 47, (3): 119-123. Tománková O., Homolka P., 2002. Intestinal digestibility of crude protein in concentrates determined by a combined enzymatic method. Czech J. Anim. Sci., 47, (1): 15-20 Homolka P., Tománková O.,2007. Prediction of nutrition value of soybean meal and fodder yeast in cattle. In: Výživa dojnic a kvalita mléka (ekologické, zdravotní a hygienické faktory kvality a bezpečnosti mléka jako suroviny a potraviny). Sborník příspěvku z mezinárodního semináře. Pohořelice, 74-76. 23

Vydal: Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i. Přátelství 815, 104 00 Praha Uhříněves Název: Predikce střevní stravitelnosti dusíkatých látek uniklých degradaci v bachoru in vitro metodou Autoři: Ing. Olga Tománková, Ing. Petr Homolka, Ph.D. Oddělení výživy a krmení hospodářských zvířat Oponenti: ISBN 978-80-7403-036-9 Doc. Ing. Bohuslav Čermák, CSc. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 370 05 České Budějovice Ing. Juraj Saksún Ministerstvo zemědělství ČR odbor živočišných komodit, 117 05 Praha 1 Vydáno bez jazykové úpravy. Metodika vznikla jako součást řešení výzkumného záměru MZe ČR MZE 0002701404. Výzkumný ústav živočišné výroby,v.v.i., Praha Uhříněves